Metaanalyse der NAD(P)(H)-Quantifizierungsergebnisse zeigt Variabilität zwischen Säugetiergeweben Ⅱ

Die Auswirkung der Gewebeentnahme vor und nach dem Tod auf die NAD(P)(H)-Spiegel.

Wir haben vorhergesagt, dass es möglicherweise einen beobachtbaren Unterschied im NAD(P)(H)-Redoxzustand gibt, der von den Gewebeentnahmeverfahren abhängt. Um diese Frage zu beantworten, untersuchten wir die Auswirkung von Gewebeentnahmeverfahren vor und nach dem Tod auf den NAD(P)(H)-Redoxstatus. Für diese Analyse verglichen wir Werte aus Rattenlebergewebe angesichts der größeren Anzahl von Studien, die ihr Tötungsprotokoll definierten. Bei der Offenlegung gaben alle überprüften Studien an, dass die Gewebeproben vor den NAD(P)(H)-Messungen kalt gehalten und sofort auf Eis extrahiert oder bei –80 Grad eingefroren wurden. Diese Analyse ergab, dass es keinen signifikanten Unterschied in den NAD-Plus-Konzentrationen in der Rattenleber (Abb. 6a) zwischen Geweben gab, die vor oder nach der Euthanasie entnommen wurden. Allerdings sind die gemeldeten NADH-Werte in Rattenleber in postmortalen Proben deutlich höher (Abb. 6b). Es wurden keine Unterschiede bei den gesamten NAD(H)-Spiegeln (Abb. 6c) beobachtet, aber das NAD plus /NADH-Verhältnis war in den nach der Euthanasie entnommenen Geweben niedriger (Abb. 6d), was mit der beobachteten Variation der NADH-Spiegel übereinstimmt. NADP plus, NADPH und die Ergebnisse des NADP plus / NADPH-Verhältnisses in Rattenleber, gruppiert nach dem Zeitpunkt der Gewebeentnahme, sind in der ergänzenden Abbildung 9 dargestellt. Aufgrund der unzureichenden Anzahl postmortaler Proben ist es uns jedoch nicht möglich, die Auswirkung des Zeitpunkts der Gewebeentnahme auf die NADP(H)-Spiegel zu interpretieren. In der Mäuseleber gab es keinen Unterschied zwischen den NAD-Plus-Spiegeln vor und nach dem Tod, allerdings war die Anzahl der Berichtsstudien begrenzt (Abb. 6e). NEINNADH,NADP plus, oderNADPHPost-Mortem-Daten inMäuseleberstand zum Vergleich zur Verfügung.

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Diskussion

Viele neuere Studien haben gezeigt, dass die Regulierung von NAD(P)(H) für die zelluläre Homöostase und den Redoxstatus wesentlich ist. Von Nagetieren gewonnene Daten haben zu Studien geführt, in denen der NAD-Plus-Spiegel im menschlichen Blut als weniger invasiver Indikator für den NAD-Plus-Spiegel im gesamten Körper untersucht wurde. Jüngste klinische Studien haben gezeigt, dass die NAD plus-Spiegel bei Krankheitszuständen reduziert wurden23,47 und nach NAD plus-Boosting-Strategien erhöht wurden23,44,48,49. Wir haben eine Metaanalyse aller zwischen 1946 und 20. Juni 2021 veröffentlichten Studien durchgeführt, die quantitative Daten zu NAD(P)(H)-Spiegeln bei Säugetierarten enthielten, mit besonderem Schwerpunkt auf Mäusen, Ratten und Menschen, da diese am häufigsten vertreten sind untersuchte Arten im biomedizinischen Bereich. Diese Analyse wurde teilweise durchgeführt, um den mittleren Standardwert der NAD(P)(H)-Konzentrationen in normalen Säugetiergeweben zu bestimmen, angesichts der bekannten Varianz dieser Messungen zwischen den Studien. Wir hoffen, dass diese Daten dazu genutzt werden können, standardisierte Protokolle im Bereich der NAD-Plus-Forschung anzuregen und die Verwendung von NAD(P)(H)-Spiegeln und Redoxverhältnissen als zuverlässige Biomarker für Krankheiten und Behandlungsschemata zu fördern.

Trotz erheblicher Variabilität der Messwerte in den Geweben von Nagetieren zeigte diese Metaanalyse mit einigen Ausnahmen ähnliche mittlere NAD-Plus-Werte in allen Geweben. Interessanterweise wies die Skelettmuskulatur der Maus niedrigere mittlere NAD-Plus-Werte auf (Abb. 2a) als andere Gewebe mit hohem Stoffwechsel (z. B. Leber, Niere, Herz und Gehirn). Dies kann auf unterschiedliche NAD(H)-Redoxzustände in der Skelettmuskulatur hinweisen oder auf größere Probleme bei der Metabolitenextraktion in faserigen Geweben hinweisen. Allerdings konnten diese Beobachtungen beim Menschen nicht verifiziert werden, da es an Gewebeproben außerhalb von Blut und Muskeln mangelte.

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Es gibt viele potenzielle Faktoren, die die Genauigkeit physiologischer NAD(P)(H)-Messungen in Gewebeproben beeinflussen könnten. In allen Studien wurde beschrieben, dass Gewebe geerntet und direkt in flüssigen Stickstoff getaucht oder vor dem Einfrieren oder Verarbeiten auf Eis gehalten wurden, um die hitzeempfindlichen Fraktionen (NAD plus und NADP plus) zu konservieren. Der Einfluss des pH-Werts auf die verschiedenen NAD(P)(H)-Fraktionen, wie beispielsweise die säurelabile Natur der reduzierten NAD(P)H-Formen, hat in den meisten Studien zur Verwendung von pH-neutralen Extraktionslösungsmitteln geführt . Angesichts der schnellen gegenseitigen Umwandlung der reduzierten und oxidierten Metaboliten und der Wirkung von Anoxie auf NAD(H)50–53 ist es jedoch auch wichtig, eine schnelle Extraktion von Gewebemetaboliten und geeignete Verfahren zum Löschen von zellulärem NAD(P)(H) sicherzustellen )-Redox-/Verbrauchsenzyme, etwa durch Deproteinisierung. In diesem Sinne zeigt unsere Analyse der Gewebeentnahme vor und nach dem Tod, dass die Analyse nach dem Tod die Reduzierung von NAD plus begünstigt. Die Reduzierung von Gewebe-NAD plus wurde zuvor in vivo im Gehirn, im Herzen und in der Leber von Ratten beschrieben, die über einen Zeitraum von 2,5- Stunden einer hypoxischen Atmosphäre ausgesetzt waren54, einer Umgebung, die teilweise durch längere Post-5--Stunden rekapituliert werden kann. Opfern Sie die Gewebesammlung vor dem Einfrieren. Dies kann darauf hindeuten, dass die Gewebeentnahme unter Narkose oder die sofortige Entnahme von Geweben, die nach der Tötung für die Metabolitenanalyse verwendet werden sollen, priorisiert werden sollte, um repräsentative NAD(P)(H)-Messungen zu erhalten.

Es besteht auch das Potenzial, dass verschiedene Quantifizierungsmethoden, die jeweils unterschiedliche Einschränkungen haben, zur Gesamtvariabilität der NAD(P)(H)-Messungen innerhalb der Studie beitragen. In den letzten zwei Jahrzehnten waren Enzymzyklustests, LC-MS und HPLC die am häufigsten verwendeten Methoden. Jede dieser Methoden wird von Techniken zur Metabolitenextraktion, Quantifizierungsparametern und der Implementierung geeigneter Qualitätskontrollen beeinflusst. Mithilfe von LC-MS konnten Lu et al. haben gezeigt, dass die gegenseitige Umwandlung zwischen reduzierten und oxidierten Formen von NAD(P)(H)-Metaboliten in verschiedenen Extraktionspuffern oder Lösungsmitteln mit der Acetonitril:Methanol:Wasser-Mischung mit 0.1 M Ameisensäure unterschiedlich schnell erfolgt höchste Erholung mit den geringsten gegenseitigen Umwandlungen31. Bei Verwendung von LC-MS kann diese gegenseitige Umwandlung jedoch zwischen einzelnen Proben einer Studie durch Aufstocken mit internen Kontrollen wie NAD(P)(H)-Isotopen überwacht werden, was einen Vorteil der LC-MS-Technik gegenüber der von HPLC und Enzymen darstellt Radtests31,33,55. Dennoch können selbst bei gut kontrollierten LC-MS-Techniken verschiedene Faktoren das gemessene Signal stören, darunter Matrixeffekte und Schwankungen der Ionisationseffizienz. Beispielsweise verwenden einige Studien 13C-markierte Hefeextrakte als interne Standards in der LC-MS-basierten Metabolomik. Das Aufstocken der extrahierten Metabolitenmatrix der Probe mit einer 13C-markierten Hefeextrakt-Metabolitenmatrix kann jedoch verschiedene Folgen haben, wie z. B. eine Ionensuppression, die das Signal markierter und/oder unmarkierter Metaboliten reduziert, und andernfalls zu Fehlern bei der absoluten Quantifizierung führen kann durch eine gründliche Qualitätsbewertung festgestellt56. Obwohl LC-MS-Techniken theoretisch die Messung mehrerer NAD(P)(H)-Metaboliten in einem Experiment ermöglichen, gibt es dennoch Einschränkungen, da optimale Verdünnungen durchgeführt werden müssen, wenn die interessierenden Metaboliten große Konzentrationsunterschiede aufweisen. Trotz ihrer Vorteile gegenüber den einfacheren Enzymzyklustests macht die Komplexität der LC-MS-Methoden daher eine gründliche Optimierung erforderlich. Kürzlich wurden neue Analysemethoden wie NAD plus Biosensoren und bildbasierte Massenspektrometrie entwickelt, aber es liegen immer noch nicht genügend quantitative Daten aus diesen Techniken vor, um sie in eine Metaanalyse einzubeziehen. Allerdings wurde in einer in unsere Metaanalyse einbezogenen Studie ein papierbasierter Biolumineszenz-Biosensor verwendet, um den NAD-Plus-Spiegel in der Leber von Mäusen und anderen Probentypen zu messen57. Diese Studie wurde aufgrund der ähnlichen Nachweismethode in die Gruppe der Biolumineszenztests aufgenommen (Abb. 1a).

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Für den Zweck dieser Analyse wurden Daten aus 677 Studien ausgeschlossen. Dazu gehörten Studien, die eher relative NAD(P)(H)-Ergebnisse (51 Prozent) als quantitative lieferten, sowie Studien, in denen sich NAD(P)(H) konzentriertewurde nicht normalisiertGewebegewicht, Eiweißgehalt, oderBlut Volumen(13 Prozent). 36 Prozent der ausgeschlossenen Studien wurden an ungeeigneten Proben durchgeführt (z. B. Nicht-Säugetier-Probanden, Zell- oder Gewebekulturen). Über die ausgeschlossenen Studien hinaus gehören zu den Haupteinschränkungen dieser Metaanalyse die Variation oder das Fehlen gemeldeter Informationen im Zusammenhang mit präanalytischen Verfahren (Prä- oder Post-Mortem-Extraktion oder Extraktionspufferinformationen) und/oder den Analysemethoden mit Alter, Geschlecht, genetischem Hintergrund, Ernährung und Fütterungsstatus der Nagetiere.

Obwohl unsere Metaanalyse die Variabilität zwischen den Studien und die Notwendigkeit einer Standardisierung quantitativer NAD(P)(H)-Messungen hervorhebt, bewertet oder diskutiert unsere Analyse dies nichtGültigkeit der Vergleichsergebnisseinnerhalb einer Einzelstudie. Angesichts der Auswirkungen mehrerer NAD(P)(H)-Metaboliten, die als Biomarker dienenGesundheit beim Menschen, die Standardisierung oder gründliche Studienoptimierung von präanalytischen undanalytische Verfahrenwird ermöglichenbessere Vergleiche der Ergebnisse verschiedener Studien. Dies wird mit zunehmender Bedeutung noch wichtigerZahlreiche klinische Studien testen die Wirkung von Arzneimitteln oder Nahrungsergänzungsmitteln, die zur Veränderung des NAD(P)(H)-Spiegels im Gewebe eingesetzt werdendie Gesundheit des Menschen verbessern.

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Methoden

Literatur Suche. „Epub Ahead of Print“, „In-Process & Other Non-Indexed Citations“, „Versions“, „PubMed-Not-MEDLINE“, „Tägliche Aktualisierung“, „Wöchentliche Aktualisierung des vorderen Segments“, „Rückseiten von 1946 bis Anfang“. von vorneSegment“-Zitate zwischen 1946 und 20. Juni 2021 in der Datenbank MEDLINE ALL (Ovid) durchsucht undAuf Artikel überprüft, die quantitative Daten zu NAD(P)(H)-Metabolitenspiegeln in Säugetiergeweben enthaltenim Anhang S1 ausgekleidet. Die Suchabfragestrategie ergab 3377 Artikel. Eine zusätzliche blutfokussierte Suche warwurde unter Verwendung derselben Datenbank durchgeführt und ergab 1513 Artikel (Anhang S2).

Screening-Methodik. Abstracts und Titel, die über die Quantifizierung des NAD(P)(H)-Metaboliten in Geweben und Blut von Säugetieren berichten, wurden einem Volltext-Screening unterzogen. Alle Abstractrezensionen wurden durch eine Zweitrezension verifiziertund alle Konflikte wurden gelöst. Nach dem Abstract-Screening wurden 643 Publikationen für die Volltextprüfung ausgewähltdie gewebeorientierte Suche und 272 für die blutorientierte Suche (ergänzende Abbildung 10). Studien, die nur vorDie übermittelten relativen NAD(P)(H)-Metabolitendaten wurden beim Volltext-Screening ausgeschlossen, mit Ausnahme vonStudien, die über NAD berichtenPlus/NADH-Verhältnisse. Die Ergebnisse stammen ausschließlich aus Geweben, Zellen und isolierten Organellenin Medien oder aus Bluteluenten aus der Perfusion wurden ausgeschlossen. Diese Volltextprüfung führte zum Ausschluss von 667(457 plus 210) Artikel aufgrund fehlender NAD-Metabolitendaten (50,5 Prozent), abgeleitete Daten nicht geeignetProben (36,3 Prozent) oder Daten, die als relative/willkürliche Einheiten dargestellt werden (13,2 Prozent). Schließlich wurden 241 Artikel aufgenommender qualitativen Metaanalyse und 205 in der quantitativen Metaanalyse (Ergänzende Abbildung 10). Obwohl unsereDie erste Suche umfasste Studien, die von 1946 bis 20. Juni 2021 veröffentlicht wurden. Wie oben erwähnt, die älteste Studie mitquantitative NAD(P)(H)-Daten, die unsere Akzeptanzkriterien erfüllten, wurden 1961 veröffentlicht

Datenextraktion.

Numerische Daten für NAD(P)(H)-Metaboliten wurden entweder direkt aus den Artikeln erhalten oder mithilfe einer halbautomatischen Datenextraktionssoftware (WebPlotDigitizer58) aus Artikelzahlen extrahiert. Darüber hinaus wurden gegebenenfalls die Zeitpunkte der Gewebeentnahme in Bezug auf die Opferung und/oder die Methoden der Gewebe-/Blutentnahme (z. B. Methode der Anästhesie und/oder Euthanasie, Handhabung des Gewebes und Lagertemperatur) aufgezeichnet. Für Tiermodelle wurden die Art, Merkmale (z. B. Stamm, Genotyp, Alter und Gewicht) und Umweltbedingungen (z. B. Schlafzyklus, Art der Ernährung, Fütterungshäufigkeit und Fütterungszustand im Verhältnis zur Gewebeprobe) aufgezeichnet. Darüber hinaus wurden für alle Studien Behandlungen (z. B. pharmakologische Behandlungen, Operationen, Bestrahlung, Tumorinduktion und andere bei den Studienteilnehmern angewendete Verfahren) und alle Studiengruppeninformationen (z. B. Behandlungs- oder Krankheitsgruppen und entsprechende Kontrollen) extrahiert. Schließlich die Methode der NAD(P)(H)-Quantifizierung (z. B. enzymatische Assays, auf Massenspektrometrie basierend, HPLC, NMR, Biolumineszenz) und Publikationsspezifikationen (z. B. Titel der Veröffentlichung, Referenzcode [DOI, Medline UI, PMID] oder Hyperlink). und Jahr der Veröffentlichung) wurden notiert (Ergänzungsmaterial 2).

Datenanalyse. Vor der Analyse wurden alle Konzentrationen in nmol/g Gewebe bzw. nmol/g Proteine für Gewebeproben bzw. nmol/ml für Blutfraktionen umgerechnet. Aufgrund der geringen Anzahl an Ergebnissen, die auf den Proteingehalt normiert sind, zeigen wir nur Ergebnisse, die auf Gewebegewicht und Blutvolumen normiert sind. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism Version 9.3.1 (GraphPad Sofware Inc., San Diego, Kalifornien, USA) durchgeführt.DatenverfügbarkeitAlle während dieser Studie extrahierten und analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinem Zusatz enthaltenInformationsdateien.Eingegangen: 29. April 2022; Angenommen: 7. Februar 2023

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