Molekulare Klonierung und biochemische Charakterisierung einer neuen Cumarin-Glycosyltransferase CtUGT1 aus Cistanche Tubulosa

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Xiping Xu, et al

ABSTRAKT

UDP-Glykosyltransferasen (UGTs) sind eine wichtige und funktionell vielfältige Familie von Enzymen, die an der Biosynthese von Sekundärmetaboliten beteiligt sind. Cumarin ist eines der häufigsten Grundgerüste von Naturstoffen mit potenziellen pharmakologischen Aktivitäten. Bisher haben jedoch viele berichtete GTs aus Pflanzen hauptsächlich Flavonoide als Zuckerakzeptoren erkannt. Nur begrenzte GTs konnten die Glykosylierung von Cumarinen katalysieren. In dieser Studie wurde ein neues UGT aus geklontCistanche tubulosa, ein wertvolles traditionelles chinesisches Stärkungsmittel, das reich an verschiedenen Glykosiden wie Phenylethanoidglykosiden, Lignanglykosiden und Iridoidglykosiden ist. Sequenzalignment und phylogenetische Analyse zeigten diesCtUGT1ist phylogenetisch von den meisten der beschriebenen Flavonoid-UGTs entfernt und benachbart zu Phenylpropanoid-UGTs. Umfangreiche In-vitro-Enzymtests ergaben, dass dies jedoch der Fall istCtUGT1waren nicht an der Biosynthese von bioaktiven Glykosiden beteiligtCistanche tubulosakonnte es die Glucosylierung der Cumarine Umbelliferon 1, Esculetin 2 und Hymecromon 3 in beträchtlicher Ausbeute katalysieren. Die glykosylierten Produkte wurden durch Vergleich mit Referenzstandards oder NMR-Spektroskopie identifiziert, und die Ergebnisse zeigten dies anCtUGT1kann die Glucosylierung von Hydroxycumarinen an der C7--OH-Position regiospezifisch katalysieren. Die wichtigsten Rückstände, die bestimmtCtUGT1's Aktivitäten wurden basierend auf Homologiemodellierung und molekularen Docking-Analysen weiter diskutiert. In Kombination mit den Ergebnissen der ortsgerichteten Mutagenese wurde festgestellt, dass H19 als entscheidende Katalysebasis eine unersetzliche Rolle spielte.CtUGT1könnte bei der enzymatischen Herstellung von bioaktiven Cumaringlycosiden verwendet werden.

Schlüsselwörter:Pflanzenglykosyltransferasen, Cumaringlykoside,Cistanche tubulosa, Homologiemodellierung, ortsgerichtete Mutagenese

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Einführung

Die Glykosylierung ist eine der häufigsten Arten der Strukturmodifikation von sekundären Naturstoffen. Die Glykosylierung könnte die Stabilität und/oder Löslichkeit des Aglycons verändern und aufgrund der multiplen Konjugationstypen viel zur Vielfalt natürlicher/unnatürlicher Produkte beitragen. In Pflanzen wurden diese Reaktionen normalerweise von Uridindiphosphat (UDP)-abhängigen Glykosyltransferasen (UGTs) durchgeführt, einer Art von Enzymen, die die Übertragung von Monosaccharideinheiten von aktiviertem Nukleotidzucker auf ein Glykosylakzeptormolekül katalysieren, das ein Kohlenhydrat, Glykosid oder Oligosaccharid sein kann , oder ein Polysaccharid [1,2]

Bis heute wurden viele Gene, die UGTs codieren, aus mehreren Pflanzen isoliert [3]. Die Glykosylierung erfolgte hauptsächlich an Hydroxylgruppen oder Carboxylgruppen einer Vielzahl von Folgeprodukten, wie Flavonoiden [4], Phenylpropanoiden [5], Terpenoiden [6], Steroiden [7], Alkaloiden [8] usw. Cumarine sind Metabolite von Phenylpropanoiden, die in vielen Pflanzenarten weit verbreitet sind. Natürlich vorkommende Cumarine liegen oft als Glykokonjugate vor, und diese Derivate zeigten ein breites Spektrum pharmakologischer Aktivitäten, einschließlich Antioxidans [9], antiviral [10,11], hepatoprotektiv [12], entzündungshemmend [13], krebshemmend [14]. ], antimutagene [15] und Cholinesterase (ChE) & Monoaminooxidase (MAO) hemmende Aktivitäten [14,15], etc. Allerdings waren bisher im Vergleich zu den am häufigsten berichteten und ausführlich untersuchten Flavonoid-UGTs nur begrenzte UGTs berichteten über die Fähigkeit, die Zuckereinheit auf Cumarine zu übertragen [16–18].

Pflanzen, die reich an verschiedenen Glykosiden sind, könnten als idealer Genpool für UGTs mit neuartigen Katalyseaktivitäten dienen. Darüber hinaus wurde von zahlreichen UGTs berichtet, dass sie eine beträchtliche Akzeptor-Promiskuität besitzen, um die Glykosylierung mehrerer Substrate zu katalysieren, von denen einige in den Pflanzen sogar nicht getrennt wurden [19]. In diesem Artikel wird eine neue Glykosyltransferase beschriebenCtUGT1wurde aus identifiziertCistanche tubulosa, ein traditionelles Heilkraut, das reich an verschiedenen Glykosiden wie Phenylethanoidglykosiden (PhGs), Lignanglykosiden und Iridoidglykosiden ist. Heterologe Expression und Funktionscharakterisierung zeigten, dass obwohl rekombinantCtUGT1war nicht an der Biosynthese dieser Glykoside beteiligtCistanche tubulosa, kann es die Glucosylierung von Hydroxycumarinen katalysieren, und die Reaktion, die regiospezifisch an der 7- OH-Position der Cumarine stattfindet, ist Umbelliferon 1, eskalierend 2 und Hymecromon 3, um drei pharmakologisch aktive Verbindungen zu erzeugen, Skimming (1a), Cichoriin (2a) bzw. 4-Methylumbelliferylglucosid (3a) mit beträchtlicher Ausbeute. Darüber hinaus könnten auch das Benzophenon-Substrat 4,4'-Dihydroxybenzophenon (4), das Isoflavon-Substrat Genistein (5) und das Anthrachinon-Substrat Aloe-Emodin (6) akzeptiert werdenCtUGT1. Die katalytischen Eigenschaften und Schlüsselreste unterstreichen die Katalysefähigkeit vonCtUGT1wurden auch basierend auf Homologiemodellierung, AutoDock-Analyse und ortsgerichteter Mutagenese bewertet.

2. Experimentell

2.1. Pflanzenmaterial und Chemikalien

Cistanche tubulosaDas in dieser Studie verwendete Material wurde in Wüstengebieten in Hetian, autonomen Regionen Xinjiang, gesammelt. Ihre botanische Identität wurde von Professor Pengfei Tu an der Peking-Universität bestätigt. Die getesteten Cumarine und andere Substrate in dieser Studie wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), Chengdu Push Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, China) und Chengdu Biopurify Phytochemicals Co., Ltd. (Chengdu, China) bezogen ) wenn nicht anders angegeben. Referenzstandards von Skimming (1a) und Cichoriin (2a) wurden von Wuhan Chem Faces Biochemical Co., Ltd. (Wuhan, China) bezogen.

2.2. Molekulare Klonierung von CtUGT1 aus Cistanche tubulosa

Die Gesamt-RNA vonCistanche tubulosawurde unter Verwendung eines OMEGA Plant RNA Kits (GA, USA) aus dem fleischigen Stamm extrahiert und mit dem PrimeScript™ RT-Reagenzkit (TaKaRa, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA revers transkribiert. Ein degenerierter Primer wurde für 3'RACE entworfen, basierend auf den Aminosäuresequenzen in der konservierten PSPG (Plant Secondary Product Glycosyltransferases)-Box von Pflanzen-Glycosyltransferasen. Die 3′-Ende- und 5′-Ende-Verstärkungen vonCtUGT1wurden unter Verwendung des Smart RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers unter Verwendung von Primern durchgeführt (Tabelle S1). Die vollständige cDNA derCtUGT1wurde durch PCR unter Verwendung von KOD-Plus Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Japan) mit genspezifischen Primerpaaren (Tabelle S1) unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: ein anfänglicher Denaturierungsschritt bei 94 °C für 2 min, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen bei 98 ◦C für 15 s, Tempern bei 55 ◦C für 30 s und Verlängerung bei 68 ◦C für 55 s, mit einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 68 ◦C für 7 min. Alle erhaltenen DNA-Fragmente wurden in einen pEASY-Blunt-Vektor (TransGen Biotech, China) kloniert und sequenziert.

2.3. Sequenzalignment und phylogenetische Analyse

Sequenzausrichtung vonCtUGT1mit gemeldeten Glykosyltransferasen (Tabelle S2) wurde unter Verwendung des DNAMAN 4.0-Softwarepakets (Lynnon Biosoft, Kanada) durchgeführt. Die Motive und Domänen wurden mit einem Conserved-Domain-Tool (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) analysiert. Der phylogenetische Baum wurde durch Bootstrapping der Software MEGA 7.0.14 unter Verwendung der Neighbor-Joining-Methode mit 1000 Bootstrap-Replikaten erstellt [20]. Die translatierte Proteinsequenz vonCtUGT1wurde mit den bekannten pflanzlichen Glycosyltransferasen abgeglichen, die in der NCBI GenBank-Datenbank (Tabelle S3) mit ClustalW hinterlegt sind.

2.4. Heterologe Expression und Proteinreinigung von CtUGT1 in Escherichia coli

Die codierende Region vonCtUGT1wurde mit BamH I und Not I als Restriktionsstellen unter Verwendung der in Tabelle S1 gezeigten Primer amplifiziert. PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von KOD-Plus-Neo-DNA-Polymerase (TOYOBO, Osaka, Japan) durchgeführt. Die erhaltenen Sequenzen wurden durch Klonierung in den Vektor pEASY-Blunt (TransGen Biotech, China) verifiziert. Das bestätigte Amplifikationsprodukt vonCtUGT1wurde anschließend verdaut und in den Expressionsvektor pET-28a(plus) (Novagen, USA) subkloniert. Das verifizierte Konstrukt wurde dann in E. coli Transetta (DE3) transformiert, um den rekombinanten Stamm zu erhalten. Über Nacht wurde eine Kultur des rekombinanten Stamms in Luria-Bertani (LB)-Medium inokuliert, das 5 0 ug⋅mL − 1 Kanamycin und 40 ug⋅mL − 1 Chloromycetin in einem Verhältnis von 1:1 enthielt{{ 19}}0. Die Kulturen wurden bei 37 °C und 200 U/min gezüchtet, bis der OD600-Wert 0,4–0,6 erreichte. Anschließend wurde Isopropyl- -D-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben und die Zellen 16 h bei 18 °C und 180 U/min gezüchtet. Dann wurden Zellpellets durch Zentrifugation (7600 × g, 10 min, 4 °C) geerntet und in 3 ml/g gekühltem Lysepuffer (ergänzende Datenanmerkung 1) resuspendiert und durch Beschallung auf Eis aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch etwa 30-minütige Zentrifugation bei 7600 × g, 4 °C entfernt. Für die Affinitätschromatographie wurde eine voräquilibrierte Histrap-Säule (GE Healthcare, Uppsala, Schweden) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Das rekombinante Protein wurde mit 10 Säulenvolumina Elutionspuffer (Ergänzende Datenanmerkung 1) mit 250 mM Imidazol eluiert. Die Proteinreinheit wurde durch 10 % SDS-PAGE analysiert. Das gereinigte Protein wurde mit einem 30-kDa-Ultrafiltrationsröhrchen (Sigma-Aldrich, USA) konzentriert und mit einer PD-10-Säule (GE Healthcare, Uppsala, Schweden) mit Entsalzungspuffer entsalzt (Ergänzende Daten Anmerkung 1). Die Proteinkonzentration wurde durch das Bradford-Verfahren unter Verwendung von BSA als Standard bestimmt.

2.5. Enzymatische Aktivitätsassays und Substratspezifität von CtUGT1

Zur Untersuchung der Glykosylierungsaktivität vonCtUGT1wurden Enzymtests in einem Reaktionsgemisch (150 μl) durchgeführt, das aus 0,4 mM Aglycon, 0,8 mM UDP-Glucose (UDPG) und 50 ug gereinigter Substanz bestandCtUGT1Protein im Entsalzungspuffer. Alle Reaktionen wurden bei 30 ◦C für 12 h inkubiert und durch Zugabe von 300 μl kaltem Methanol beendet. Die Mischungen wurden bei 15,000 × g für 30 min zentrifugiert, um den Überstand für HPLC-UV/ESI-MS-Analysen zu sammeln. Für jede Reaktion wurden routinemäßig drei parallele Assays durchgeführt. HPLC (Agilent 1260, USA) wurde mit einem Diodenarray-Detektor und einer CAPCELL PAK C18-Säule (250 mm × 4,6 mm, 5 μm; Shiseido, Japan) bei einer Flussrate von 1 ml⋅min−1 und der Säulentemperatur ausgestattet wurde bei 30 ◦C gehalten. Die mobile Phase bestand aus A (dh 0,1-prozentige wässrige Ameisensäurelösung) und B (dh Acetonitril). Die Gradientenprogramme wurden in Tabelle S4 aufgeführt. HRESI-MS-Daten wurden auf einem LCMS-IT-TOF-System aufgezeichnet, das mit einer ESI-Schnittstelle (Shimadzu, Kyoto, Japan) mit ultrahochreinem He als Kollisionsgas und N2 als Zerstäubungsgas ausgestattet war. Die optimierten ESI-Quellenparameter waren wie folgt: Sheathgas-Flussrate, 1,5 ml⋅min–1; Hilfsgasflussrate, 1,5 mL⋅min− 1; Sprühspannung 4,5 kV; Kapillartemperatur, 200 ◦C. Die Spektren wurden im Bereich von 100–1500 m/z für eine Full-Scan-MS-Analyse aufgenommen.

2.6. Auswirkungen von Reaktionszeit, pH-Wert und Temperatur auf die Enzymaktivität und kinetische Studien von CtUGT1

Auswirkungen von Reaktionszeit, pH-Wert und Temperatur auf die Enzymaktivität vonCtUGT1wurden unter Verwendung von UDPG als Zuckerdonor und 3 als Zuckerakzeptor unter den oben beschriebenen Reaktionsbedingungen getestet. Zur Bestimmung des optimalen pH-Werts wurde die Enzymaktivität in 100 mM Puffer (Zitronensäure-Natriumcitrat) mit pH-Werten im Bereich von 3,0 bis 6,{{} verglichen. 14}}, 10{{20}} mM Puffer (KH2PO4-K2HPO4) mit pH-Werten im Bereich von 6,0 bis 8,{{29} }, 100 mM Puffer (Tris-HCl) mit pH-Werten im Bereich von 7,0 bis 9,0, 100 mM Puffer (Na2CO3-NaHCO3) mit pH-Werten im Bereich von 9,0 bis 11,0. Um die optimale Reaktionstemperatur zu testen, wurden die Reaktionen bei verschiedenen Temperaturen im Bereich von 0 bis 65 °C inkubiert. Die Zeitverläufe der Reaktion wurden zu 12 verschiedenen Zeitpunkten zwischen 0 und 24 h ausgewertet. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die Reaktionsmischungen wurden wie oben beschrieben durch HPLC-MS analysiert. Für kinetische Studien vonCtUGT1wurden enzymatische Assays in einem Endvolumen von 100 ul durchgeführt, das 100 mM KH2PO4-K2HPO4-Puffer (pH 8,0), 25 ug gereinigt enthieltCtUGT1, 3 mM UDPG und variierenden Konzentrationen (50–3000 μM) von 3. Die Reaktionen wurden 30 min lang bei 37 °C durchgeführt und dann mit 100 μl eiskaltem Methanol beendet. Alle diese Reaktionen wurden dreifach durchgeführt, und die Enzymaktivität wurde durch Quantifizierung der entsprechenden glucosylierten Derivate bewertet. Kinetische Parameter, einschließlich der Michaelis-Menten-Konstante (Km) und Vmax, wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse unter Verwendung der GraphPad Prism 5-Software berechnet.

2.7. Substrat- und Zuckerdonorselektivität von CtUGT1

Um die Substratpräferenzen von zu erkundenCtUGT1wurden insgesamt 27 Substrate unterschiedlicher Strukturtypen unter Verwendung von UDPG als Donor getestet. Ihre chemischen Informationen sind in Tabelle S5 aufgelistet, und ihre Strukturen sind in Abb. S1 und S2. Zur Untersuchung der Selektivität von ZuckerspendernCtUGT1wurden Assays unter Verwendung von Umbelliferon (1), Esculetin (2), Hymecromon (3), 4,4′-Dihydroxybenzophenon (4), Genistein (5) und Aloe-Emodin (6) als Substrate mit UDPG, UDP- N-Acetylgalactosamin, UDP-Galactose, GDP-Mannose, GDP-Fucose, UDP-Galacturonsäure bzw. UDP-Rhamnose als Zuckerdonoren. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die Reaktionsmischungen wurden wie oben beschrieben durch HPLC-MS analysiert.

2.8. Herstellung von 4-Methylumbelliferylglucosid (Verbindung 3a) durch CtUGT1

Die präparative Reaktionsmischung bestand aus {{0}},034 mmol Substratverbindung 3, 0,04 mmol UDPG, 5 mg gereinigtCtUGT1in 50 mL Reaktionspuffer. Die Reaktionen wurden bei optimalen Bedingungen (100 mM KH2PO4-K2HPO4 mit pH 8,0; 37 ◦C) leicht gerührt. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C wurde der Reaktionsüberstand durch Säulenchromatographie mit makroporösem Harz (MCI GEL CHP) nach 30-minütiger Zentrifugation bei 12 000 × g getrennt. Die mobile Phase war eine Gradientenelution von 100 % Wasser zu 100 % Methanol. Jede Fraktion wurde durch HPLC-UV analysiert. Fraktionen, die nur Zielprodukte enthielten, wurden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und durch 1 H-kernmagnetische Resonanz(NMR)-Spektroskopie und 13 C-NMR-Spektroskopie charakterisiert.

2.9. Molekulares Docking und ortsgerichtete Mutagenese von CtUGT1

Das Proteinmodell vonCtUGT1wurde unter Verwendung von SWISS-MODEL [21–25] ermittelt. Als Templatstruktur wurde die Kristallstruktur der Medicago truncatula Glycosyltransferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) gewählt [26]. Das etablierte Modell wurde von VERIFY-3D [27,28] bewertet. Auto-Dock Vina wurde für molekulare Docking-Studien verwendet [29]. Die Kristallstruktur von UGT74F2 [30], einer Glykosyltransferase aus Arabidopsis thaliana, im Komplex mit dem Liganden UDP und Salicylsäure (PDB ID 5U6M) wurde als Kontrollstruktur für die Zuckerdonortaschen- bzw. Zuckerakzeptortaschenanalyse verwendet . Die Auto-Dock-Tools 1.5.6 der MGLTools (Molecular Graphics Laboratory Tools) wurden verwendet, um den Zuckerdonor UDPG und Substrat 1, 2 für das molekulare Docking vorzubereiten. Die Seitenketten der Reste um die Kavität des aktiven Zentrums herum wurden flexibel eingestellt, und die drehbaren Bindungen der Liganden konnten sich frei drehen. Die Pose mit der höchsten (kcat/mol)-Affinität, beurteilt nach dem Vina-Docking-Modell, wurde einer visuellen Analyse unter Verwendung der PyMOL 2.0-Software unterzogen.

Für Mutageneseuntersuchungen wurde das sequenzoptimierte Gen vonCtUGT1(Ergänzende Daten Anmerkung 2) wurde als Wildtyp synthetisiert und getestet. Ortsgerichtete Mutagenese derCtUGT1wurde unter Verwendung des Fast Mutagenese Systems (TransGen Biotech) durchgeführt. Die Mutanten wurden aus der Matrize des optimierten Gens amplifiziert, das unter Verwendung der in Tabelle S1 gezeigten spezifischen Primer in den pET-28a-Vektor konstruiert wurde. Die konstruierten Mutanten wurden durch PCR und Sequenzierung verifiziert, bevor sie zur heterologen Expression in E. coli (DE3) transformiert wurden. Proteinreinigung und Enzymreaktionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt und analysiert.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Vollständige cDNA-Klonierung des CtUGT1-Gens ausCistanche tubulosa

Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) ist ein traditionelles chinesisches Heilkraut, das eine Vielzahl bioaktiver natürlicher Glykoside produziert. Es sollte eine beträchtliche Anzahl neuer Glycosyltransferase-Gene geben, die in seinem Genom existierten. Um nach neuen Glykosyltransferasen mit interessanten Katalyseaktivitäten zu suchen, wurde basierend auf dem konservierten PSPG-Motiv ein degenerierter Primer für 3′-RACE entworfen, um permissive UGTs daraus zu klonierenCistanche tubulosa. Die erhaltene 3'-Endsequenz wurde weiter durch NCBI-Blast analysiert und der spezifische Primer für 5'-RACE wurde basierend auf der erhaltenen Sequenz entworfen. Die amplifizierten 5'-cDNA-Enden und 3'-cDNA-Enden wurden gespleißt und die volle Länge derCtUGT1Sequenz, einschließlich 1739 Nukleotiden, wurde erhalten (Abb. S3) und in Anmerkung 3 zu den ergänzenden Daten aufgeführt. Anschließend wurde ein offener Leserahmen (ORF) vonCtUGT1wurde durch NCBI ORF Finder-Tools gefunden und die 1482 bp lange codierende Sequenz wurde erfolgreich durch RT-PCR-Amplifikation unter Verwendung spezifischer Primer in Tabelle S1 kloniert. Die cDNA-Sequenz von CtUGT1 wurde beim NCBI eingereicht (Zugangsnummer MW629113).

3.2. Sequenzanalyse und heterologe Expression von CtUGT1

DasCtUGT1Es wurde erwartet, dass das Gen ein Protein aus 493 Aminosäureresten mit einer geschätzten Molekülmasse von 55,78 kDa kodiert. NCBI-Explosion ergab, dass die abgeleitete Proteinsequenz vonCtUGT1teilt die höchste Identität (76,39 Prozent) mit UGT86A1--ähnlichen Enzymen. Die biochemischen Funktionen dieser Art von Enzymen wurden noch nicht vollständig charakterisiert. Es wird vorhergesagt, dass sie an der Pflanzenanpassung an abiotischen Stress beteiligt sein könnten. Das Alignment der Aminosäuresequenzen von CtUGT1 und anderen pflanzlichen Glykosyltransferasen ist in Abb. S4 gezeigt.

Die hochkonservierten 44 Reste des PSPG-Motivs wurden am C-Terminus von gefundenCtUGT1. Innerhalb der PSPG-Box war an der 373. Aminosäure eine Peptidsequenz von HCGWNS lokalisiert, die in 95 Prozent aller Glykosyltransferasen nachgewiesen wurde [31]. Der letzte Rest des PSPG-Motivs war Glutamin, was darauf hinweist, dass dieses Enzym dazu neigt, UDPG als seinen Zuckerdonor zu verwenden [32] (Abb. S4). Der Stammbaum wurde basierend auf den vorhergesagten Polypeptidsequenzen von konstruiertCtUGT1und verschiedene Arten von Glycosyltransferasen pflanzlichen Ursprungs, die an der Biosynthese verschiedener sekundärer Metaboliten beteiligt waren. Bisher erkannten die meisten der beschriebenen Glykosyltransferasen aus Pflanzen Flavonoide als ihre Substrate, wie z Chalcon-Glycosyltransferasen. Das zeigten phylogenetische AnalyseergebnisseCtUGT1hat sich nicht in die Gruppe der Flavonoid-GTs eingruppiert. Stattdessen befindet es sich neben UGT74T1 und UGT74S1 (Lignan-Glykosyltransferasen aus Linum usitatissimum) und NtGT2 (einer Cumarin-Glykosyltransferase aus Nicotiana tabacum), was darauf hinweistCtUGT1möglicherweise einige neue katalytische Aktivitäten gegenüber Phenylpropanoid-Substraten (Abb. 1), insbesondere wenn man bedenkt, dass nur begrenzte Mitglieder funktionell identifiziert wurden, die zu diesen Kladen gehören.

Um seine katalytische Aktivität weiter aufzuzeigen, dieCtUGT1Sequenz wurde unter der Kontrolle des T7 lac-Promotors in E. coli Transetta (DE3)-Zellen als His6--markiertes Fusionsprotein exprimiert. Die His-markierte RekombinanteCtUGT1wurde durch Ni-NTA-Affinitätschromatographie effizient bis zur Homogenität gereinigt. Das Molekulargewicht des gereinigten rekombinanten CtUGT1 betrug ungefähr 55 kDa (Abb. S5), was mit der vorhergesagten Molekülmasse übereinstimmt.

3.3. In-vitro-Akzeptorsubstratspezifität von CtUGT1

Um die Glykosylierungsaktivität von zu testenCtUGT1wurden enzymatische In-vitro-Assays durchgeführt. Als Zuckerspender wurde UDPG verwendet. Zuckerakzeptoren wurden basierend auf unterschiedlichen Bedenken ausgewählt. Erstens dieCtUGT1Gen wurde geklontCistanche tubulosaderen chemische Hauptbestandteile PhGs sind. Um zu überprüfen, obCtUGT1ist an der Biosynthese von PhGs, den gemeinsamen Aglykonen von PhGs, beteiligtCistanche tubulosaAls Substrate wurden zunächst Tyrosol (NP1, Abb. S2) und Salidrosid (NP2, Abb. S2) ausgewählt. Leider fanden HPLC- und HRESI-MS-Analysen keine glykosylierten Produkte, was darauf hindeuteteCtUGT1möglicherweise nicht an der Biosynthese von PhGs beteiligt.

Zweitens, basierend auf den Ergebnissen der Sequenzausrichtung und der phylogenetischen Analyse (Abb. 1),CtUGT1war phylogenetisch mit Lignanoid- und Cumarin-Glycosyltransferasen verwandt, was darauf hindeuteteCtUGT1ist wahrscheinlich eine Phenylpropanoid-Glykosyltransferase. Um diese Vorhersage zu verifizieren, wurden die drei Cumarin-Substrate 1, 2 und 3 zusammen mit dem Lignanoid-Substrat Magnolol NP17 als Zuckerakzeptoren getestet. Als Negativkontrolle wurden hitzeinaktivierte Enzyme (100 °C, 10 min) verwendet. Die HPLC-HRESI-MS-Analyse von Reaktionen unter Verwendung von NP17 als Substrat fand kein Produkt. Im Gegensatz,CtUGT1zeigten offensichtliche Glucosylierungsfähigkeiten gegenüber den getesteten Cumarinsubstraten (1,2,3). Unter Verwendung von Substrat 1 als Beispiel, wie in Fig. 2A gezeigt, wurde ein neuer Peak (1a) mit einer verringerten Retentionszeit (11,46 min) im Vergleich zu der von Substrat 1 (19,75 min) erzeugtCtUGT1bei einer Rendite von 37,78 Prozent . Sein UV-Absorptionsspektrum entspricht 1. Das HRESI-MS-Spektrum zeigte, dass Peak 1a ein [M plus H]-Plus bei m/z 325,1029 und ein [M plus Na]-Plus bei m/z 347,0710 (berechnet 347,0737 für C15H16O8Na) aufwies ) mit der vorhergesagten Formel von C15H16O8, die 162 amu größer war als die von 1 und mit der theoretischen Formel eines glucosylierten Produkts übereinstimmte (Fig. 2A). In ähnlicher Weise wurde auch das glucosylierte Produkt von Substrat 2 (14,21 min, Fig. 2B) und 3 (21,92 min, Fig. 2C) bei der Retentionszeit von 10,85 min und 13,80 min mit einer Umwandlungsrate von 22,03 Prozent und 68,67 Prozent gefunden , beziehungsweise. Die Molekülmasse der Produkte stimmte genau mit der berechneten Masse der glukosylierten Produkte überein, was dies bestätigteCtUGT1konnten die Glucosylierung der Cumarinverbindungen 1–3 katalysieren (Tabelle 1).

In Anbetracht der Tatsache, dass die meisten der kürzlich beschriebenen Enzyme in vitro Katalysepromiskuität aufwiesen, sollte das Substratspektrum von anschließend weiter untersucht werdenCtUGT1wurden ausgedehnte Enzymassays mit verschiedenen Verbindungen durchgeführt, die zu verschiedenen Arten von Naturprodukten gehören, darunter Flavonoide, Phenolverbindungen, Cumarine, Stilben, Anthrachinone, Benzophenon, Naphthalin und Iridoid (Abb. S1-S2), wobei UDPG als verwendet wurde der Zuckerspender. Es wurde festgestellt, dass das Benzophenon-Substrat 4,4′-Dihydroxybenzophenon (4), das Isoflavon-Substrat Genistein (5) und das Anthrachinon-Substrat Aloe-Emodin (6) ebenfalls katalysiert werden konntenCtUGT1um das entsprechende glucosylierte Produkt 4a, 5a, 6a mit höherer Polarität zu bilden (Fig. 3). Die HRESI-MS-Analyse zeigte, dass die Ionenpeaks der Produkte alle 162 amu größer waren als die der Substrate, was darauf hindeutetCtUGT1könnten die Glucosylierung dieser Verbindungen katalysieren, um ihr entsprechendes Monoglucosidprodukt zu bilden. Die Umwandlungsraten von 4, 5 und 6 betrugen 4,12 Prozent, 14,14 Prozent bzw. 23,33 Prozent (Tabelle 1).

Die Zuckerdonorselektivität vonCtUGT1wurde ebenfalls erkundet. Zusätzlich zu UDPG wurden sechs weitere Donoren, darunter UDP-N-Acetylgalactosamin, UDP-Galactose, GDP-Mannose, GDP-Fucose, UDP-Galacturonsäure und UDP-Rhamnose, unter Verwendung der Substrate 1–6 als Akzeptoren getestet. Das zeigten die ErgebnisseCtUGT1ausschließlich ausgewähltes UDPG als Zuckerspender. Beim Testen anderer aktivierter Zucker wurde kein Produkt beobachtet (Daten nicht gezeigt).

3.4. Biochemische Eigenschaften und kinetische Parameter von CtUGT1

Biochemische Eigenschaften vonCtUGT1wurden unter Verwendung von 3 als Zuckerakzeptor und UDPG als Zuckerdonor untersucht, wie in Fig. 4 angegeben. KatalyseaktivitätCtUGT1wurde in einem Temperaturbereich von 4–60 ◦C getestet, die optimale Aktivität wurde bei 37 ◦C nachgewiesen (Abb. 4A). Die Analyse der Enzymaktivität zwischen pH 3,0 und 9,0 zeigte, dass der optimale pH-Wert bei pH 8,0 beobachtet wurde (100 mM Puffer KH2PO4-K2HPO4, Fig. 4C). Die Ausbeute des Glucosylierungsprodukts 3a stieg innerhalb von 1 h linear an und die Wachstumsrate flachte nach 5 h ab (Fig. 4B). Der scheinbare Km-Wert vonCtUGT1für 3 war 218,7 ± 7,176 μM und Vmax war 0.02255 ± 0,0001796 nmol⋅min− 1⋅ug− 1.

3.5. Enzymatische Präparation und strukturelle Identifizierung von glucosylierten Produkten

Basierend auf den Ergebnissen der Enzymtests,CtUGT1neigt dazu, eine spezifische Glucosyltransferase zu sein, die die Glucosylierung verschiedener Arten von Naturprodukten katalysieren könnte. HPLC-HR-MS-Informationen der Produkte sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Darunter zeigten Cumarine-Substrate eine beträchtliche Umwandlungsrate. Die Enzymaktivität gegenüber Cumarinen wurde weiter analysiert. Zu beachten ist, dass alle drei getesteten Cumarin-Substrate von akzeptiert werdenCtUGT1haben eine Hydroxylgruppe an der C-7-Position, während Aesculetin (2) eine zusätzliche Hydroxylgruppe an der C-6-Position hat. Das HPLC-Profil des glucosylierten Produkts von Aesculetin ist in Fig. 2 gezeigt. Es wurde nur ein einziges Produkt beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Glucosylierungsreaktion regiospezifisch an der C-6- oder C-7-Position stattfand. Um die Glykosylierungsstelle zu bestätigen, wurde Produkt 2a durch Vergleich mit den authentischen Glukosiden durch HPLC-UV/HRESI-MS-Analyse identifiziert. Bei Zugabe des authentischen Glucosids Cichoriin (glucosyliert an der 7-OH-Position von 2) in das Reaktionssystem überlappte der Peak mit 2a, Co-HPLC-Profil bestätigte weiter, dass das glykosylierte Produkt von 2 durch katalysiert wurdeCtUGT1ist Cichoriin [33], was bewies, dass die Glucosyleinheit spezifisch auf die C7-OH-Position übertragen wurde. Produkt 1a wurde auch durch Vergleich mit dem Referenzstandard identifiziert. UV-HPLC-Spektren zusammen mit Co-HPLC-Analyse (Abb. 2) zeigten, dass die chemische Struktur von 1a Skimming zugeschrieben wurde [34], das das glucosylierte Produkt von 1 an der C7-OH-Position ist.

Produkt 3a wurde aus einer großmaßstäblichen Reaktion hergestellt und durch HRESI-MS, 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektroskopie strukturell charakterisiert (Abb. S13, S14 und Anmerkung 4). Im 1H-NMR-Signal verschwand im Vergleich zu Substrat 3 ein phenolisches Hydroxylsignal an der C{{10}}-Position, und das Kohlenstoffsignal von C-7 verschob sich um δ 1.{{25} } ppm ins hohe Feld, während die C-6- und C-8-Signale im 13C-NMR zum niedrigen Feld verschoben sind. Diese Befunde bestätigten, dass der Glucopyranosylrest an die phenolische Hydroxylgruppe an der C-7-Position von 3 gebunden war [35]. Außerdem zeigte das 1H-NMR-Spektrum anomere Protonensignale bei δH 5,00 (1H, d, J=7,0 Hz); die Zuckerkomponente wurde als -D-Glucopyranose angegeben. Dieses Ergebnis demonstriertCtUGT1ist eine Cumarin-O-Glucosyltransferase, die die Glucosylierung von Hydroxycumarin an der 7-OH-Position katalysiert.

3.6. Homologiemodellierung, molekulares Docking und ortsgerichtete Mutagenese des CtUGT1-Proteins

Das haben umfangreiche Enzymreaktionen ergebenCtUGT1konnte die Glucosylierung von drei Cumarinen zu ihrem entsprechenden glucosylierten Produkt katalysieren, und die glucosylierte Position trat spezifisch an der 7- OH-Position auf. Identifizierung der Schlüsselreste, die die Katalyseaktivitäten von bestimmt habenCtUGT1, Homologiemodellierung, molekulares Docking und ortsgerichtete Mutageneseuntersuchungen von CtUGT1 wurden durchgeführt. Homologe molekulare Modellierung für CtUGT1 wurde unter Verwendung von SWISS-MODEL [21–25] etabliert. Als Templatstruktur wurde die Kristallstruktur der Medicago truncatula Glycosyltransferase UGT85H2 (PDB ID 2PQ6), bestimmt mit einer Auflösung von 2,1 Å, die den höchsten Gesamtscore bei maximaler Sequenzhomologie und niedrigem E-Wert aufwies, gewählt [26]. Die Rationalitätsbewertung des etablierten Modells wurde im Ramachandran-Plot (Abb. S6) gezeigt, 88,5 Prozent der Reste im etablierten Modell befinden sich in der am meisten bevorzugten Region. Das Homologiemodell von CtUGT1 besteht aus zwei ähnlichen Faltungsmotiven vom Rossmann-Typ am N- bzw. C-Terminus (Fig. 5A). Die N-terminale Domäne hat siebensträngige parallele Blätter um zehn Helices herum. Die C-terminale Domäne enthält sechssträngige Blätter, die von neun Helices flankiert werden (Fig. 5A, S7).

Zur weiteren Verdeutlichung der aktiven Tasche vonCtUGT1wurde molekulares Andocken durchgeführt. Da UGT85H2 nur die Apo-Form-Struktur aufweist, wurde ein anderes Homolog UGT74F2 mit sowohl UDP als auch Salicylsäure als zwei Liganden als Kontrollmatrize ausgewählt. Als Zuckerspender wurde das UDPG präpariert. Als Zuckerakzeptoren wurden jeweils zwei Cumarinsubstrate 1 und 2 hergestellt. Die Bindungsstellen von Glykosyl-Donor und -Akzeptor wurden separat berechnet und angedockt, wie in Abb. 5 gezeigt. Die Ergebnisse zeigten, dass sich beide der beiden Bindungstaschen innerhalb der tiefen Spalte im Interaktionsbereich der dicht gepackten N-Terminus-Domäne und C befinden -Terminusdomäne vonCtUGT1und räumlich nahe beieinander (Abb. 5A). Der C-Terminus vonCtUGT1ist hauptsächlich am Kontakt mit dem Glykosyldonor beteiligt, wie in den UGTs anderer Pflanzen beschrieben, und die meisten der umgebenden Reste sind hydrophil und hoch konserviert. Wie die typische PSPG-Box könnte der Rest W377 in diesem Motiv Wasserstoffbindungen mit der Glucosegruppe von UDPG bilden (Fig. 5B); N378 und S379 in diesem Motiv könnten Wasserstoffbrückenbindungen mit der Diphosphatgruppe von UDPG bilden (Fig. 5B). Darüber hinaus können gemäß den Docking-Ergebnissen Reste von W356 und Q359 mit der Uridingruppe durch Wasserstoffbindungswechselwirkung interagieren, um den Donor in der aktiven Tasche zu stabilisieren. Um die Funktion dieser vorhergesagten Schlüsselreste zu verifizieren, wurden insgesamt 16 Stellen ausgewählt und einer Alanin-Scanning-Mutagenese unterzogen. Die katalytischen Aktivitäten dieser Mutanten wurden unter Verwendung aller sechs oben erwähnten positiven Substrate getestet. HPLC-Analysen zeigten, dass, wenn Reste von G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397 und D398 zu Alanin mutiert wurden, die Glykosylierungsaktivität des Proteins war gegenüber allen getesteten Substraten völlig verloren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die obigen 16 Reste die Schlüsselreste sind, die die Bindung des UDPG-Donors und die Glykosylierungsaktivität von bestimmenCtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 Prozent) wie V14, V132, E153, T212 und I209 (Abb. S8). Es wird vorhergesagt, dass diese hydrophoben Reste, die den aromatischen Ring umgeben, Van-der-Waals-Wechselwirkungen mit dem Substrat in der Bindungstasche bilden könnten.

4. Diskussion

Die Glykosylierung ist einer der wichtigsten Modifikationsschritte in vielen Biosynthesewegen von Sekundärmetaboliten. Die Glykosylierung könnte die Bioverfügbarkeit von Naturstoffen erhöhen, indem sie ihre Wasserlöslichkeit verbessert und ihre Toxizität verringert. Cumarin gilt als die einfachste Form innerhalb einer riesigen Klasse natürlich vorkommender phenolischer Substanzen, die aus einem mit einem Benzolring kondensierten Pyronring aufgebaut sind. Sowohl natürliche als auch synthetische Verbindungen auf Cumarinbasis haben aufgrund ihrer vielfältigen pharmakologischen und biologischen Eigenschaften viel Aufmerksamkeit von medizinischen Chemikern und Arzneimitteldesignern auf sich gezogen [36]. Eine weitere glykosylierte Modifikation von Cumarinen könnte dazu beitragen, die strukturelle Vielfalt dieser Verbindungen zu bereichern und auch ihre Löslichkeit und Bioverfügbarkeit zu verbessern. In Pflanzen wird ein solcher Glykosylierungsprozess durch UDP-Glykosyltransferase katalysiert. Obwohl mehrere UGTs aus verschiedenen Pflanzen identifiziert wurden, waren bis heute die meisten der berichteten UGTs an der glykosylierten Modifikation von Flavonoiden beteiligt. Es wurde berichtet, dass nur begrenzte UGTs Cumarine als Substrate akzeptieren können. In dieser Studie ein neues Glycosyltransferase-GenCtUGT1wurde aus dem traditionellen chinesischen Kraut geklontCistanche tubulosa. Sequenzalignment und phylogenetische Analyseergebnisse zeigten diesCtUGT1ist phylogenetisch von den meisten der beschriebenen Flavonoid-UGTs entfernt und den Phenylpropanoid-UGTs sehr ähnlich. Umfangreiche Enzymtests zeigten, dass CtUGT1 die Glykosylierung von Phenylethanolverbindungen zur Bildung von PhGs, dem chemischen Hauptbestandteil von, nicht katalysieren konnteCistanche tubulosa. Stattdessen könnte es Cumarine als seine Substrate erkennen und die Glykosylierungsreaktion durchführen. Die Strukturaufklärung der Produkte zeigte, dass die Glykosylierungsstelle durch katalysiert wirdCtUGT1geschah regiospezifisch an der C7-OH-Position von Cumarinen. Unter Verwendung von CtUGT1 wurden drei Cumarin-Glykoside einschließlich Skimming (1a), Cichoriin (2a) und 4--Methylumbelliferyl-Glucosid (3a) erfolgreich enzymatisch synthetisiert und strukturell identifiziert. Alle diese drei Verbindungen wurden als pharmazeutisch aktive Moleküle beschrieben. Beispielsweise wurde angenommen, dass 1a verschiedene pharmakologische Aktivitäten besitzt, einschließlich renoprotektiver Aktivität, entzündungshemmender, krebshemmender und antiamöbischer Eigenschaften [37]. 2a zeigte eine hohe antibakterielle Aktivität gegen einige grampositive Bakterien wie Bacillus cereus und Staphylococcus aureus [38]. 3a kann den Pflanzen helfen, ihre Reaktionsfähigkeit gegenüber Chemikalien und Toxinen zu verbessern [39].

Neben Cumarinen fanden umfangreiche Enzymtests diesCtUGT1zeigten auch eine beobachtbare Glucosylierungsaktivität gegenüber Benzophenon-Substrat 4, Isoflavon-Substrat 5 und Anthrachinon-Substrat 6, was darauf hinweist, dass CtUGT1 eine gewisse Substrattoleranz aufweist. Nichtsdestotrotz,CtUGT1konnte die Biosynthese von Glykosidbestandteilen nicht katalysierenCistanche tubulosawie Phenylethanoidglykoside (PhGs), Lignanoidglykoside und Iridoidglykoside. Außerdem wurden nach den bisherigen Untersuchungen keine Cumarin-Glykoside isoliertCistanche tubulosa. Also, die in vivo-Funktion vonCtUGT1muss noch weiter erforscht werden. Die Glucosylierungsaktivität von CtUGT1 gegenüber Cumarinsubstraten macht dieses Enzym zu einem nützlichen Werkzeug für die enzymatische Glycosylierungsmodifikation von Cumarinen und weist auch darauf hin, dass Enzyme des sekundären Stoffwechsels von Pflanzen unschätzbare katalytische Aktivitäten ausführen könnten, die weit über ihre natürlichen Funktionen hinausgehen.

Erklärung konkurrierender Interessen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Wissen

Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der Beijing Natural Science Foundation (Grant Nr. 7192112); Young Elite Scientists Sponsorship Program von CAST (Grant No. CACM− 2018− QNRC1− 02); National Natural Science Foundation of China (Grant-Nr. 81402809); Staatlicher Stipendienfonds des China Scholarship Council (Grant Nr. 201906555010) und Science Foundation for Elite Young Scholars of Beijing University of Chinese Medicine (Grant Nr. 2018-JYB-XJQ006).

Anhang A. Ergänzende Daten

Ergänzende Daten zu diesem Artikel finden Sie online unter https://doi. org/10.1016/j.fitote.2021.104995.

Aus: ' Molecular cloning and biochemical characterization of a new cumarin glycosyltransferaseCtUGT1ausCistanche tubulosa' durchXiping Xu, et al

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

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