MiR-214 verbessert Sepsis-induzierte akute Nierenschädigung durch PTEN/AKT/mTOR-regulierte Autophagie
Feb 28, 2022
Abstrakt. Frühere Studien haben gezeigt, dass oxidativer Stress und Autophagie zu akutenNierenschädigung (AKI) während der Sepsis und microRNA (miR)-214 spielt eine wichtige Rolle beim Schutz vonNierenoxidativem Stress ausgesetzt. Die vorliegende Studie zielte darauf ab, zu testen, ob der Renoschutz von miR-214 mit der Autophagie bei Sepsis zusammenhängt. Die Rolle der Autophagie wurde in einem Mausmodell der cecal Ligatur und Punktion (CLP) untersucht. Die umgekehrte transkriptionsquantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) wurde verwendet, um die Expression von miR-214 zu analysieren. Aufbau und Funktion vonNierenVon den Mäusen geerntet wurden, wurden ausgewertet.NiereAutophagiespiegel wurden mit immunhistochemischem, immunfluoreszierendem und westlichem Blotting nachgewiesen. Es wurde festgestellt, dass miR-214 AKI bei septischen Mäusen lindern könnte, indem es das Niveau vonNiereAutophagie. Darüber hinaus hemmte miR-214 die Autophagie, indem es die PTEN-Expression in derNiereGewebe von septischen Mäusen. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass miR-214 CLP-induzierte AKI verbesserte, indem es oxidativen Stress reduzierte und die Autophagie durch die Regulation des PTEN / AKT / mTOR-Signalwegs hemmte.
Schlüsselwörter:microRNA-214, Sepsis, akute Nierenschädigung, Autophagie, Nieren
Einleitung AkutNierenschädigung(AKI) ist eine der häufigsten Komplikationen der Sepsis und tritt bei 40-50% der septischen Patienten mit einer Sterblichkeitsrate von bis zu 60% auf (1). Die Pathogenese der Sepsis-induzierten AKI bleibt jedoch unklar. Es wurde berichtet, dass Autophagie eine Schlüsselrolle bei Sepsis-induzierten AKI spielt, und die Hemmung der Autophagie führt zur Entwicklung von AKI während der Sepsis (2,3). Frühere Studien (4,5) haben bestätigt, dass Sepsis die Autophagie in mehreren Organen auslöst, einschließlich derNiere(6) und autophagische Prozesse sind an der Entfernung von beschädigten Mitochondrien und oxidativem Stress beteiligt (7). Übermäßige Autophagie kann jedoch zu unerwünschtem und schädlichem Zelltod führen (8). Daher ist ein moderates Maß an Autophagie der Schlüssel zur Verringerung der Sepsis-induzierten AKI. Frühere Studien haben berichtet, dass miR-214 die durch Ischämie-Reperfusion induzierte AKI durch Hemmung der Apoptose verbessert (9) und miR-214 den oxidativen Stress in der diabetischen Nephropathie über den Signalweg der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) / AKT / mTOR unterdrückt (10). Die vorliegende Studie ergab, dass miR-214 die Sepsis-induzierte myokardiale Dysfunktion bei Mäusen durch Hemmung der Autophagie abschwächen kann (11). Ob miR-214 die Sepsis-induzierte AKI verbessern kann, muss jedoch noch geklärt werden. In der vorliegenden Studie wurde die Hypothese aufgestellt, dass miR-214 CLP-induzierte AKI abschwächt, indem es oxidativen Stress reduziert und die Autophagie durch die Regulation des PTEN/AKT/mTOR-Signalwegs hemmt.
CISTANCHE WIRD NIEREN- / NIERENERKRANKUNGEN VERBESSERN
Materialien und Methoden
Tiere.Insgesamt 100 männliche Kunming-Mäuse (Gewicht, 20,40±2,92 g; Alter, 6-8 Wochen), die vom Medical Laboratory Animal Centre der Hebei Medical University (Shijiazhuang, China) geliefert wurden, wurden in der vorliegenden Studie verwendet. Alle Mäuse wurden an einen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 24 ° C mit 50% Luftfeuchtigkeit gewöhnt und erhielten ≥ 1 Woche vor den Experimenten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Alle experimentellen Verfahren wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Institute of Health (NIH-Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1996) und der Genehmigung durch die Institutional Animal Care and Use Committees des Cangzhou Central Hospital (Genehmigung Nr. 2017-020-01) durchgeführt. Alle Operationen wurden unter Narkose durchgeführt und es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden zu minimieren.
Cecal Ligatur und Punktion (CLP).CLP wurde an Mäusen durchgeführt, um ein murines Sepsismodell zu erstellen, wie zuvor beschrieben (12). Nach der Betäubung durch Isofluran-Inhalation (induziert bei 3% und beibehalten bei 0,5%), wurde ein 1 cm Mittellinienschnitt geschnitten. Der freiliegende Blinddarm (1 cm Abstand vom Ende) wurde mit einer 23-Gauge-Nadel mit zwei Einstichen ligiert. Der Blinddarm extrudierte sanft eine kleine Menge Kot und wurde wieder in seine anatomische Position gebracht. Die Bauchdecke wurde mit einem 3:0-Seidengeflecht in Schichten vernäht. Nach dem Eingriff wurde 1 ml 0,9% Kochsalzlösung subkutan injiziert. Den Mäusen wurde nur freier Zugang zu Wasser gewährt. Scheinmodellmäuse wurden auf die gleiche Weise wie das CLP-Modell ohne CLP betrieben.
Versuchsplanung.Mäuse (n=6 für Scheinchirurgie und CLP) wurden nach dem Zufallsprinzip sieben Gruppen zugeordnet: Sham-Gruppe, CLP-Gruppe, Adenovirus (Ad)-grün fluoreszierendes Protein (GFP) + CLP-Gruppe, Ad-miR-214 + CLP-Gruppe, Anti-miR-214 + CLP-Gruppe, PTEN-Inhibitor + CLP-Gruppe und Ad-miR-214 + PTEN-Inhibitor + CLP-Gruppe. Die Mäuse der Sham-Gruppe wurden dem gleichen Verfahren ausgesetzt, jedoch ohne Ligatur und Punktion des Blinddarms. Mäuse in den anderen Gruppen erhielten cecal Ligatur und Perforation. Alle Mäuse wurden schnell durch Isofluran-Inhalation betäubt, um Blut, Urin undNiereProben 24 h nach der letzten Behandlung.
Adenovirus-vermitteltes Ad-miR-214, Anti-miR-214 oder Ad-GFPGentransfer in vivo und PTEN-Inhibitor-Injektion. Ad-miR-214, Anti-miR-214 oder Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) wurde 4 Tage vor CLP in die Bauchhöhle von Mäusen geliefert. Kurz gesagt, Mäuse wurden durch Isofluran-Inhalation betäubt. Ein Katheter, der 200 μl Adenovirus (2x1011 pfu, exprimierend miR-214, Anti-miR-214 oder Ad-GFP) enthielt, wurde normalen Mäusen durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Der PTEN-Inhibitor (VO-OHpic, intraperitoneal, Sigma-Aldrich; Merck KGaA) wurde CLP-Mäusen verabreicht, die Anti-miR-214 über intraperitoneale Injektion in einer Einzeldosis von 10 μg/kg 30 min vor der Verabreichung von Adenovirus erhalten hatten.
Beurteilung der Nierenfunktion. Blutproben wurden aus dem Herzen der Mäuse entnommen, gefolgt von einer Zentrifugation (bei Raumtemperatur für 15 min bei 3.000 x g) zur Sammlung von Serum. Die Serumspiegel von Blutharnstoffstickstoff (BUN) und Serumkreatinin (Cr) wurden mit einem automatischen Analysator Hitachi 7600 (Hitachi, Ltd.) bestimmt. ELISA wurde verwendet, um Ebenen vonNierenschädigungMolekül-1 (KIM-1; Kat.-Nr. RKM100; R&D Systems, Inc.) und neutrophiles Gelatinase-assoziiertes Lipocalin (NGAL; Kat.-Nr. DY3508; R&D Systems, Inc.) in Urinproben.
Assay für Serumentzündung Zytokin.Serum TNF-α (Kat.-Nr. H052) und IL-6 (Kat.-Nr. H007) wurden mit kommerziellen ELISA-Kits (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) nach Herstellerangaben untersucht.Messung von oxidativen Stressmarkern. Das entsprechende Assay-Kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) wurde verwendet, um die Malondialdehydspiegel (MDA) zu messen und die Aktivität der Superoxiddismutase (SOD) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu testen.
Histologie und tubuläre Verletzungsbewertung. Alle Mäuse wurdenNierePerfusion unter Narkose 24 h nach CLP. DasNiereDie Proben wurden in 4% Paraformaldehyd für 72 h bei 4 °C fixiert. Die Gewebeproben wurden dann in einer abgestuften Reihe von Ethanollösungen dehydriert, in Paraffin eingebettet und in 4-μm-Abschnitte geschnitten. Schnitte (4 μm) wurden mit einem Mikrotom geschnitten und die Gewebeschnitte mit Hämatoxylin (5 min) und Eosin (1 min) bei Raumtemperatur zur histologischen Untersuchung angefärbt. Die Objektträger wurden mit einem Mikroskop (BX51, Olympus Corporation) ausgewertet und bewertet.RenalGewebe mit den folgenden histopathologischen Veränderungen wurden als verletzt beurteilt: Verlust der Bürstengrenze, Vakuolisierung, Gipsbildung, tubuläre Dilatation und Störung, Zelllyse und zelluläre Nekrose. Gewebeschäden wurden verblindet überprüft und durch den Prozentsatz der beschädigten Tubuli bewertet: 0, kein Schaden; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75% (13).
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).FrischNierenwurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 1 mm Würfel geschnitten und nacheinander in 2,5% Glutaraldehyd für 24 h bei 4 ° C fixiert. Die Abschnitte wurden 2 h bei 4 °C in 1 % Osmiumtetroxid getaucht, in abgestuftes Ethanol dehydriert und in Epoxidharz eingebettet. Schließlich wurden die ultradünnen Schnitte (60 nm) bei 20°C für 60 min mit Uranylacetat und Bleicitrat doppelt angebeizt. Die Beobachtung wurde mit einem Transmissionselektronenmikroskop (Tecnai; Hitachi, Ltd.) bei 80 kV unter Verwendung des Elektronenmikroskopiefilms 4489 (ESTAR dicke Basis; Kodak).
Immunhistochemie (IHC).FrischNiereDie Gewebe wurden in 4% Paraformaldehyd (für 72 h bei 4°C) fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Proben wurden in 4 μm dicke Abschnitte geschnitten und in Xylol deparaffinisiert. Nachdem Gewebeschnitte mit PBS gewaschen wurden, wurden sie in 10 mM Citratpuffer (pH 6,0) für 4 min zur Antigengewinnung gekocht und dann mit 10% Ziegenserum in PBS bei Raumtemperatur für 1 h blockiert. Der primäre Antikörper (Anti-LC3B; 1:400; Kat.-Nr. 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) wurde gemäß den Anweisungen zugegeben und bei 4°C für 12 h inkubiert. Der sekundäre Antikörper (Ziegenantikaninchen HRP; 1:2.000; Kat.-Nr. BS13278; Bioworld Technology, Inc.) wurde zugegeben und bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert. DAB (100 μl) wurde zugegeben und für 5 min mit der unter einem Lichtmikroskop beobachteten Färbung (Modell CX31-P; Olympus Corporation). Die Intensität der positiven Färbung, die braun erschien, wurde mit der Bildanalysesoftware Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.) bestimmt. Die integrale optische Dichte (IOD) wurde berechnet, um die Intensität darzustellen. Die IOD-Werte stiegen mit zunehmender Proteinexpression.
Reverse Transkription-quantitativ(RT-q) PCR. Gesamt-RNA wurde extrahiert ausNierengewebenach der Induktion des Modells mit TRIzol-Reagenz (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Gemäß den Anweisungen des TaqMan Reverse Transcription Kits (Kat.-Nr. N8080234 Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), RNA wurde umgekehrt in cDNA transkribiert. Die folgenden Thermozyklusbedingungen wurden verwendet (miR-214): Anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 min; gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, Glühen bei 60 °C für 30 Sekunden und Dehnung bei 72 °C für 30 Sekunden. Die RT-qPCR wurde mit einem ABI Prism 7500 Sequence Detection System (PerkinElmer, Inc.) und einem Standard-SYBR Green PCR-Kit (Toyobo Life Science) durchgeführt. U6 wurde als interne Kontrolle für miR-214 verwendet. Die Primer-Sequenzen waren wie folgt: miR-214, vorwärts, 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' und umgekehrt, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, vorwärts, 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' und rückwärts, 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. Diese Erfahrungen wurden sechsmal repliziert. Die Ergebnisse wurden mit der 2-ΔΔCq-Methode analysiert (14). Die mRNA-Expressionsniveaus von LC3, p62, PTEN, AKT und mTOR wurden mittels RT-qPCR ausgewertet. Mit β-Actin als interner Referenz dieser Gene wurde das 2-ΔΔCq verwendet, um die relative Expression von Zielgenen zu messen. Die in Tabelle I gezeigten Primersequenzen wurden von Sangon Biotech Co., Ltd. synthetisiert.
Westliches Blotting. NiereGewebe wurde mit RIPA-Lysat (Beyotime Institute of Biotechnology) gemischt, um das Homogenat herzustellen, und die Lyse wurde gestoppt, wenn kein sichtbares Gewebe beobachtet wurde. Die Proben wurden bei 13.000 x g für 10 min bei -4 °C zentrifugiert und der Überstand für die Western Blot-Analyse gewonnen. Kurz gesagt, die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Mikro-BCA-Protein-Assay-Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.) bestimmt. Proteinproben (80 μg pro Probe) wurden durch Reduktion der 12%igen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese getrennt und dann über Nacht bei 4 °C auf Polyvinylidendifluoridmembranen übertragen. Getrennte Proteine wurden auf PVDF-Membranen übertragen. Nach dem Blockieren von 5% Magermilch bei Raumtemperatur für 2 h wurden die Membranen über Nacht (bei 4°C) mit primären Antikörpern inkubiert. Folgende primäre Antikörper (alle Cell Signaling Technology, Inc.) wurden verwendet: Lichtkette 3B (1:1.000; Kat.-Nr. 4412), p62 (1:1.000; Kat.-Nr. 4412), Anti-PTEN (1:1.000; Kat.-Nr. 9188), antiphosphoryliertes (p)-AKT (Ser473) (1:1.000; Kat.-Nr. 4060), Anti-AKT (1:1.000; Kat.-Nr. 9272), Anti-p-mTOR (Ser 2448) (1:1.000; Kat.-Nr. 5536), Anti-mTOR (1:1.000; Kat.-Nr. 2972) und β-Actin (1:2.000; Kat.-Nr. 4970). Nach dem Waschen wurden die Membranen (bei Raumtemperatur für 2 h) mit den HRP-konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern (1:3.000; Kat.-Nr. A0208; B. Beyotime Institut für Biotechnologie). Proteinbanden wurden mit Immobilon Western (MilliporeSigma) nachgewiesen und mit der Total-Lab TL120 Software analysiert (Nonlinear Dynamics, 2.01). Die Expression von Protein wurde auf β-Aktin normalisiert.
Statistische Analyse. Die statistische Analyse wurde mit dem GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.) durchgeführt. Alle Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung oder Mediane (Interquartilsbereiche) für kontinuierliche Variablen dargestellt, abhängig von ihren Verteilungen. Die Baseline-Merkmale und -Ergebnisse wurden unter Verwendung von Einweg-ANOVA verglichen, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test oder Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von Dunns Test, je nach Bedarf. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Befund
Zeitpunkt 24 h nach CLP. Frühere Studien haben berichtet (6,15,16), dass biochemische (d.h. LC3 und p62) Analysen zeigen, dass der Autophagiefluss mit Fortschreiten der Sepsis nach 6-8 h CLP unterdrückt wird. In der vorliegenden Studie ist die Anzahl der Autolysosomen in derNiereder CLP-behandelten Mäuse nahmen innerhalb von 24 Stunden nach der Operation zu. Darüber hinaus ist die Analyse von Markern vonNierenschädigungzeigte, dassNierenfunktionwurde 24 Stunden nach CLP am schwersten beschädigt. Daher wurde für die folgenden Experimente der Zeitpunkt 24 h nach CLP gewählt.
Regulatorische Wirkung auf miR-214 im Nierengewebe. Die RT-qPCR-Analyse wurde verwendet, um die miR-214-Expression in CLP-behandelten Mäusen nachzuweisen. Es wurde festgestellt, dass die miR-214-Expression in derNiereGewebe nach CLP-Operation 24 h, im Vergleich zur Scheingruppe (1,47-fach, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">NiereGewebe im Vergleich zur Scheingruppe (beide P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE WIRD NIEREN- / NIERENVERSAGEN VERBESSERN
Wirkung von miR-214 auf Nierenfunktionsstörungen bei septischen Mäusen.Alle Mäuse wurden geopfert, um Blut, Urin undNiereProben 24 h nach der CLP-Operation. BUN und Cr sind wichtige Indikatoren für den Schweregrad derrenalWertminderung (17). Darüber hinaus wurden NGAL und KIM-1 als spezifische Biomarker fürNierenschädigungund ihre erhöhte Expression ist mit frühenrenalSchlauchverletzung bei AKI (17). Wie in Abb. 2A-D gezeigt, waren die Spiegel von BUN, Cr, KIM-1 und NGAL nach einer CLP-Operation im Vergleich zur Scheingruppe signifikant erhöht. Ad-miR-214 senkte jedoch signifikant die BUN-, Cr-, KIM-1- und NGAL-Spiegel im Vergleich zur CLP-Gruppe (alle P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">NierenfunktionParameter. Nach der Vorbehandlung mit PTEN-Inhibitor wurden die Schutzwirkungen von Ad-miR-214 jedoch verstärkt. Die Ergebnisse zeigen, dass miR-214 die Nierenfunktionsstörung bei septischen Mäusen abschwächt.
Wirkung von miR-214 auf Nierenentzündungen und oxidativen Stress.Wie in Abb. 3A und B gezeigt, erhöhte CLP signifikant die Spiegel von TNF-α und IL-6, während Ad-miR-214 die Spiegel dieser Marker signifikant senkte. Im Vergleich zur
Wirkung von miR-214 auf die renale Autophagie bei septischen Mäusen.Die vorliegende Studie untersuchte die Veränderungen von LC3 inNiereGewebe über IHC-Färbung. Wie in Abb. 6 gezeigt, nahm die LC3-Intensität der positiven Färbung in der CLP-Gruppe im Vergleich zur Scheingruppe signifikant zu (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR-214 aktiviert den AKT/mTOR-Signalweg zur HemmungAutophagie durch Stummschalten von PTEN im Nierengewebe.Die Wirkung von CLP auf die Autophagie inNiereDas Gewebe wurde untersucht, indem die Konzentrationen von LC3-II/I und p62 beurteilt wurden. Der PTEN/AKT/mTOR-Signalweg spielt eine wichtige Rolle in der Autophagie (18). Um die Wirkung von miR-214 auf den PTEN-AKT/mTOR-Signalweg zu untersuchen, wurden die Proteinspiegel von LC3-II/I, p62, AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR und PTEN mittels Western Blotting und RT-qPCR analysiert. Wie in Abb. 7A-C gezeigt, tritt eine Modifikation in diesen Proteinen schnell auf, mit einer Erhöhung der Rate von LC3-II / LC3-I und einer Verringerung der p62-Spiegel (beide P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">NiereGewebe (beide P>0,05). Die beiden Indikatoren LC3-II/LC3-I und p62 wiesen keinen signifikanten Unterschied zwischen der Ad-miR-214-Gruppe, der PTEN-Inhibitorgruppe und der Ad-miR-214 + PTEN-Inhibitorgruppe (alle P>0,05) auf. Diese Ergebnisse zeigten, dass Autophagie durch CLP induziert wurde und die Überexpression von miR-214 sie teilweise hemmen konnte.
Wie in Abb. 7A und D-F gezeigt, ist der Ausdrucksgrad von PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">NiereGewebe (alle P>0,05). Es gab keinen signifikanten Unterschied in den oben genannten Indikatoren zwischen der Ad-miR-214-Gruppe, der PTEN-Inhibitorgruppe und der Ad-miR-214 + PTEN-Inhibitorgruppe (alle P>0,05). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CLP induziertNiereGewebeautophagie durch Hemmung des AKT/mTOR-Signalwegs. Ad-miR-214 aktivierte den AKT/mTOR-Signalweg durch Stummschalten von PTEN inNiereGewebe. Im Vergleich zur CLP-Gruppe hemmte Anti-miR-214 jedoch die Expression von mTOR nicht signifikant. Daher wurde die RT-qPCR weiter verwendet, um die Expression von mRNA von Genen zu bestimmen, die mit dem PTEN/AKT/mTOR-Signalweg zusammenhängen. Nach den Ergebnissen der RT-qPCR (Abb. 8) waren im Vergleich zur Sham-Gruppe die mRNA-Expressionsspiegel von p62, LC3 und PTEN deutlich erhöht, während die mRNA-Expression von AKT und mTOR in der CLP-Gruppe erniedrigt war. Im Vergleich zur CLP-Gruppe, der Ad-miR-214, PTEN
Inhibitor- und Ad-miR-214 + PTEN-Inhibitorgruppen zeigten eine verminderte mRNA-Expression von LC3 und PTEN, aber eine erhöhte mRNA-Expression von p62, AKT und mTOR (alle P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0,05). Daher kann die Wirkung von p62 auf die Autophagie eher auf der transkriptionellen Ebene als auf der posttranskriptionellen Ebene auftreten. Die aktuellen Ergebnisse zeigten, dass miR-214 die Expression von PTEN herunterreguliert und den AKT/mTOR-Signalweg aktiviert.
Diskussion
Die vorliegende Studie ergab, dass eine übermäßige Autophagie schädlich fürNierenfunktionbei septischen Mäusen. Frühere Studien haben gezeigt, dass miR-214 mit erhöhter Proliferation, Metastasierung, Invasion und Funktionen als Onkogen für Zellen und Gewebe assoziiert ist (19-22). Studien berichten, dass miR-214 eine schützende Rolle gegen AKI spielt, indem es Apoptose, oxidativen Stress abschwächt und Entzündungsfaktoren herunterreguliert (21, 23). Die vorliegende Studie untersuchte die Mechanismen, die der schützenden Wirkung von miR-214 auf Sepsis-induzierte AKI zugrunde liegen, indem sie sich auf die mögliche Beteiligung von miR-214 an der Modulation der Autophagie konzentrierte. Die Ergebnisse zeigten, dass oxidativer Stress in derNierenach der Verabreichung der CLP-Operation. In der Zwischenzeit erfolgt die Aktivierung der Autophagie in derNiere.Erhöhtes LC3 II/I und die Reduktion von p62 in derNierewurde nach der Behandlung mit CLP-Operation beobachtet. Wie erwartet, schwächte sich die Überexpression von miR-214 signifikant ab.Nierepathologische Verletzungen undNiereDysfunktion, die durch Sepsis verursacht wird. Die Hemmung von miR-214 zeigte jedoch eine entgegengesetzte Tendenz zum Renoprotection. Zusätzlich wurde die Schutzwirkung von Ad-miR-214 durch PTEN-Inhibitor verstärkt.
In einer SeptikNiere, übermäßige Inflflammation wird von massiven Steigerungen der Produktion von ROS begleitet und eine große Anzahl von ROS löst Veränderungen in der mitochondrialen Struktur aus und beeinträchtigt die mitochondriale Funktion, was dazu führt, dass der Körper in einen Teufelskreis eintritt, der sich verschlimmertNiereSchaden (24,25). Daher kann oxidativer Stress einer der wichtigsten pathologischen Mechanismen der Sepsis-induzierten AKI sein. Die vorliegende Studie lieferte weitere Hinweise auf übermäßigen oxidativen Stress, der durch eine erhöhte MDA-Produktion und eine verminderte SOD-Aktivität in derNiereGewebe nach CLP-Operation. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Überexpression von miR-214 dieNieregegen CLP-induzierte oxidative Verletzungen, die an der autophagen Hemmung beteiligt sind. Dies steht im Einklang mit den früheren Studien, dass miR-214 verschiedene Zellen und Gewebe vor oxidativem Stress schützt (26,27).
Autophagie dient als "zweischneidiges Schwert" bei der Entwicklung von Sepsis: Die basale Autophagie kann schützende Wirkungen ausüben, indem sie toxische oxidative Proteine entfernt, aber eine übermäßige Autophagie kann unter starkem Stress, wie dem ROS-Ausbruch, zum autophagen Zelltod führen (28, 29). Es wurde gezeigt, dass die Autophagie zunächst bei Sepsis aktiviert wird, gefolgt von einer nachfolgenden Phase der Dysfunktion aufgrund des autophagen Zelltods (30), die die Sepsis-induzierte oxidative Verletzung verschlimmert. In der vorliegenden Studie zeigte der PTEN-Inhibitor oder die Überexpression von miR-214 eine antioxidative Renoprotection bei CLP-behandelten Mäusen. Die Hemmung von miR-214 zeigte jedoch eine entgegengesetzte Tendenz zur antioxidativen Renoprotektion. So kann übermäßige oder unzureichende Autophagie verursachenNierenschäden; Beide sind maladaptiv und provozieren schließlich den Zelltod. Daher ist die Aufrechterhaltung eines moderaten Maßes an Autophagie der Schlüssel zur Abschwächung oxidativer Verletzungen in septischen Erkrankungen.
CISTANCHE VERBESSERT NIEREN- / NIERENSCHMERZEN
Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass miR-214 die Autophagie in verschiedenen Zellen und Geweben hemmt (31-33). In der vorliegenden Studie wurde festgestellt, dass die Überexpression von miR-214 die CLP-induzierte Autophagie inNierengewebe,wie die Veränderungen der Proteinmarker wie LC3-II/I und p62 zeigen. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass eine Überexpression von miR-214 die CLP-induzierte oxidative Verletzung abschwächte, indem sie eine übermäßige Autophagie hemmte. Die vorliegende Studie untersuchte auch die molekularen Mechanismen, durch die miR-214 moduliertNiereAutophagie bei Sepsis-induzierter AKI. PTEN/AKT/mTOR ist ein wichtiger Signalweg, der regeltNiereAutophagie (34,35) und die eine Schlüsselrolle bei Sepsis-induzierten AKI spielt, und PTEN ist ein negativer Inhibitor des PI3K/AKT/mTOR-Signalwegs. Frühere Studien berichteten, dass miR-214 die Autophagie über den PI3K/AKT/mTOR-Signalweg in verschiedenen Modellen regulieren kann (36-38). Ma et al (39) fanden heraus, dass miR-214 die Autophagie in diabetischen Nieren herunterregulieren kann. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Auswirkungen von miR-214 auf CLP-induzierte AKI an der Regulation des PTEN/AKT/mTOR-Signalwegs beteiligt sein könnten. Insbesondere zeigten die Ergebnisse der vorliegenden Studie, dass die CLP-Operation die PTEN-Spiegel signifikant erhöhte, aber die Spiegel von p-AKT und p-mTOR senkte, was darauf hindeutet, dass die CLP-Operation den AKT/mTOR-Signalweg inaktivierte. Darüber hinaus aktivierte die Überexpression von miR-214 den AKT/mTOR-Signalweg durch die Stilllegung von PTEN in CLP-induzierter Autophagie inNiereGewebe. Anti-miR-214 hemmte jedoch nicht signifikant die Expression von mTOR in westlichen Blot-Analysen. So wurde die RT-qPCR weiter verwendet, um die Expression von mRNA von Genen zu bestimmen, die mit dem PTEN/AKT/mTOR-Signalweg zusammenhängen. Die vorliegende Studie identifizierte, dass miR-214 die Expression von PTEN herunterregulierte und den AKT/mTOR-Signalweg aktivierte, um die Autophagie zu hemmen. Es sollten jedoch weitere erschöpfende Studien durchgeführt werden, um zusätzliche Einzelheiten über den Mechanismus derNiereAutophagie im septischen Zustand.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der vorliegenden Studie darauf hindeuten, dass miR-214 eine schützende Rolle gegen Sepsis-induzierteNierenschädigungdurch Reduzierung von oxidativem Stress und Hemmung der Autophagie durch Regulation des PTEN/AKT/mTOR-Signalweges. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass miR-214 ein potenzielles therapeutisches Ziel für Sepsis-induzierte AKI sein könnte. Die vorliegende Studie verwendete jedoch Mäuse, die 6-8 Wochen alt waren, so dass weitere Forschung über den Mechanismus von miR-214 bei erwachsenen Mäusen erforderlich ist.