Meta-Analysen identifizieren DNA-Methylierung im Zusammenhang mit Nierenfunktion und -schädigung

edmund.chen@wecistanche.com

ChronischNierenerkrankungist eine große Belastung für die öffentliche Gesundheit. Das erhöhte Albumin-Kreatinin-Verhältnis im Urin ist ein Maß dafürNierenschäden,und verwendet, um chronisch zu diagnostizieren und zu inszenierenNierenerkrankung. Erweiterung des Wissens über regulatorische Mechanismen im Zusammenhang mitNierenfunktionund Krankheit führten wir eine blutbasierte epigenomweite Assoziationsstudie für die geschätzte glomeruläre Filtrationsrate (n=33,605) und das Albumin-zu-Kreatinin-Verhältnis im Urin (n=15,068) durch und entdeckten 69 und sieben CpG-Stellen, an denen DNA-Methylierung mit dem jeweiligen Merkmal assoziiert war. Die Mehrzahl dieser Befunde zeigte richtungskonsistente Assoziationen mit den jeweiligen klinischen Outcomes von chronischNierenerkrankungund mäßig erhöhte Albuminurie. Assoziationen der DNA-Methylierung mitNierenfunktion, wie CpGs bei JAZF1, PELI1 und CHD2, wurden in validiertNierengewebe. Methylierung bei PHRF1, LDB2, CSRNP1 und IRF5 deutete auf kausale Wirkungen hinNierenfunktion. Anreicherungsanalysen zeigten Wege im Zusammenhang mit Hämostase und Blutzellmigration für die geschätzte glomeruläre Filtrationsrate sowie die Aktivierung und Reaktion von Immunzellen auf mit dem Albumin-zu-Kreatinin-Verhältnis im Urin assoziierte CpGs.

Schlüsselwörter:Nierenerkrankung; Nierenschäden; Nierenfunktion; Nierengewebe; Nierenstruktur

chronischNierenerkrankung(CKD) ist eine große Belastung für die öffentliche Gesundheit. Sie betrifft mehr als 10 Prozent der Erwachsenen weltweit und mehr als 40 Prozent der Personen ab 70 Jahren1,2. CKD ist weltweit eine der häufigsten Todesursachen3 und trägt wesentlich zur kardiovaskulären Morbidität und Mortalität bei2,4,5. CKD ist definiert als das anhaltende Vorhandensein von Anomalien vonNiereStruktur oder Funktion. DasNierenfunktionDie am häufigsten verwendeten Maßnahmen sind die glomeruläre Filtrationsrate, die normalerweise anhand der Serumkreatininkonzentrationen (eGFR) geschätzt wird, und das Urin-Albumin-zu-Kreatinin-Verhältnis (UACR)6. Erhöhte UACR ist ein Maß fürNierenschäden, wird verwendet, um CKD7 zu diagnostizieren und einzustufen, und wird mit Diabetes und Bluthochdruck in Verbindung gebrachtNierenerkrankung8. Auch eine mäßig erhöhte UACR ist unabhängig von anderen ein Risikofaktor für Herz-Kreislauf-ErkrankungenNierenfunktion markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 genetische Loci, die mit assoziiert sindNierenfunktion10,12,13. Die Indexvarianten an bekannten eGFR-assoziierten Loci erklären geschätzte 8,9 Prozent der eGFR-Varianz12.Eine aktuelle GWAS-Metaanalyse von eGFR-integrierten offenen Chromatinregionen mit kleinen Sätzen von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs)10. Die Ergebnisse dieser Studie unterstützen die Bedeutung einer veränderten Transkriptionsregulation als einen Mechanismus, der zu CKD beiträgt. Um die DNA-Methylierung zu untersuchen, in Bezug aufNierenfunktionwurden epigenomweite Assoziationsstudien (EWAS) von eGFR und CKD durchgeführt. Als Schlüsselregulator der Transkription, der kosteneffizient und mit hohem Durchsatz bewertet werden kann, wurde die DNA-Methylierung an CpG-Stellen (CpGs) mit Einzelbasenauflösung untersucht. Wir haben zuvor eine EWAS mit 4859 Erwachsenen aus zwei populationsbasierten Studien durchgeführt und 18 validierte, unterschiedlich methylierte Stellen im Vollblut identifiziert, die mit eGFR14 assoziiert sind. Obwohl diese Studie Einblicke in genregulatorische Mechanismen von offenbarteNiereFunktion erklärten die zugehörigen CpGs nur 1,2 Prozent der eGFR-Varianz. Andere frühere Studien konzentrierten sich auf CKD-Patienten und/oder Patienten mit Diabetes oder Patienten mit einer Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus oder waren durch eine kleine Stichprobengröße, fehlende Replikation, fehlende Anpassung für potenzielle Confounder oder eine Kombination davon eingeschränkt14–19. Andere Studien konzentrierten sich auf DNA-Methylierungsmuster von DiabetikernNierenerkrankung(DKD)-Patienten20–22.

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENERKRANKUNGEN VERBESSERN

Hier haben wir eine EWAS durchgeführtNierenfunktionMerkmale, um zusätzliche CpGs im Zusammenhang mit Genregulationsmechanismen von potenzieller Bedeutung für CKD zu identifizieren. Wir haben den früheren EWAS für eGFR und CKD erweitert, indem wir die Stichprobengröße erheblich auf 33.605 Personen erhöht haben. Darüber hinaus haben wir UACR und mäßig erhöhte Albuminurie (Mikroalbuminurie) als zusätzliche Merkmale aufgenommen. Die EWAS wurden in überwiegend bevölkerungsbezogenen Studien durchgeführt, die nach Geschlecht, Alter, Diabetes, Bluthochdruck, Body-Mass-Index (BMI), Raucherstatus und den am häufigsten vorkommenden Anteilen weißer Blutkörperchen angepasst wurden. Wir replizierten unsere EWAS-Ergebnisse in separaten Proben, setzten die CpG-Stellen mit Genexpressionsniveaus in verschiedenen Geweben in Beziehung, wandten die Ergebnisse auf klinische Ergebnisse an und bewerteten die Kausalität zwischen DNA-Methylierung undNierenfunktion(Ergänzende Abb. 1).

Ergebnisse

Studieren Sie die Eigenschaften der Probe. In dieser Untersuchung trugen 36 Studien mit insgesamt 33.605 Teilnehmern zum EWAS der eGFR und 15.068 zum EWAS der UACR bei. Ihre gepoolten Merkmale sind in Tabelle 1 dargestellt, und die einzelnen Studienbeschreibungen sind in den ergänzenden Daten 1 und 2 enthalten.

EWAS von eGFR und UACR.Wir untersuchten die Assoziation vonNiereMerkmale mit DNA-Methylierung im Blut bei bis zu 441.870 CpGs, die Überlappung von CpGs, die vom Illumina MethylationnEPIC BeadChip und dem Illumina HumanMethylation450 BeadChip-Array abgedeckt wurden, die von allen bis auf eine Studie zur Messung verwendet wurden (Ergänzungsdaten 3). Alle Studien führten eine Array-Datenbereinigung durch und wandten zentral entwickelte Skripte für die Vorbereitung der anNiereMerkmalswerte, die anschließend mit der DNA-Methylierung unter Verwendung von Kovariaten-angepassten linearen Regressionsmodellen mit Methylierung -Werten als abhängige Variable nach vordefinierten Studienprotokollen in Beziehung gesetzt wurden (siehe Methoden). Wir beobachteten keine oder nur geringe Inflation in studienspezifischen EWAS (eGFR-Mittelinflation=1.00, UACR-Mittelinflation=1.00, Zusatzdaten 1 und 2). In einem multivariabel angepassten transethnischen EWAS waren 69 CpGs signifikant mit eGFR assoziiert und repliziert (Abb. 1A, Ergänzende Daten 4, siehe Methoden), einschließlich der zuvor berichteten14. Die replizierten Stellen zeigten ein klares Muster niedrigerer Methylierung (60 CpGs, Pbinom=2.2E-10; Abb. 1A).

Abb. 1 EWAS-Ergebnisse von eGFR und UACR. Chicago-Plots der Ergebnisse der epigenomweiten Assoziationsstudie (EWAS) für die geschätzte glomeruläre Filtrationsrate (eGFR) (A) und das Albumin-zu-Kreatinin-Verhältnis im Urin (UACR) (B) unter Verwendung der kombinierten Entdeckungs- und Replikationsprobe. Die Stellen sind nach ihrer chromosomalen Position auf der x-Achse geordnet, wobei ihr –log10 P-Wert des Assoziations-Wald-Tests auf der y-Achse angegeben ist. CpGs, die positiv mit dem Merkmal korrelieren, sind im oberen Teil aufgetragen, Standorte mit negativer Korrelation im unteren Teil. Die gepunkteten horizontalen Linien stellen das Signifikanzniveau dar (p-Wert < 1,1e-7).="" neuartige="" replikationsstellen="" sind="" orange="" gefärbt,="" bekannte="" replizierte="" stellen="" sind="" türkis="" gefärbt="" und="" stellen,="" die="" zusätzlich="" mit="" dem="" jeweiligen="" binären="" merkmal="">Nierenerkrankung[CKD]/ Mikroalbuminurie [MA]) sind mit einem Kreuz markiert.

In der Metaanalyse wurden die niedrigsten P-Werte für bekannte eGFR-Assoziationen beobachtet, einschließlich cg17944885 (ZNF788,=–1,75E–04, P-Wert=8,7E–41), cg23597162 (JAZF1 ,=−1,48E−04, P-Wert=3,2E−24) und cg06158227 (ZSCAN29,=−1,08E−04, P-Wert=8 .7E−20)14, gefolgt von einem neuen Befund bei cg20777437 (CDCP2,=−8.28E−05, P-Wert=1.1E−17). Die 69 replizierten eGFR-assoziierten CpGs allein erklärten 15,7 Prozent der eGFR-Variation in einer separaten Studienstichprobe von 1888 Teilnehmern (siehe Methoden). Wenn alle Kovariaten (Geschlecht, Alter, Diabetes, Bluthochdruck, BMI, Rauchen und Anteile weißer Blutkörperchen) zum Assoziationsmodell hinzugefügt wurden, stieg der Gesamtanteil der erklärten Varianz der eGFR auf 36,3 Prozent, wobei 2,4 Prozent der Variation den 69 CpGs zugeschrieben wurden unabhängig von den anderen Kovariaten.

In der transethnischen Analyse von UACR waren sieben CpGs signifikant assoziiert und repliziert (Abb. 1B, Zusatzdaten 5, siehe Methoden). Von den Ergebnissen cg18181703 (SOCS3,=–2,58E−03, P-Wert=2,6E−13) und cg02711608 (SLC1A5,=–1,63 E−03, P-Wert=9.9E−13) hatte die kleinsten Metaanalyse-Assoziations-P-Werte. Bei sechs der sieben CpGs war eine niedrigere Methylierung mit einer höheren UACR verbunden. Aufgrund der Anzahl der replizierten Stellen war die Aussagekraft des Binomialtests begrenzt (6 CpGs, pbinom=0.13; Abb. 1B). Die replizierten CpGs erklärten 3,9 Prozent und das vollständige Modell 14,6 Prozent der Variation der UACR-Werte, wobei 0,07 Prozent den CpGs unabhängig von den anderen Kovariaten zugeschrieben wurden.

Es gab eine geringe Überlappung zwischen den replizierten EWAS- und zuvor gemeldeten GWAS-Loci sowohl für eGFR (Überlappung=10 von 69; ergänzende Daten 4) als auch für UACR (Überlappung=1 von 7; ergänzende Daten 5). Es gab keine Überlappung von replizierten CpGs zwischen eGFR und UACR, was auf merkmalsspezifische DNA-Methylierungsprofile im Blut hinweist. Selbst unter den 967 und 270 naheliegenden Assoziationen (P-Wert < 1e−05)="" einer="" kombinierten="" entdeckungs-="" und="" replikationsproben-metaanalyse="" für="" egfr="" bzw.="" uacr="" überlappten="" nur="" 10="" stellen="" zwischen="" beiden="" merkmalen.="" die="" detaillierten="" ergebnisse="" dieser="" metaanalysen="" für="" alle="" suggestiven="" assoziationen="" sind="" in="" den="" ergänzenden="" daten="" 6="" (egfr)="" und="" 7="" (uacr)="">Abstammungsheterogenität und Robustheit der Ergebnisse. Um zu beurteilen, ob die Assoziationsergebnisse zu eGFR und UACR von einer bestimmten Abstammung bestimmt werden könnten, führten wir eine nach Vorfahren stratifizierte EWAS-Metaanalyse von Proben europäischer Abstammung (EA) und afroamerikanischer Abstammung (AA) mit Ergebnissen aus mehreren Studien durch, die zu diesen beiden beitrugen Ethnien. Vergleich der Assoziationsergebnisse der replizierten CpGs in Proben von EA (Negar=23,671; nUACR=9806) mit den AA-Proben (neGFR =

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05) in oder innerhalb von 50 bp der 69 replizierten CpGs wurde bewertet, um zu bewerten, ob das Vorhandensein von SNPs die Sondenbindung beeinflussen könnte. Vier Sonden wurden in der Nähe eines gemeinsamen SNP lokalisiert (Supplementary Data 4; cg10960375-rs113564504; cg11544657-rs2083577; cg01817897-rs142643977; cg06930757-rs112223111), was jedoch waren gemäß der PhenoScanner V2-Ressource (abgerufen am 12.02.2021, pGWAS < 5e−8,="" einschließlich="" proxy-snps="" mit="" eur="" r²=""> 0,8)23 mit keinem GWAS-Merkmal assoziiert. Dies weist darauf hin, dass die EWAS-Ergebnisse wahrscheinlich nicht durch ein gemeinsames Merkmal verfälscht werden, von dem bekannt ist, dass es damit zusammenhängtNierenfunktiondurch nahe gelegene DNA-Sequenzvariation. Sondeninterne SNPs, die mehr als fünf Basen vom 3'-Ende der Sonde entfernt waren, erwiesen sich im Allgemeinen als vernachlässigbar24.

Beziehung zu CKD und Mikroalbuminurie.Von den 69 mit eGFR assoziierten CpGs waren 53 in einer Metaanalyse von 25,609 Personen, darunter 2376 Fälle mit einer konsistenten Wirkungsrichtung (P-Wert < 0).="" 05/69;="" ergänzende="" daten="" 4,="" ergänzende="" abb.="" 3a).="" die="" korrelation="" zwischen="" egfr-="" und="" ckd-effekten="" war="" hoch="" (r="–0,93;" abb.="" 3a).="" in="" einer="" unabhängigen="" kohorte="" von="" 551="" ckd-patienten="" stimmten="" 65="" cpgs="" richtungsmäßig="" mit="" der="" egfr-metaanalyse="" überein="" und="" fünf="" replizierten="" sich="" (p-wert="">< 0,05/69,="" r="0,77;" ergänzende="" abb.="" 4,="" ergänzende="" daten="" 4,="" siehe="" methoden).="" in="" derselben="" kohorte="" waren="" die="" egfr-assoziierten="" cpgs="" cg18194850="" (p-wert="1.6E-5)" und="" cg07242931="" (p-wert="2.3E-5)" ebenfalls="" mit="" der="" zeit="" bis="">Nierenversagenoder akutNierenverletzung(Ergänzende Daten 8, siehe Methoden). Alle sieben mit UACR assoziierten CpGs waren auch signifikant mit Mikroalbuminurie in einer Stichprobe von 7279 Personen assoziiert, darunter 1186 Fälle mit der gleichen Wirkungsrichtung wie bei UACR (P-Wert < 0,05/7,="" r="" {{7}="" }.98,="" abb.="" 3b,="" ergänzende="" daten="" 5,="" ergänzende="" abb.="">

Korrelation mit der Genexpression. Um Einblicke in mögliche Funktionsmechanismen der eGFR- und UACR-assoziierten CpGs zu erhalten, haben wir die Korrelation ihrer DNA-Methylierungsniveaus mit mRNA-Niveaus von cis-kodierten Genen im Vollblut sowie in Blutmonozyten getestet (siehe Methoden, Ergänzende Daten 9 ). Das bekannte eGFR-assoziierte cg17944885 auf Chromosom 19 in der Nähe von ZNF788 war mit dem Transkript assoziiert, das durch das 240 kb entfernte Zinkfingerprotein 439 (ZNF439, Tabelle 2) kodiert wurde. Darüber hinaus war die Methylierung von cg04864179 am Interferon-Regulationsfaktor 5 (IRF5) mit beiden von IRF5 kodierten mRNA-Transkripten und dem nahe gelegenen Transportin 3 (TNPO3) assoziiert (ergänzende Abb. 5A). Von den UACR-Assoziationen zeigten die zwei replizierten CpGs cg02711608 und cg22304262 bei Mitglied 5 der gelösten Trägerfamilie 1 (SLC1A5) signifikante Assoziationen mit SLC1A5-mRNA-Spiegeln und cg23570810 beim Interferon-induzierten Transmembranprotein 1 (IFITM1) mit seinen Transkripten in cis (Tabelle 2). Alle Ergebnisse der Genexpressionsanalyse sind in Supplementary Data 9 enthalten.

Wirkungen im Nierengewebe.Um zu beurteilen, ob sich die beobachteten Methylierungseffekte im Blut übertragen lassenNierengewebe,Wir haben ein Regressionsmodell angewendet, um die Assoziationen der replizierten CpGs auf signifikante (falsche Entdeckungsrate (FDR) < 0,05) und richtungskonsistente Assoziation mit eGFR und zu testenNiereFibrose jeweils in 506 mikrodisseziertNierengewebeProben. Bei diesen ProbenNiere-gewebebasierte DNA-Methylierung von replizierten eGFR-assoziierten CpGs cg23597162 bei JAZF1, cg26099045 in der Nähe von PELI1 und cg12644285 bei CHD2 waren signifikant mit eGFR mit der gleichen Wirkungsrichtung wie im Blut assoziiert (ergänzende Abb. 6A, Tabelle 2, ergänzende Daten 10) . Darüber hinaus das gleiche CpG bei PELI1 und sechs weitere

Stellen (cg20146909 bei LRRC8D, cg25767870 in der Nähe von FAM46C, cg16618493 bei ZBTB7B, cg10632966 in der Nähe von RPEL1, cg01068906 bei NOD2 und cg03297731 bei GDPD3) wurden mit Fibrose in den assoziiertNiereGewebeproben mit konsistenten (dh umgekehrten) Wirkungsrichtungen (Ergänzende Abb. 6B, Tabelle 2). Von den replizierten UACR-Stellen sind die DNA-Methylierungsstufen inNiereGewebe von cg00008629 bei PTBP3 und cg24859433 in der Nähe von IER3 waren mit Fibrose assoziiert und zeigten die gleiche Wirkungsrichtung (ergänzende Fig. 6D, Tabelle 2). In Übereinstimmung mit den EWAS-Ergebnissen wurde keine signifikante Assoziation der UACRa-assoziierten CpGs mit eGFR bei den Nierenprobenspendern gefunden (ergänzende Fig. 6C, ergänzende Daten 10).

Kausale Effekte zwischen DNA-Methylierung undNierenfunktionZüge. Um zu beurteilen, ob dieNierenfunktionMerkmale die DNA-Methylierung kausal beeinflussen oder umgekehrt, führten wir eine bidirektionale Mendelsche Randomisierungsanalyse (MR) mit zwei Stichproben der signifikant assoziierten CpGs durch. Die Vorwärtsrichtungs-MR-Analyse legte nahe, dass die CpGs cg02304370 (PHRF1), cg04460609 (LDB2), cg00501876 (CSRNP1) und cg04864179 (IRF5) beeinflussen ursächlich die eGFR-Spiegel (Tabelle 3). Die Heritabilitätsschätzungen dieser vier CpGs variierten zwischen den drei Datensätzen von Populationen europäischer Abstammung, waren aber durchweg höher als die mittlere Heritabilität aller CpGs, die in jeder der drei Studien bewertet wurden: 0,34 (kausale eGFR-CpGs) vs. 0,16 (HM450K-Array) basierend auf Hannon et al.25, 0,55 vs. 0,19 für Dongen et al.26 und 0,51 vs. 0,19 für McRae et al.27. Für UACR-assoziierte CpGs wurden keine signifikanten kausalen Zusammenhänge identifiziert. Für die umgekehrte MR war die einzige signifikante Wirkung die von eGFR auf cg23597162 (JAZF1), wenn die primäre Inverse-Varianz-Methode verwendet wurde. In den multiplen reversen MR-Sensitivitätsanalysen wurden jedoch keine signifikanten Wirkungen identifiziert/beobachtet. Leave-one-out-Analysen ergaben keinen Hinweis darauf, dass die MR-Ergebnisse von einem einzelnen SNP gesteuert werden könnten. Darüber hinaus schließt der Ausschluss von SNPs, die mit Typ-2-Diabetes mellitus assoziiert waren, einen Hauptrisikofaktor fürNierenerkrankungkam zu keinem anderen Befund. Die Ergebnisse für alle primären und Sensitivitäts-MR-Analysen sind in den ergänzenden Daten 11 und 12 und der ergänzenden Abb. 7 dargestellt. Die Sensitivitätsanalysen unterstützen die primären Ergebnisse der signifikanten Vorwärts-MR-Ergebnisse (FDR < 0,05,="" siehe="" methoden)="" mit="" richtungskonsistente="" effektschätzungen,="" die="" auf="" potenziell="" kausale="" zusammenhänge="" zwischen="" dna-methylierung="" und="" egfr="" hindeuten,="" aber="" nicht="">

Transkriptionsfaktor-Bindungs-, Histonmarkierungs- und Signalweg-Anreicherungsanalysen. Wir führten Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen-, Histonmarkierungs- und Pathway-Anreicherungsanalysen basierend auf den 967 CpGs durch, die eine suggestive Assoziation mit eGFR (P-Wert < 1e-05;="" ergänzende="" daten="" 6)="" zeigten,="" und="" den="" 270="" cpgs,="" die="" eine="" suggestive="" assoziation="" mit="" uacr="" zeigten="" (p-wert="">< 1e-5;="" ergänzende="" daten="" 7)="" in="" der="" meta-analyse,="" um="" die="" statistische="" aussagekraft="" von="" anreicherungsanalysen="" zu="" maximieren="" (siehe="" methoden)="" 14="" zuerst="" bewerteten="" wir,="" ob="" egfr-assoziierte="" cpgs="" bevorzugt="" auf="" bindungsstellen="" von="" 169="" transkriptionsfaktoren="" (tfs)="" basierend="" auf="" chromatin="" abgebildet="" wurden="" immunpräzipitations-dna-sequenzierungsdaten="" (chip-seq)="" aus="" dem="" encode-projekt,="" die="" durch="" konsensaufrufe="" über="" 91="" menschliche="" zelltypen="" (161="" tf-spuren)="" aggregiert="" und="" um="" acht="" ergänzt="">Nieregewebebasierte Tracks (siehe Methoden). Nach mehrfacher Testkorrektur für 169 TFs zeigten acht TFs eine signifikante Anreicherung für eGFR-assoziierte CpGs (FDR < 0.05;="" abb.="" 4a,="" zusatzdaten="" 13),="" einschließlich="" cebpb="" (p-wert="1." 75e-06,="" gewebeübergreifende="" spur)="" und="" ep300="" (p-wert="7.49E-09," gewebeübergreifende="" spur).="" dies="" stimmt="" mit="" dem="" befund="" von="" chu="" et="" al.14="" in="" einer="" kleineren="" untergruppe="" von="" 4859="" teilnehmern="" der="" hier="" analysierten="" 33.605="" teilnehmer="" überein.="" uacr-assoziierte="" cpgs="" wurden="" in="" bindungsstellen="" von="" 56="" tfs="" angereichert="" (abb.="" 4b,="" ergänzende="" daten="" 14)="" mit="" der="" stärksten="" assoziation="" für="" polr2a="" (p-wert="6.93E-19)," fos="" (p-wert="" {{32="" }}.28e−12)="" und="" ep300="" (p-wert="">

Niere-Funktions-assoziierte CpGs waren für mehrere Histonmarkierungen weitgehend angereichert, wobei 82 von 195 Histonmarkierungs-Zelltypkombinationen signifikant (FDR q < 0.05)="" für="" egfr="" (abb.="" 4c,="" zusatzdaten="" 15)="" und="" 79="" von="" 195="" waren="" für="" uacr="" (fig.="" 4d,="" zusatzdaten="" 16).="" die="" histonmodifikation="" h3k4me1,="" eine="" auf="" aktive="" und="" geprimte="" enhancer="" konzentrierte="" markierung,="" wurde="" für="" alle="" zelltypen="" für="" uacr-assoziierte="" cpgs="" und="" fast="" alle="" zelltypen="" für="" egfr-assoziierte="" cpgs="" angereichert.="" während="" uacr-assoziierte="" cpgs="" eine="" anreicherung="" für="" die="" promotormarkierung="" h3k4me3="" in="" 34="" zelltypen="" zeigten,="" nur="" vier="">

-Typen zeigten eine Anreicherung für eGFR-assoziierte Stellen. Umgekehrt zeigte die Genkörper-assoziierte Markierung H3K36me3 eine viel breitere Anreicherung für eGFR-assoziierte CpGs (30 Zelltypen) als UACR-assoziierte CpGs (fünf Zelltypen). Im Gegensatz zu H3K3me1/3 und H3K36me3, die alle mit aktiven Genen (Enhancer, aktive Promotoren, aktive Transkription) in Verbindung gebracht wurden, waren H3K9me3 und H3K27me3, die im Allgemeinen mit konstitutivem und fakultativem Heterochromatin assoziiert sind28–31, nicht signifikant für UACR- angereichert. assoziierte CpGs in jedem getesteten Zelltyp (Fig. 4D, ergänzende Daten 16). Anreicherung von Genen impliziert durchNierenfunktion-assoziierte CpGs wurde in den Datenbanken Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) und Reactome (siehe Methods) bewertet32–35. Eine signifikante Anreicherung wurde für 27 Terme (25 GO, ein KEGG, ein Reactome; Supplementary Data 17, Abb. 5A) für eGFR und 91 Terme (87 GO, vier Reactome; Supplementary Data 18, Abb. 5B) für UACR (Abb .5B). Wege im Zusammenhang mit der typspezifischen Migration weißer Blutkörperchen, mRNA-Translation, Hämostase und Gerinnung sowie der Insulinreaktion zeigten eine signifikante Anreicherung für eGFFr-assoziierte CpGs (FDR < 0.05;="" abb.="" 5a).="" die="" wege="" mit="" den="" niedrigsten="" anreicherungs-p-werten="" für="" uacr-assoziierte="" stellen="" wurden="" von="" der="" immunzellaktivierung="" und="" -reaktion="" sowie="" von="" interferon-bezogenen="" wegen="" dominiert="" (fig.="" 5b).="" zusätzliche="" signalwege,="" die="" angereichert="" wurden,="" umfassten="" die="" migration="" weißer="" blutkörperchen,="" wie="" für="" die="" egfr-ergebnisse="" (ergänzungsdaten="">

Beziehung zu bekannten EWAS-Assoziationen mit anderen Merkmalen. Angesichts der beobachteten Anreicherung von Signalwegen, die mit der Immunantwort in Verbindung stehen, der DNA-Methylierungsergebnisse, einschließlich CpGs in der Nähe von Genen des Interferon-Signalwegs, und der Tatsache, dass der DNA-Methylierungsstatus überwiegend in Leukozyten bewertet wurde, bewerteten wir, ob unsere Ergebnisse durch verwirrende Effekte von verursacht werden könnten die Immunantwort oder der Entzündungsstatus. Daher führten wir eine Suche nach den replizierten CpGs in einem großen EWAS auf hochempfindlichen C-reaktiven Protein (CRP)-Spiegeln im Serum durch36. Nur zwei CpGs, die auch mit DNA-Methylierung und eGFR in Verbindung gebracht wurdenNierengewebe,cg09610644 bei BDH1 und cg12644285 bei CHD2 gehörten zu den CRP-assoziierten Stellen. Daher scheint eine allgemeine Verfälschung unserer Ergebnisse durch den Entzündungsstatus, wie er durch CRP geschätzt wird, unwahrscheinlich.

Manche derNierenfunktion-assoziierte CpGs, die in dieser Studie identifiziert wurden, sind basierend auf veröffentlichten EWAS mit mehreren anderen Merkmalen assoziiert. Einundzwanzig eGFR-Stellen waren mit Blutdruck, Alkoholkonsum, BMI, Geschlecht, löslichem Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 und/oder Raucherstatus assoziiert, und fünf UACR-Stellen waren zuvor mit Alkoholkonsum, Raucherstatus, BMI, Bildungsstand, -Glutamyltransferase, löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2, Typ-2-Diabetes mellitus und/oder mehrere Serummetaboliten (Tabelle 2, Ergänzende Daten 19). Drei dieser CpGs (alle UACR-Stellen) waren mit mehr als zwei Merkmalen assoziiert, nämlich cg02711608 in SLC1A5 (mit -Glutamyltransferase, -Glutamylthreonin, BMI, Alkoholkonsum), cg18181703 in SOCS3 (mit Diabetes mellitus Typ 2, Raucherstatus, BMI , löslicher Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2) und cg24859433 in der Nähe von IER3 (mit Raucherstatus, Bildungsabschluss, 4-Vinylphenol_sulfat). Ergänzende Abb. 5B veranschaulicht ein CpG, cg26099045, das mit eGFR und Fibrose in korreliert warNierengewebein unserer Analyse und zusätzlich in Zusammenhang mit Sex und Rauchen in früheren EWAS. Schließlich war cg17944885 bei ZNF788 auch mit eGFR in einer Stichprobe von DKD-Patienten assoziiert22.

Diskussion

In diesem EWAS vonNierenfunktionidentifizierten und replizierten wir Blut-DNA-Methylierungsniveaus von 69 CpGs, die mit eGFR assoziiert sind. Von diesen wurden 60 Stellen zuvor nicht gemeldet, ebenso wie alle sieben CpGs, die im Zusammenhang mit UACR identifiziert wurden. Die Mehrheit der eGFR- und UACR-assoziierten CpGs war auch signifikant mit ihren klinischen Ergebnissen, dh CKD und Mikroalbuminurie, assoziiert und könnte daher das Potenzial für eine Stratifizierung von Risikopersonen haben. Die Varianz der eGFR, die diesen 69 CpGs zugeschrieben wird, betrug 2,4 Prozent – ​​doppelt so viel wie bei einem früheren EWAS14 und ist vergleichbar mit der Varianz, die durch 29 von GWAS entdeckte SNPs erklärt wird, die eine dreimal höhere Stichprobengröße für die Locus-Entdeckung enthielten37,38. Dies deutet darauf hin, dass die differenzielle DNA-Methylierung an einzelnen CpGs, die aus Blut quantifiziert wurde, mehr von der eGFR-Varianz erklärt als einzelne gemeinsame SNPs bei einer bestimmten Probengröße. Für UACR scheinen größere Stichprobenumfänge im Vergleich zu eGFR erforderlich zu sein, um eine ähnliche Anzahl von Merkmals-assoziierten CpGs aufzudecken. Angesichts der Tatsache, dass Albumin und Kreatinin für die UACR-Berechnung im Urin gemessen werden, im Gegensatz zur Quantifizierung von Kreatinin aus Serum für die Schätzung der GFR, ist dieser Unterschied nicht unerwartet und stimmt mit Beobachtungen von GWAS zu diesen Merkmalen überein10,13. Darüber hinaus scheint die genetische Variation die zu beeinflussenNierenfunktionMerkmale über andere Wege als Änderungen in der DNA-Methylierung. Dies wird durch die geringe Überlappung zwischen den replizierten EWAS- und GWAS-Standorten sowohl für eGFR als auch für UACR unterstützt.

Diese EWAS-Metaanalyse umfasste Stichproben verschiedener Bevölkerungsgruppen und Ethnien. Wir beobachteten eine hohe Korrelation der Effektschätzungen, die von der großen Teilstichprobe von EA-Personen erhalten wurden, mit den Effekten, die bei den AA-Personen geschätzt wurden (Abb. 2). Trotz der Einbeziehung von Daten von einer beträchtlichen Anzahl von Personen mit Nicht-EA-Vorfahren könnten die Gesamtergebnisse der transethnischen EWAS von Daten von Personen mit EA-Vorfahren bestimmt werden, die 70 Prozent (eGFR) / 65 Prozent (UACR) ausmachten. unserer Studie (Ergänzende Daten 3 und 4). Um diese Einschränkung anzugehen, sind zukünftige Analysen mit einem erhöhten Anteil an Nicht-EA-Proben für eine zuverlässige und detaillierte Bewertung der Heterogenität zwischen den Vorfahren erforderlich. Das Potenzial, Erkenntnisse aus EWAS zu quantitativen Merkmalen in meist populationsbasierten Studien auf Personen mit dieser Krankheit zu übertragen, wird durch die Tatsache veranschaulicht, dass Effektschätzer bei 65 von 69 eGFR-assoziierten CpGs in einer Kohorte von 551 CKD-Patienten in der gleichen Richtung beobachtet wurden. Dies weist auf Mechanismen hin, die auf ein breites Spektrum von eGFR-Niveaus anwendbar sind (Abb. 3). Darüber hinaus,

cg07242931 in MAN1C1 und cg18194850 in SUCLG2 war nicht nur mit eGFR assoziiert, sondern prognostizierte die Zeit bisNierenversagenoder akutNierenverletzung(Ergänzende Daten 8). Weitere Beweise für eine Beteiligung von SUCLG2, das für die -Untereinheit der Succinyl-CoA-Synthetase kodiert, an Nierenerkrankungen wurden durch eine GWAS zu Diabetikern vorgeschlagenNierenerkrankungbei amerikanischen Indianern (SNP=rs4453858, P-Wert=2E−6)39. Die genetische Variation in diesem Gen war auch mit Succinyl-Carnitin (C4DC, SNP=rs115560420, P-Wert=7 E−15)40 im Urin assoziiert. C4DC ist ein Stoffwechselprodukt aus dem Tricarbonsäurezyklus, der unter Beteiligung der Succinyl-CoA-Synthetase katalysiert wird und höhere C4DC-Spiegel im Blut mit einer niedrigeren eGFR41 assoziiert. Eine Suche in den Ergebnissen der Methylation Quantitative Trait Loci (meQTL) von GoDMC (http://www.godmc.org.uk)42 ergab jedoch keine signifikante Assoziation dieser beiden SNPs mit cg18194850, was darauf hindeutet, dass es keine direkte Verbindung zwischen diesen SNPs gibt und die CpG-Site.

Da die DNA-Methylierung ein wichtiger Regulator der Genexpression ist, haben wir die Korrelation der merkmalsassoziierten DNA-Methylierungsstellen mit den mRNA-Mengen von Genen in cis bewertet. Gene, deren mRNA-Spiegel signifikant mit korreliertenNierenfunktionassoziierte DNA-Methylierungsstellen waren mit Interferon-Wegen verbunden (sowohl für eGFR als auch für UACR). Obwohl diese Ergebnisse mit den Signalweg-Anreicherungsergebnissen für UACR (Abb. 5B, ergänzende Daten 18) übereinstimmen, ist die Anzahl signifikanter Korrelationen zwischen UACR-assoziierten CpGs und Transkriptspiegeln recht gering. Angesichts der relativ kleinen Stichprobengröße von 1915 Personen, die für diese Analyse zur Verfügung stehen, und der begrenzten Abdeckung der Transkriptomik-Ressource ist dies nicht überraschend. Interessanterweise waren unter den signifikanten Befunden für UACR zwei CpGs beim Mitglied 5 der Familie 1 der gelösten Träger (SLC1A5) mit der differentiellen Genexpression und auch mit dem Blutdruck assoziiert. Die DNA-Methylierung an SLC1A5, das für einen natriumabhängigen Transporter für neutrale Aminosäuren kodiert, könnte daher ein zusätzliches Element sein, das zu der bekannten Korrelation zwischen UACR und Blutdruck beiträgt.

Signifikante differentiell exprimierte Transkripte wurden nicht immer durch das nächstgelegene Gen kodiert (cg17944885 nahe ZNF788), oder eine CpG-Stelle war mit mehreren Genen in cis korreliert (cg04864179 bei IRF5). Insbesondere die Korrelation der DNA-Methylierung bei cg04864179 mit den IRF5-Transkriptspiegeln ist bemerkenswert. In Anbetracht des signifikanten MR-Ergebnisses dieses CpG mit eGFR könnte die DNA-Methylierung bei IRF5 die eGFR, vermittelt durch ihre Genexpression, ursächlich beeinflussen. Unter Berücksichtigung der Merkmalstransformation der zugrunde liegenden genetischen Assoziationen (siehe Methoden) beobachteten wir, dass eine Erhöhung der DNA-Methylierung um zehn Standardabweichungen zu einer um 3,2 Prozent höheren eGFR führte. Obwohl dieser geschätzte Effekt sehr gering ist, wurde ein kausaler Einfluss von Methylierungsmustern in Blutzellen auf CKD auch durch zusammenfassende MR mit einem anderen meQTL-Datensatz in einer kürzlich durchgeführten Studie gestützt, in der der kausale Effekt richtungsmäßig mit unseren Ergebnissen übereinstimmte22. Durch die Anwendung von Multi-Trait-Kolokalisierung zeigten sie auch, dass die genetischen Auswirkungen dieses Locus auf die eGFR durch IRF5-Methylierung und Genexpression im Blut vermittelt wurden. Darüber hinaus wurde eine Kolokalisierung der IRF5-Genexpression mit eGFR sowohl in den tubulären als auch in den glomerulären Kompartimenten von gezeigtNiereGewebe43. Bei der Interpretation des in unserer Studie beobachteten kausalen Effekts sollte jedoch berücksichtigt werden, dass die MR-Analysen für CpG cg04864179 eine signifikante Heterogenität (p < 0,05)="" zwischen="" den="" instrumenten="" zeigten="" (supplementary="" data="" 11="" und="" supplementary="" abb.="" 7="">

IRF5 kodiert für ein Mitglied der Familie der Interferon-regulatorischen Faktoren (IRF). Die Gruppe der IRF-Familienmitglieder enthält Transkriptionsfaktoren mit unterschiedlichen Rollen, wie der Modulation der Aktivität, des Wachstums und der Differenzierung des Immunsystems sowie der Kontrolle der Genexpression für die Interferon-Antwort auf Virusinfektionen. IRF5 kann die Antwort der Immunzellen beeinflussen. Mehrere Studien belegen, dass sich Änderungen der IRF5-Methylierung auswirken könntenNierenfunktionüber Immunwege: SNPs in IRF5 sind über Veränderungen der IRF5-Expression in Blutmonozyten mit SLE assoziiert44–46. SLE ist eine Autoimmunerkrankung, die durch eine Aktivierung des IFN-Signalwegs gekennzeichnet ist, die das beeinflussen kannNierenB. Lupusnephritis47. Die Hemmung der IRF5-Hyperaktivierung in einem Mausmodell von SLE schützte vor Beginn und Schweregrad einer Lupusnephritis und verbesserte sichNierenfunktionund Pathologie48,49. Obwohl sich unser EWAS nicht auf die Untersuchung von SLE-Patienten konzentrierte, könnten kleine Auswirkungen der IRF5-Methylierung auf nierenbezogene Ergebnisse, die zumindest teilweise durch ihre Expression und nachfolgende IFN-Wege vermittelt werden, als Auswirkungen auf die eGFR in der Allgemeinbevölkerung nachgewiesen werden.

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENSCHMERZEN VERBESSERN

Mehrere der eGFR-assoziierten CpGs, für die die DNA-Methylierung aus Blutzellen quantifiziert wurde, waren auch mit eGFR und assoziiertNiereFibrose, wenn die DNA-Methylierung quantifiziert wurdeNiereGewebe, obwohl die Stichprobengröße im Vergleich zum EWAS-Datensatz wesentlich kleiner war. Dies deutet darauf hin, dass zumindest einige der aus Blut gewonnenen Erkenntnisse auf ein zusätzliches merkmalsspezifisches Zielgewebe übertragen werden können. Hier, Blut undNieresind die beiden wichtigsten merkmalsspezifischen Zielgewebe, da dieFunktiondesNiereist die Filtration von Blut, um Abfallstoffe zu entfernen. Anreicherungsanalysen derNierenfunktionassoziierte CpGs zeigten eine zentrale Rolle bei der Transkriptionsregulation. Wir fanden eine weit verbreitete Anreicherung von H3K4me1/3 und H3K36me3. H3K4me1/3 ist mit geprimten und aktiven Enhancern sowie aktiven Promotoren verbunden und H3K36me3 ist eng mit transkribierten Regionen des Genoms korreliert50. Die Rolle der Transkriptionsregulation wird weiter unterstützt durch das stärkste Transkriptionsfaktor-Anreicherungssignal von UACR-assoziierten CpGs, das POLR2A ist, die größte Untereinheit des Hauptenzyms, das mRNA in Eukaryoten synthetisiert.

Zu den potenziellen Einschränkungen im Zusammenhang mit den MR-Analysen gehört, dass für die Vorwärts-MR nicht für alle CpGs gültige Instrumente verfügbar waren. Da alle Instrumente einer CpG aus cis-Regionen ausgewählt wurden, dh aus der gleichen genetischen Region, ist es wahrscheinlich, dass alle Instrumente einer CpG entweder gültig oder ungültig sind, wodurch die Anzahl der verschiedenen MR-Methoden begrenzt wird, die zum Testen angewendet werden können Robustheit der Ergebnisse51. Die Leistung des umgekehrten MR war aufgrund der geringen Probengröße, die für die Schätzung von SNP-DNA-Methylierungsassoziationen verfügbar war, begrenzt. Größere meQTL-Studien wie die GoDMC konnten aus technischen Gründen nicht Assoziationsergebnisse für alle SNPs speichern (d. h. oberhalb eines bestimmten Assoziations-P-Wert-Grenzwerts) und waren daher für die reverse MR mit zwei Stichproben nicht verwendbar. Daher müssen die nicht signifikanten Befunde mit Vorsicht interpretiert werden. Außerdem ist eine Interpretation der Größe des kausalen Effekts schwierig, da die zugrunde liegenden genetischen Assoziationen auf der Standardabweichungsskala der DNA-Methylierungsgrade berechnet werden. Eine weitere mögliche Einschränkung der Studie besteht darin, dass eGFR, CKD und UACR Phänotypen sind, die anhand verschiedener zugrunde liegender Parameter geschätzt werden und multifaktorielle Einflüsse haben. Daher haben wir mehrere Analysen durchgeführt, um sicherzustellen, dass unsere EWAS-Ergebnisse nicht von bekannten Confoundern beeinflusst wurden, einschließlich Typ-2-Diabetes, einem potenziellen Confounder der Beziehung zwischen DNAm undNierenfunktion. Zunächst wurden die EWAS-Assoziationen in jeder Kohorte um Confounder bereinigt, um deren Effekte innerhalb einer Kohorte zu entfernen. Zweitens wurden die EWAS in jeder Kohorte separat durchgeführt und anschließend metaanalysiert, was einer Anpassung z. B. für die Prävalenz von Diabetes über Kohorten hinweg entspricht. Schließlich überprüften wir die Assoziationen unserer replizierten CpGs innerhalb veröffentlichter Diabetes-EWAS-Studien. Von all unseren replizierten CpG-Assoziationen zeigte nur das UACR-assoziierte CpG cg18181703 bei SOCS3 eine Assoziation mit Typ-2-Diabetes. Dieses CpG war auch mit dem Raucherstatus, dem BMI und den Blutspiegeln des löslichen Tumornekrosefaktor-Rezeptors 2 assoziiert. Unter Berücksichtigung, dass unser EWAS auch für den Raucherstatus und den BMI angepasst wurde, gehen wir davon aus, dass die Wirkungen von cg18181703 auf UACR gleich sind zumindest teilweise unabhängig von Typ-2-Diabetes, BMI und Raucherstatus. Während wir mehrere dieser bekannten Faktoren kontrolliert haben, konnten andere Faktoren wie nicht gemessene Kovariaten in den Analysen nicht explizit angepasst werden und können die Ergebnisse beeinflussen.

Weitere EWAS-Studien mit erhöhten Probengrößen und mit quantifizierter DNA-Methylierung aus zusätzlichen Geweben sowie Funktionsanalysen sind erforderlich, um unser Wissen über Regulationsmechanismen von zu erweiternNierenfunktion, und um letztendlich die Vorhersage und Behandlung von zu verbessernNiereErkrankung. Dies gilt insbesondere für UACR angesichts der geringeren Anzahl beobachteter signifikanter CpG-Assoziationen. Zusammenfassend hat diese groß angelegte EWAS-Metaanalyse die Anzahl der CpGs, die reproduzierbar mit eGFR und CKD assoziiert sind, erheblich erweitert und sieben Assoziationen für UACR und Mikroalbuminurie aufgezeigt. Die DNA-Methylierung an diesen Stellen erklärte einen großen Teil der eGFR-Varianz, und die unterschiedliche Methylierung an vier CpGs zeigte Hinweise auf einen möglichen kausalen Zusammenhang mit der eGFR. Umfassende Charakterisierung von replizierten CpGs bei Patienten mit CKD, inNierengewebe,für die differenzielle Genexpression und für angereicherte Signalwege und epigenetische Markierungen bieten Einblicke inNierenfunktion-assoziierte Transkriptionsregulation.

Methoden

Überblick.Wir haben eine kollaborative Metaanalyse basierend auf einem distributiven Datenmodell und Qualitätskontrollverfahren erstellt. Um die Phänotypstandardisierung über Studien hinweg zu maximieren, wurden ein Analyseplan und ein Befehlszeilenskript (https://github.com/generic-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno) erstellt und allen teilnehmenden Studien zur Verfügung gestellt ( überwiegend bevölkerungsbezogene Studien; Ergänzende Daten 1 und 2). Automatisch generierte Übersichtsdateien wurden zentral geprüft. Nach der Genehmigung des Phänotyps führten die Studien ihre EWAS durch und luden Ergebnisse und aggregierte DNA-Methylierungsinformationen auf einen zentralen Server hoch. Die EWAS-Qualitätskontrolle wurde mit benutzerdefinierten Skripten durchgeführt, um die Inflation, Positivkontrollen, die Verteilung von CpG-Sonden zu bewerten und die Gesamtverteilungen von Effektgrößen, Standardfehlern und P-Werten über Studien hinweg zu vergleichen. Alle Studienprotokolle wurden von den jeweiligen lokalen Ethikkommissionen genehmigt. Alle Teilnehmer an allen Studien gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab.

CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/RENALE DIALYSE VERBESSERN

Phänotyp-Definition.Kreatininwerte, die mit dem Jaffé-Assay vor 2009 erhalten wurden, wurden durch Multiplizieren mit 0,9552 kalibriert. Studien schätzten die GFR mit dem ChronicNierenerkrankungEpidemiology Collaboration (CKD-EPI)-Gleichung53. Die eGFR wurde bei 15 und 200 ml min−1 pro 1,73 m2 winsorisiert. CKD wurde als eGFR unter 60 ml min−1 pro 1,73 m2 definiert. Die in mg/g gemessenen UACR-Werte wurden vor allen Analysen natürlich log-transformiert. Mikroalbuminurie wurde als 1 für UACR > 30 mg/g und als 0 für UACR-Werte < 10="" mg/g="">

Quantifizierung und Qualitätskontrolle der DNA-Methylierung.Zur Quantifizierung der DNA-Methylierung wurde genomische DNA aus peripherem Blut extrahiert. Der Grad der DNA-Methylierung wurde mit dem Infinium MethylationEPIC BeadChip-Array (EPIC), dem Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip-Array (HM450K) oder dem Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip-Array (HM27K) quantifiziert. Die Vorverarbeitung der DNA-Methylierungsdaten wurde gemäß den individuellen Studienprotokollen durchgeführt, einschließlich Hintergrundkorrektur, Quantil-Normalisierung, Sondenfilterung, Probenfilterung, SNP-Abgleich mit den SNP-Kontrollsondenpositionen, Ausreißerfilterung und Assay-Typ-Korrektur (Ergänzungsdaten 3). Der Methylierungsgrad an jeder Stelle wurde als -Wert dargestellt und analysiert. CpG-Sonden, die mit SNPs überlappen, wurden annotiert. Jede Studie berechnete den Mittelwert und die Standardabweichung jeder CpG-Stelle, und diese zusammenfassenden Statistiken wurden zwischen den Studien auf systematische Unterschiede zwischen den CpGs verglichen und mit einzelnen Studienanalytikern weiterverfolgt

Kovariatenbewertung.DNA-Methylierung und Kovariaten wurden bei demselben Besuch/Zeitpunkt gemessen. Prävalenter Diabetes wurde definiert als Nüchtern-Plasmaglukose größer oder gleich 126 mg/dl, Nicht-Nüchtern-Plasmaglukose größer als oder gleich 200 mg/dl, Behandlung von Diabetes oder Selbstbericht einer Diabetesdiagnose. Prävalenter Bluthochdruck wurde definiert als systolischer Blutdruck größer oder gleich 140 mm Hg, diastolischer Blutdruck größer als oder gleich 90 mm Hg oder Behandlung von Bluthochdruck. Wenn kein gemessener Blutdruck verfügbar war, wurde Hypertonie durch Selbstangaben definiert. Der aktuelle Raucherstatus wurde anhand von Selbstauskünften definiert. Der BMI (kg/m2) wurde anhand von Gewichts- und Größenmessungen berechnet, die in jeder Studie bewertet wurden. Das Alter wurde als kontinuierlicher Wert in die Assoziationsmodelle aufgenommen. Die Populationsstruktur in nicht-familiären Studien wurde durch genetische Hauptkomponenten (PC) adjustiert. Die Anteile der weißen Blutkörperchen wurden basierend auf der DNA-Methylierung geschätzt54. Zusätzliche technische Kovariaten umfassten Kontrollsonden-PCs55, Studienzentrum, Verarbeitungscharge, Array-Sentrix-ID und Sentrix-Position.

Statistische Methoden und Metaanalyse. Um eine vergleichbare Leistung zwischen den analysierten Standorten sicherzustellen, wurden nur autosomale CpGs, die sowohl von EPIC als auch von HM450K gemessen wurden, in die Analysen einbezogen. Jede Studie führte lineare Regressionsanalysen getrennt nach Abstammungsgruppen durch. Zur Beurteilung der Robustheit der EWAS-Ergebnisse wurden die Analysen auf Studien und Teilstichproben von Personen europäischer Abstammung beschränkt. DNA-Methylierungswerte wurden als abhängige Variablen modelliert, wobei das Merkmal entweder kontinuierliche eGFR- oder UACR-Werte oder binäre CKD- oder Mikroalbuminurie-Variablen waren: DNA-Methylierung ~ Merkmal plus Geschlecht plus Alter plus genetische PCs plus Anteile weißer Blutkörperchen plus technische Kovariaten plus Diabetes plus Bluthochdruck plus BMI plus aktuelles Rauchen Die Teilnehmer benötigten vollständige Informationen für alle Variablen und Studienzusammenfassungsstatistiken und wurden nur eingeschlossen, wenn mindestens 50 Teilnehmer für eGFR/UACR bzw. 50 Fälle/Kontrollen für CKD/Mikroalbuminurie verfügbar waren. Jede studienspezifische EWAS wurde vor der Metaanalyse durch den BACON-Ansatz inflationsbereinigt, wenn die Inflationsschätzung größer oder gleich eins war (ergänzende Abb. 8)56. Die Studien wurden nach chronologischer Reihenfolge des Beitrags zur Metaanalyse des CKDGen-Konsortiums in Entdeckung und Replikation unterteilt (Ergänzungsdaten 1 und 2). Für Entdeckungsstudien, Replikationsstudien und für die resultierenden Effektschätzungen von Entdeckung und Replikation wurde eine Fixed-Effect-Inverse-Varianz-gewichtete Metaanalyse durchgeführt, wie sie im R-Paket 'metafor' (Version 2.1-0) implementiert ist. CpGs wurden ausgeschlossen, wenn weniger als die Hälfte der jeweiligen Stichprobengröße entweder innerhalb der Entdeckung oder der Replikation verfügbar war oder wenn die Schätzung der I2-Heterogenität über 95 Prozent lag. Die erfolgreiche Replikation eines assoziierten CpG wurde als konsistente Richtung der Effektschätzungen zwischen Entdeckung (neGFR-Scheibe=22,347, nUACR-Scheibe=11,458) und Replikation (neGFR-Repl=11,258) definiert , nUACR repl=3610) Metaanalyse, eine Bonferroni angepasste Signifikanz des Entdeckungs-P-Werts (pdisc)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Genexpressionsanalysen.Die Auswirkungen derNierenfunktionMerkmal-assoziierte CpGs wurden unter Verwendung von zwei Datensätzen auf Assoziationen mit der Genexpression im Blut getestet: (1) mRNA-Spiegel von Monozyten von 1202 Teilnehmern der MESA-Studie und (2) Vollblut-mRNA von 713 Personen der KORA F4 Studie 57,58. Als erster Schritt wurde ein Lookup der CpG-Methylierungslevel mit den in den Assoziationsergebnissen der MESA-Studie verfügbaren mRNA-Leveln durchgeführt. Für diese Suche waren Assoziationsergebnisse mit einem P-Wert < 1e{{10}}="" verfügbar.="" die="" analyse="" wurde="" ausführlich="" in="" kennedy="" et="" al.59="" beschrieben.="" kurz="" gesagt,="" die="" genexpression="" wurde="" mit="" illumina="" humanht-12="" v3.0="" und="" v4.0="" expression="" beadchips="" und="" dna-methylierung="" mit="" dem="" illumina="" hm450k-array="" bewertet.="" expressionswerte="" wurden="" unter="" verwendung="" der="" varianzstabilisierenden="" transformation="" normalisiert.="" 13.933="" transkripte="" aus="" den="" v3.0-="" und="" v4.0-arrays,="" die="" bei="" mindestens="" 5="" prozent="" der="" probanden="" signifikant="" über="" dem="" hintergrundniveau="" (nachweis-p-wert="">< 0,01)="" exprimiert="" wurden.="" assoziationsanalysen="" in="" mesa="" wurden="" als="" lineares="" gemischtes="" modell="" durchgeführt,="" wobei="" log-transformierte="" genexpressionswerte="" als="" abhängige="" variable,="" dna-methylierungs-beta-werte="" als="" unabhängige="" variable="" verwendet="" wurden,="" wobei="" alter,="" geschlecht,="" ethnische="" zugehörigkeit="" und="" studienzentrum="" als="" kovariaten="" in="" das="" modell="" aufgenommen="" wurden.="" ein="" zweiter="" assoziationstest="" wurde="" im="" kora="" f4-datensatz="" durchgeführt.="" die="" assoziation="" des="" methylierungsgrads="" an="" replizierten="" cpgs="" mit="" genexpressionswerten="" von="" genen="" innerhalb="" einer="" umgebung="" von="" ±500 kb="" wurde="" unter="" verwendung="" der="" log2--transformierten="" mrna-werte="" berechnet,="" die="" aus="" dem="" illumina="" human="" ht-12v3-genexpressionsarray="" erhalten="" wurden.="" die="" genexpressionswerte="" wurden="" auf="" die="" geschlechts-="" und="" altersbereinigten="" betawerte="" der="" dna-methylierung="" regressiert.="" vor="" der="" analyse="" wurden="" die="" technischen="" faktoren="" sowie="" die="" blutzelltypanteile="" aus="" den="" mrna-="" und="" dna-methylierungsniveaus="" regressiert="" und="" ihre="" residuen="" in="" das="" endgültige="" assoziationsmodell="" aufgenommen.="" annotations-="" und="" qualitätskontrollprüfungen="" der="" genexpressionssonden="" basierten="" auf="" der="" tabelle="" von="" schurmann="" et="" al.60.="" cpg-genexpressionsassoziationen="" im="" blut,="" die="" in="" den="" mesa-ergebnissen="" verfügbar="" waren="" und="" einen="" assoziations-p-wert=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

DNA-Methylierung im Nierengewebe.Die Analysen mittels DNA-Methylierung inNierengewebemit eGFR und Fibrose wurden unter Verwendung von Daten von 506 Mikrodissektionen durchgeführtNierengewebeProben mit dem Illumina EPIC BeadChip. Die Nierengewebeproben wurden separat gesammelt und unterscheiden sich von den Blutproben, die in der EWAS-Metaanalyse analysiert wurden. Diese Proben wurden von nicht betroffenen Teilen von Tumornephrektomien gesammelt und wie zuvor beschrieben präpariert 61. Kurz gesagt, die SeSAMe-Software62 wurde verwendet, um die Vorverarbeitung und Qualitätskontrolle durchzuführen, einschließlich Erkennung auf Basis niedriger Intensität, Durchblutungskorrektur bei Hintergrundsubtraktion, nichtlineare Farbstoffverzerrungskorrektur, Kontrolle der Bisulfit-Umwandlung, Berechnung der Beta-Werte und Schätzung der Leukozytenfraktion. Beta-Werte von CpGs, die mit eGFR und UACR assoziiert sind, und klinische Informationen wurden für die Assoziationsanalyse extrahiert. Ein Regressionsmodell wurde angewendet, um die Assoziationen von DNA-Methylierungs-Betas der endgültigen CpGs als abhängige Variablen mit eGFR- bzw. Fibroseniveaus zu testen, als unabhängige Variablen, angepasst an Geschlecht, Alter, genetische PCs (1–5), Diabetesstatus, Bluthochdruckstatus , BMI, Array-Sentrix-ID, Sentrix-Position und Bisulfit-Umwandlungskontrolle und geschätzte Leukozytenfraktion.

Gezielte Untersuchungen von eGFR-Sonden bei CKD-Patienten. Die Assoziation der 69 eGFR-assoziierten und validierten CpGs aus der Allgemeinbevölkerung mit eGFR in der Deutschen ChronikNierenerkrankung (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 mg g−1). Die Nachbeobachtung der Patienten hinsichtlich klinischer Endpunkte ist noch nicht abgeschlossen. Studienendpunkte werden auf Basis von Krankenhausentlassungsbriefen und Sterbeurkunden kontinuierlich und standardisiert erfasst und beinhalten nierenbedingte Ereignisse sowie Todesfälle. Das Studiendesign und die rekrutierte Studienpopulation sind in früheren Veröffentlichungen ausführlicher beschrieben63,64. Die GCKD-Studie wurde von lokalen Ethikkommissionen genehmigt und im nationalen Register für klinische Studien (DRKS 00003971) registriert. Eine Untergruppe von 559 Patienten mit chronischer Nierenerkrankung, die systemischem Lupus erythematodes, membranöser Nephropathie, fokaler segmentaler Glomerulosklerose oder autosomal-dominanter polyzystischer Erkrankung zugeschrieben wirdNierenerkrankungwurde für die Quantifizierung der DNA-Methylierung ausgewählt und mit dem Infinium MethylationEPIC BeadChip-Array (EPIC) gemessen. Die Assoziation mit eGFR wurde analog zur Hauptanalyse ausgewertet (siehe Statistische Methoden und Meta-Analyse), abgesehen von der Anpassung für das Rauchen, die für Nie-/Ex-/aktuelle Raucher mit 0/1/2 codiert wurde. Bewertung der Assoziation von DNA-Methylierung mit der Zeit toNierenversagenab Studieneintritt wurden Cox-Regressionsmodelle für jede CpG und analog für einen kombinierten Endpunkt von angepasstNierenversagenund akutNierenverletzung.Neben dem DNA-Methylierungsprädiktor wurden die Modelle für Alter, Geschlecht und CNE-Subtyp angepasst. Das Cox-Regressionsmodell liefert Schätzungen für die ursachenspezifische Hazard Ratio (HR) in Gegenwart der konkurrierenden Ereignisse, dh aller anderen Todesfälle außer nierenbedingten Todesfällen. Zusätzlich wurden Unterverteilungsgefahrenanalysen durchgeführt, um mögliche indirekte Auswirkungen über die konkurrierende Veranstaltung zu bewerten. Die proportionale Hazard-Annahme wurde basierend auf skalierten Schoenfeld-Residuen bewertet. Die grafische Auswertung für die beiden zugehörigen CpGs ergab keine Hinweise auf schwerwiegende Verstöße (ergänzende Abb. 9).

Diagramme und Anmerkungen der Regionalverbände. Die Diagramme für die ergänzende Abb. 5 wurden mit den R-Paketen „Gviz“ 65 und „rtracklayer“ 66 erstellt. In die Darstellung wurden maximal 40 Standorte innerhalb von 50,000 bp stromaufwärts oder stromabwärts des interessierenden CpG-Standorts aufgenommen. Wenn das Intervall mehr als die 40 Stellen enthielt, wurde die dargestellte Region auf die Entfernung der am weitesten entfernten Stelle plus 10,000 bp reduziert. Der Abschnitt „RefSeq-Gene“ basiert auf dem UCSC NCBI RefSeq-Track mit Gensymbolen aus dem R-Paket „org.Hs.eg.db“, der Abschnitt „CpG-Inseln“ basiert auf dem UCSC-Track „CpG-Inseln“, der Abschnitt „Roadmap chromHMM“ basierte auf dem Roadmaps 15- geben das chromHMM-Modell des Fötus anNiereepigenome (Roadmap Epigenome ID: E086)67 und der Abschnitt Common SNPs basiert auf dem Track Common SNPs(151) der UCSC68. Schließlich basiert das CpG-Korrelationsdiagramm unten in der Abbildung auf Daten der DNA-Methylierungsproben der KORA F4-Studie unter Verwendung des Illumina HumanMethylation450 BeadChip-Arrays, wobei fehlende Stellen hellgrau gefärbt sind.

Varianz wird durch DNA-Methylierung erklärt.Der Prozentsatz der phänotypischen Varianz, der durch die 69 replizierten CpGs im Zusammenhang mit eGFR erklärt wird, wurde anhand von Daten von 1.888 Teilnehmern der KORA FF4-Studie, der siebenjährigen Nachbeobachtung der KORA F4-Studie, geschätzt57,58. Der KORA FF4 war nicht Bestandteil der EWAS-Metaanalyse. 988 Personen, die in die Analyse der erklärten Varianz einbezogen wurden, überschnitten sich jedoch mit den KORA F4-Teilnehmern der EWAS. In diesem Datensatz wurde die Varianz, die durch alle CpGs unabhängig von den Kovariaten erklärt wird, als die Differenz im R2 des Basismodells einschließlich der CpGs und des Modells ohne berechnet. Das Basismodell wurde definiert alsNiereMerkmal ~Geschlecht plus Alter plus Anteil weißer Blutkörperchen plus Diabetes plus Bluthochdruck plus BMI plus aktuelles Rauchen mitNiereMerkmal, das eGFR und UACR darstellt. Für zwei eGFR-assoziierte CpGs (cg06008406, cg20004659) waren im KORA FF4-Datensatz keine Daten verfügbar.

Bidirektionale Mendelsche Randomisierungsanalyse.In Vorwärts-MR untersuchten wir unter Verwendung des „TwoSampleMR“ R-Pakets69 mögliche kausale Auswirkungen der DNA-Methylierung an den replizierten CpGs auf eGFR und UACR. MR verwendet genetische Instrumente, um Verzerrungen aufgrund von Verwechslungen und umgekehrter Kausalität zu minimieren70. Genetische Instrumente für die DNA-Methylierung (meQTL) waren für 47 und fünf CpGs für eGFR bzw. UACR verfügbar, wie zuvor von GoDMC bei bis zu 27,75 0 Personen identifiziert42. Als die jeweiligen Ergebnisdaten wurden europäische Abstammungszusammenfassungs-GWAS-Daten zu eGFR10 und UACR13 verwendet. Filter wurden für den meQTL-Einschluss angewendet (pSNP < 1e-5="" mit="" dna-methylierung="" in="" einer="" ±="" 500="" kb="" cis-region,="" kopplungsungleichgewicht="" r2="">< 0,2="" innerhalb="" einer="" 1="" mb-region,="" steiger-filterung,="" maf=""> 0,05). Wir führten invers-varianzgewichtete MR- sowie MR-Sensitivitätsanalysen (einfacher Modus, gewichteter Modus, gewichteter Median und MR Egger) oder eine Triangulation durch Schätzung des Wald-Verhältnisses durch, falls nur ein einziges Instrument pro CpG-Standort verfügbar war71–73. Die aus MR erhaltenen Effektschätzungen hängen von den Einheiten der zugrunde liegenden Datensätze ab und entsprechen in diesem Fall einer Änderung pro Einheit in einer Standardabweichung der Methylierungsniveaus der natürlichen logarithmisch transformierten eGFR und der Standardabweichung der natürlichen logarithmisch transformierten UACR. beziehungsweise. In umgekehrter MR untersuchten wir mögliche kausale Auswirkungen vonNierenfunktionMerkmale auf DNA-Methylierung unter Verwendung der genomweiten signifikanten SNPs aus transethnischen GWAS auf eGFR10 und UACR13 als genetische Instrumente für eGFR bzw. UACR. Um die Aussagekraft der Ergebnisdaten zu maximieren, führten wir eine Z-Score-Metaanalyse der SNP-CpG-Assoziationen aus den Studien KORA F4 (n=1662) ​​und FHS (n=3868) durch. Die kombinierten Effektschätzer und ihre Standardfehler des in der MR enthaltenen meQTL wurden aus der Stichprobengröße, der Allelhäufigkeit und dem z-Score geschätzt74. Filter wurden für den SNP-Einschluss angewendet (P-Wert < 5e-8="">NiereMerkmal, einseitiger P-Wert < 0.05="" mit="" blut-harnstoff-stickstoff="" für="" egfr-instrumente,="" abstammungsheterogenität="" p-wert="" größer="" als="" oder="" gleich="" 0.0="" 1,="" steiger-filterung,="" maf=""> 0.05). Wir führten eine inverse varianzgewichtete MR mit multiplikativen Zufallseffekten durch (da pro Merkmal eine ausreichend große Anzahl von Instrumenten von verschiedenen Loci verfügbar war)51 und MR-Sensitivitätsanalysen (einfacher Modus, gewichteter Modus, gewichteter Median und MR Egger)71–73. Als zusätzliche Sensitivitätsanalyse für pleiotrope Varianten schlossen wir insgesamt 35 Instrumente aus, die mit Typ-2-Diabetes mellitus in einer kürzlich durchgeführten GWAS75, darunter 898.130 Personen, assoziiert waren: elf SNPs, die einen Assoziations-P-Wert < 5e-8="" mit="" diabetes="" hatten,="" und="" 24="" weitere="" instrumente,="" die="" sich="" in="" einem="" kopplungsungleichgewicht="" (r2=""> 0,2 innerhalb von 1 Mb, 1000 G EUR Referenzpanel) mit einem solchen Diabetes-assoziierten SNP befanden. Das Kopplungsungleichgewicht wurde über LDlink76 bewertet. Für die umgekehrte MR liefern die Effektschätzungen die Änderung pro Einheit in der natürlichen log-transformierten eGFR bzw. der Standardabweichung der natürlichen log-transformierten UACR bei einer Standardabweichung der DNA-Methylierungsniveaus. Die P-Wert-Mehrfachtest-Anpassung gemäß Benjamini-Hochberg-FDR < 0,05="" wurde="" pro="" nierenmerkmal="" und="" für="" vorwärts-="" und="" rückwärts-mr="" separat="" angewendet77.="" heterogenitäts-p-werte="" wurden="" aus="" q-statistiken="">

Anreicherungsanalysen.Um die potenziellen funktionellen Wirkungen der assoziierten CpGs zu informieren, bewerteten wir die Anreicherung dieser CpGs an Stellen der DNase I oder Histonmodifikation (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3), Gensets basierend auf GO-Begriffen und Signalwegen in den KEGG- und Reactome-Datenbanken32 –35. TFBS-Anreicherungsanalysen wurden wie zuvor ausführlich beschrieben durchgeführt14. Kurz gesagt, Anreicherungstests wurden unter Verwendung von eForge78 unter Verwendung von Permutation mit Abgleich für Gen- und CpG-Inselregionslokalisierung bei der Probenahme bewertet. Die Daten stammen entweder aus den Projekten ENCODE (125 Proben) oder Roadmap Epigenomics (299 Proben), die mit der Hotspot-Methode generiert wurden67,79,80. Die CpGs, die mit eGFR bzw. UACR bei einem P-Wert < 1e−05="" in="" der="" metaanalyse="" assoziiert="" waren,="" wurden="" als="" input="" verwendet="" (ergänzungsdaten="" 6="" und="" 7),="" und="" 10,000="" resampling-läufe,="" ein="" aktiver="" näherungsfilter="" und="" betrachteten="" fdr="">< 0,05="" als="" signifikant="" (ergänzungsdaten="" 13="" und="" 14).="" histonmark-anreicherungsanalysen="" wurden="" analog="" durchgeführt="" (supplementary="" data="" 15="" und="" 16).="" die="" anreicherung="" in="" gensets="" oder="" signalwegen="" wurde="" unter="" verwendung="" des="" methylgsa-pakets="" und="" der="" r-version="" 3.6.181="" bewertet.="" das="" anreicherungstestverfahren="" war="" methylglm,="" das="" eine="" logistische="" regression="" implementierte,="" die="" die="" anzahl="" der="" sonden="" pro="" gen="" und="" den="" autosomalen="" hintergrund,="" der="" 450k-="" und="" epic-arrays="" überlappt,="" anpasst.="" getestet="" wurden="" gensets="" oder="" signalwege="" mit="" 100–500="" genen="" (standardeinstellung).="" wir="" betrachteten="" einen="" gensatz="" oder="" -pfad="" als="" signifikant="" angereichert="" bei="" fdr="">< 0,05,="" wobei="" wir="" mehrere="" tests="" innerhalb="" jeder="" datenbank="" unter="" verwendung="" der="" methode="" von="" benjamini="" und="" hochberg="" korrigierten="" (ergänzende="" daten="" 17="" und="">