MTHFD2 ist ein metabolischer Kontrollpunkt, der das Schicksal und die Funktion von Effektoren und regulatorischen T-Zellen steuert

Grafische Zusammenfassung

Autoren :

Ayaka Sugiura, Gabriela Andrejeva, Kelsey Voss, ..., Ashutosh K. Mangalam, Joshua D. Rabinowitz, Jeffrey C. Rathmell

Korrespondenz:

jeff.rathmell@vumc.org

In Kürze :

Die Nukleotidsynthese ist erforderlich, um eine schnelle T-Zell-Proliferation zu unterstützen. Sugiura et al. zeigen, dass der Purinstoffwechsel de novo eine direkte Differenzierung und Funktion von T-Zellen signalisiert, und identifizieren MTHFD2 als metabolischen Kontrollpunkt und therapeutisches Ziel für entzündliche Erkrankungen.

Höhepunkte

• MTHFD2 ist entscheidend für aktivierte CD4-T-Zellen, um die De-novo-Purinsynthese aufrechtzuerhalten

• Unzureichendes MTHFD2 fördert Treg-zellähnliche Phänotypen und Metabolismus in Th17-Zellen. d Die Hemmung von MTHFD2 unterdrückt die mTORC1-Signalgebung und verändert die Histonmethylierung

• MTHFD2 kann gezielt eingesetzt werden, um in vivo vor Entzündungen und Autoimmunität zu schützen

MTHFD2 ist ein metabolischer Kontrollpunkt, der das Schicksal und die Funktion von Effektoren und regulatorischen T-Zellen kontrolliert

Ayaka Sugiura,¹Gabriela Andrejewa,¹Kelsey Voß,¹Darren R. Heintzman,¹Xincheng Xu,⁵Matthew Z. Madden,¹Xiang Ye,¹Katherine L. Beier,¹Nowrin U. Chowdhury,²Melissa M. Wolf,²Arissa C. Young,¹Dalton L. Greenwood,¹Allison E. Sewell,¹Shailesh K. Shahi,³Samantha N. Freedman,³Alanna M. Cameron,⁴Patrik Förch,⁴Tim Bourne,⁴Juan C. Garcia-Canaveras,⁵John Karijolich,¹Dawn C. Newcomb,²Ashutosh K. Mangalam,³Joshua D. Rabinowitz,⁵und Jeffrey C. Rathmell^1,6,*

¹Vanderbilt Center for Immunobiology, Abteilung für Pathologie, Mikrobiologie und Immunologie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, USA

²Medizinische Abteilung, Abteilung für Hämatologie und Onkologie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, USA

³Institut für Pathologie, University of Iowa, Iowa City, IA 52242, USA

⁴Sitryx Therapeutics Limited, Magdalen Centre, Oxford Science Park, Oxford, Vereinigtes Königreich

⁵Department of Chemistry, Ludwig Cancer Research Institute Princeton Branch, Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, Princeton, NJ 08544, USA6Lead contact

*Korrespondenz: jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

ZUSAMMENFASSUNG

Die antigene Stimulation fördert die metabolische Reprogrammierung der T-Zellen, um den erhöhten biosynthetischen, bioenergetischen und signalgebenden Anforderungen gerecht zu werden. Wir zeigen, dass das Stoffwechselenzym Methylentetrahydrofolat-Dehydrogenase 2 (MTHFD2) mit einem Kohlenstoff (1C) die de novo-Purinsynthese und die Signalübertragung in aktivierten T-Zellen reguliert, um die Proliferation und die Produktion von entzündlichen Zytokinen zu fördern. In pathogenen T-Helfer--17 (Th17)-Zellen verhinderte MTHFD2 eine fehlerhafte Hochregulation des Transkriptionsfaktors FoxP3 zusammen mit dem unangemessenen Anstieg der Unterdrückungskapazität. MTHFD2-Mangel förderte auch die regulatorische T (Treg)-Zelldifferenzierung. Mechanistisch führte die Hemmung von MTHFD2 zu einer Verarmung der Purinpools, einer Akkumulation von Zwischenprodukten der Purinbiosynthese und einer verringerten mTORC1-Signalübertragung des Nährstoffsensors. MTHFD2 war auch entscheidend für die Regulierung der DNA- und Histonmethylierung in Th17-Zellen. Wichtig ist, dass der MTHFD2-Mangel die Schwere der Erkrankung in mehreren in vivo-Entzündungskrankheitsmodellen reduzierte. MTHFD2 ist daher ein metabolischer Kontrollpunkt, um den Purinstoffwechsel mit der Signalübertragung von pathogenen Effektorzellen zu integrieren, und ist ein potenzielles therapeutisches Ziel innerhalb von 1C-Stoffwechselwegen.

EINLEITUNG

Eine wirksame Mobilisierung der adaptiven Immunantwort erfordert eine robuste Aktivierung von CD4 plus T-Zellen, um ein schnelles Zellwachstum und eine schnelle Zellproliferation zu durchlaufen. Dies beinhaltet eine metabolische Umprogrammierung, angetrieben durch den Nährstoffsensor mTORC1, von einem katabolischen Ruhezustand in einen anabolen Wachstumszustand mit erhöhten Anforderungen an Biosynthese, Bioenergetik und Signalisierung. Abhängig vom Zytokin-Milieu differenzieren sich CD4 plus T-Zellen in Effektor- sowie regulatorische Untergruppen, die unterschiedliche metabolische Programme haben, die ihre Effektorfunktionen steuern (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Das Gleichgewicht dieser Untergruppen ist entscheidend für eine normale Immunität und verhindert gleichzeitig entzündliche und Autoimmunerkrankungen. Zum Beispiel ist Multiple Sklerose (MS) durch vermehrte Interleukin-17 (IL- 17)-produzierende T-Helfer-17 (Th17)-Zellen und verminderte oder unwirksame supprimierende regulatorische T (Treg)-Zellen gekennzeichnet (Dendrou et al., 2015). Die Ausrichtung auf die spezifischen Stoffwechselprogramme dieser T-Zell-Untergruppen bietet einen alternativen Ansatz zur Immuntherapie.

Die auf dem Zellstoffwechsel basierende Therapie begann 1948, als gezeigt wurde, dass Anti-Folat-Chemotherapeutika bei Kindern mit akuter lymphoblastischer Leukämie wirksam sind (Farber et al., 1948). Folat trägt zum Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel (1C) für die Purinbiosynthese, die Bildung von Methyldonatoren und die Aufrechterhaltung des zellulären Redoxgleichgewichts bei (Ducker und Rabinowitz, 2017; Yang und Vousden, 2016). Viele Medikamente, darunter Methotrexat (MTX), Fluorouracil (5-FU) und Mercaptopurin (6-MP), wurden seitdem entwickelt, um auf diesen Signalweg abzuzielen. Schnell proliferierende Zellen, einschließlich Krebszellen und aktivierte T-Zellen, sind von diesen Wegen zur Synthese von DNA und RNA abhängig. MTX wird weiterhin häufig zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis (RA) eingesetzt (Brown et al., 2016). Aufgrund der breiten Expression der Zielenzyme sind diese Therapeutika jedoch mit häufigen und potenziell schweren Nebenwirkungen verbunden. Die Identifizierung metabolischer Enzymziele, die in interessierenden Zellpopulationen selektiv wichtig sind, könnte zur Entwicklung sichererer und wirksamerer Immuntherapien führen.

Der 1C-Stoffwechsel umfasst die Folat- und Methioninzyklen mit Übertragung einzelner Kohlenstoffeinheiten. Serin dient als 1C-Donor zur Aktivierung von Tetrahydrofolat (THF) zu 5,10-MethylenTHF bei gleichzeitiger Glycinproduktion. 5,10-MethylenTHF kann dann unter Verwendung von NAD(P) oxidiert werden, um den Purinvorläufer 10-FormylTHF zu erzeugen. Alternativ kann 10-FormylTHF aus Formiat und THF ATP-abhängig synthetisiert werden. Im zytosolischen Weg wird die 10--FormylTHF-Produktion durch die Methylen-THF-Dehydrogenase 1 (MTHFD1) vermittelt. Der Verlust von MTHFD1 verhungert die Zellen für zytosolisches 10--FormylTHF, wodurch die Purin-Biosynthesekapazität verringert wird, und Mutationen in MTHFD1 verursachen einen schweren kombinierten Immundefekt (SCID) (Field et al., 2015). Der mitochondriale Weg beruht auf mitochondrialem MTHFD2 und MTHFD1--like (MTHFD1L).

Abbildung 1. 1C-Metabolismus und MTHFD2 werden in aktiviertem CD4 hochreguliert^PlusT-Zellen und im Zusammenhang mit EAE

(A) Änderung der Nukleotidstoffwechselspezies in in-vitro-differenziertem CD4^PlusT-Zell-Untergruppen verglichen mit naiven Zellen, gemessen durch Massenspektrometrie (n=3 biologische Replikate).

(B) Workflow für gezieltes CRISPR-Screening im In-vivo-Lungenentzündungsmodell.

(C) Änderung der gRNA-Häufigkeit aus dem 1C-Stoffwechsel-gerichteten In-vivo-CRISPR-Screening in primärem CD4^PlusT-Zellen (statistische Analyse durchgeführt von MAGeCK, n=3 biologische Replikate).

(D) mRNA-Expression von in (C) identifizierten Genen während der Entwicklung und Aktivierung von T-Zellen (Daten aus dem ImmGen RNA-seq-Datenbrowser).

(E) Proteinexpression der in (C) identifizierten Gene in naivem und aktiviertem CD4^PlusT-Zellen (Daten aus der Immunological Proteome Resource [ImmPRes]).

(F) mRNA-Expression der in (C) identifizierten Gene im Vollblut von Personen mit den angegebenen entzündlichen Erkrankungen im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen (Aune et al., 2017). RA-MTX, RA unter MTX-Behandlung; SLE, systemischer Lupus erythematodes; MS-Tx-naive, behandlungsnaive MS zum Zeitpunkt der Diagnose; MS festgestellt, MS in Behandlung und in Krankheitsremission; n=3–8 Spender.

(G) IHC mit CD3- und MTHFD2-Färbung im Cauda equina-Segment des Rückenmarks von Mäusen mit symptomatischer EAE bei 2003 (oben; Maßstabsbalken, 100 mm) und 4003 (unten; Maßstabsbalken, 50 mm) Vergrößerung (Daten sind repräsentativ von zwei unabhängigen Experimenten).

(H und I) Relative (H) mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) und (I) mRNA-Expression von MTHFD2 in CD4^PlusT-Zellen aus Milz und Rückenmark von Mäusen mit symptomatischer EAE und Milz von Kontrollmäusen (Mittelwert ± Standardabweichung, einfache ANOVA, Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente mit insgesamt 6 biologischen Wiederholungen).

(J) MTHFD2-mRNA-Expression in undifferenziertem CD4^PlusT-Zellen 0, 5 und 24 h nach Aktivierung mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern (Mittelwert ± SD, einfache ANOVA, n=3 biologische Wiederholungen).

(K) Relativer MTHFD2-MFI über 5 Tage nach Aktivierung in CD4-plus-T-Zell-Untergruppen, normalisiert auf ruhende Zellen (Mittelwert ± Standardabweichung, n=3 biologische Wiederholungen). Siehe auch Abbildung S1. Statistisch signifikante Ergebnisse sind gekennzeichnet (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" prozent="">

MTHFD2 ist eines der am stärksten induzierten und überexprimierten Gene in allen Tumoren (Nilsson et al., 2014). Obwohl MTHFD2 während der Embryogenese weitgehend hochreguliert ist, wird es in den meisten Geweben von Erwachsenen kaum oder gar nicht exprimiert (Nilsson et al., 2014). In der Krebstherapie (Zhu und Leung, 2020) kann die MTHFD2-Hemmung zu erhöhtem oxidativem Stress (Ju et al., 2019; Wan et al., 2020), Glycinabhängigkeit (Koufaris et al., 2016) und unzureichend führen Purinsynthese (Ben-Sahra et al., 2016; Pikman et al., 2016). MTHFD2-Mangel kann auch die mTORC1-Aktivität durch mehrere Mechanismen unterdrücken, einschließlich durch Guanin-Mangel und anschließende Hemmung der mTORC1--aktivierenden GTPase Rheb (Emmanuel et al., 2017). Ein MTHFD2-Mangel verursacht auch eine Akkumulation von Zwischenprodukten des Purinsynthesewegs, einschließlich des Adenosinmonophosphat (AMP)-Analogons 5- Aminoimidazolcarboxamid-Ribonukleotid (AICAR) (Ducker et al., 2016), das die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) aktivieren kann. um mTORC1 zu hemmen (Su et al., 2019).

Da der 1C-Stoffwechsel mehrere Nährstoffeinträge integriert und therapeutisch beherrschbar ist, haben wir die Rolle des 1C-Stoffwechsels bei CD4 untersucht^PlusT-Effektor (Teff) und Treg-Zell-Untergruppen. Durch unvoreingenommenes CRISPR-Cas9--basiertes gezieltes In-vivo-Screening in primären murinen T-Zellen identifizierten wir MTHFD2 als einen Hit, der auch bei Personen mit entzündlichen Erkrankungen konsistent hochreguliert war. Bemerkenswerterweise beeinträchtigte der MTHFD2-Mangel die Teff-Zellproliferation und -funktion. Ein MTHFD2-Mangel förderte auch eine anormale FoxP3-Expression und eine unterdrückende Aktivität in Th17-Zellen, während die Differenzierung von Treg-Zellen gefördert wurde. Diese Wirkungen waren mit einer Akkumulation von AICAR, reduzierten Purinkonzentrationen, einer Herunterregulierung der mTORC1-Signalgebung, einem erhöhten mitochondrialen Metabolismus und einer veränderten DNA- und Histonmethylierung verbunden. In vivo schützte das Targeting von MTHFD2 vor mehreren entzündlichen Krankheitsmodellen. Diese Daten zeigen, dass MTHFD2 als metabolischer Kontrollpunkt in Th17- und Treg-Zellen dient, und unterstreichen das Potenzial dieses Enzyms als Ziel für eine entzündungshemmende Immuntherapie.

ERGEBNISSE

Der 1C-Metabolismus und die Purinsynthese sind in CD4 unterschiedlich aktiv^PlusT-Zell-Untergruppen

Wir stellten die Hypothese auf, dass sich die Nukleotidsynthese über CD4 hinweg unterscheiden kann^PlusT-Zell-Untergruppen. CD4^PlusT-Zellen wurden in vitro in Th1-, Th17- und Treg-Zellen differenziert und nach 72 h für die Massenspektrometrie gesammelt. Die Mengen an Nukleotidspezies waren im Allgemeinen in allen Untergruppen im Vergleich zu naiven Zellen erhöht (Abbildung 1A). Bemerkenswerterweise waren Zwischenprodukte der Purinsynthese unterschiedlich häufig, mit der höchsten Akkumulation von Glycinamid‐Ribonukleotid (GAR), 1-(Phosphoribosyl)imidazolcarboxamid (SAICAR) und AICAR in Th17‐Zellen (Abbildung S1A).

Um die Abhängigkeit von CD4 zu testen^PlusT-Zellen auf Enzyme im 1C-Metabolismus führten wir einen in vivo CRISPR-Cas9--basierten Screen in primärem CD4 durch^PlusT-Zellen (Abbildung 1B). Eine benutzerdefinierte Guide-RNA (gRNA)-Bibliothek wurde erstellt, um auf Enzyme im 1C-Metabolismus abzuzielen, zusammen mit Tuberöse-Sklerose-Komplex 2 (TSC2) als Positivkontrolle und nicht zielgerichtete Negativkontrollen (NTCs). CD4^PlusT-Zellen, die aus Ovalbumin (OVA)-spezifischen T-Zellrezeptor (TCR)-transgenen OT-II-Cas9-doppelt-transgenen Mäusen isoliert wurden, wurden mit dieser Bibliothek transduziert und intravenös in Rag1 transferiert^{__ /__}Gastgeber. Mäuse wurden dann mit intranasalem OVA immunisiert, um eine Lungenentzündung zu induzieren. T-Zellen, die aus den Lungen dieser Mäuse gewonnen wurden, wurden sequenziert, und die Anreicherung oder Verarmung von gRNAs wurde relativ zu den Eingangsfrequenzen festgestellt. TSC2-gRNA wurde angereichert, was die hemmende Rolle dieses Proteins in T-Zellen unterstützt. Im Gegensatz dazu waren PPAT-, AHCY-, MAT2A- und MTHFD1-gRNAs signifikant erschöpft und GART-, DHFR-, DNMT1-, MTRR-, MTR-, SHMT2- und MTHFD2-gRNAs waren in geringerem Maße reduziert, was darauf hinweist, dass diese Gene zur T-Zell-Proliferation und Entzündungsfunktion beitragen in vivo (Abbildungen 1C und S1B).

Als nächstes untersuchten wir das Expressionsprofil der aus dem Screen identifizierten Gene. Obwohl alle in sich entwickelnden Thymozyten koordiniert hochreguliert wurden, wurden MTHFD2-mRNA und -Protein am stärksten in stimulierten peripheren T-Zellen induziert ( 1D und 1E ). Darüber hinaus wurde MTHFD2 in einem separat veröffentlichten RNA-Sequenzierungsdatensatz (RNA-seq) aus Vollblut von Personen mit einer Vielzahl von entzündlichen und Autoimmunerkrankungen (Aune et al., 2017) bei mehreren Erkrankungen, einschließlich Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, konsistent überexprimiert , Zöliakie, RA, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Psoriasis, Psoriasis-Arthritis, Sjögren-Syndrom und MS (Abbildung 1F). Bemerkenswerterweise hatten Personen mit kürzlich diagnostizierter MS eine signifikant erhöhte MTHFD2-Expression im Vergleich zu gesunden Spendern oder Personen mit MS, die sich einer Therapie mit Krankheitsremission unterzogen (Abbildung S1C). Also CD4^PlusT-Zell-Proliferation und -Überleben sind von bestimmten Genen des 1C-Stoffwechsels abhängig, und die Expression dieser Gene unterscheidet sich durch die Stadien der T-Zell-Entwicklung, -Aktivierung und -Differenzierung sowie durch das Setting einer pathologischen Entzündung.

Abbildung 2. MTHFD2-Mangel beeinträchtigt CD4^PlusT-Zell-Proliferation und -Funktion

(A–D) Proliferation gemessen durch (A) CellTrace Violet (CTV)-Verdünnung, (B) Lebensfähigkeit, (C) CD25-Expression und (D) TF-Expression in CD4^PlusT-Zell-Untergruppen, die 72 h nach der Aktivierung mit MTHFD2i behandelt wurden (Mittelwert ± Standardabweichung, einfache ANOVA, Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit insgesamt 9 biologischen Wiederholungen).

MTHFD2 ist im ZNS-infiltrierenden CD4 stark hochreguliert^PlusT-Zellen bei experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE) und bei aktiviertem CD4^PlusT-Zellen in vitro

Die Regulation von MTHFD2 wurde in CD4 plus T-Zellen nicht gut beschrieben. Um die Expression von MTHFD2 in entzündlichen Läsionen in vivo zu messen, wurde CD4^PlusT-Zellen von myelinspezifischen TCR-transgenen 2D2-Mäusen wurden aktiviert und adoptiv in Rag1 übertragen^{__ /__}Mäuse, um EAE zu induzieren. Nachdem bei den Mäusen eine Lähmung der Hinterbeine auftrat, wurde das Segment der Cauda equina des Rückenmarks durch Immunhistochemie (IHC) analysiert. Mäuse, die 2D2-T-Zellen erhielten, zeigten eine Anreicherung von MTHFD2 und CD3^PlusZellen, die in der Kontrolle fehlten (Abbildung 1G). Um direkt festzustellen, ob CD4^PlusT-Zellen hochregulierten MTHFD2 in entzündeten Läsionen, T-Zellen aus der Milz und dem Rückenmark von Mäusen, die einem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) und Pertussistoxin (PTX)-induzierten EAE-Modell unterzogen wurden, wurden zur Analyse gesammelt. ZNS-infiltrierendes CD4^PlusT-Zellen überexprimierten MTHFD2 im Vergleich zu passendem Milz-CD4^PlusT-Zellen von Kontroll- und EAE-Mäusen, gemessen durch Durchflusszytometrie (Abbildung 1H) und qRT-PCR (Abbildung 1I). Die Kinetik der MTHFD2-Expression in CD4^PlusAls nächstes wurden T-Zellen in vitro gemessen. Eine robuste Hochregulierung von MTHFD2-mRNA wurde nach 5 h Stimulation nachgewiesen und begann nach 24 h abzunehmen (Abbildung 1J), während CD4 differenziert wurde^PlusT-Zell-Untergruppen erreichten die höchste Expression des MTHFD2-Proteins 48 h nach der Aktivierung (Abbildung 1K). Diese Daten zeigen, dass MTHFD2 in CD4 hochreguliert ist^PlusT-Zellen mit Aktivierung in vitro und am Ort der Entzündung in vivo.

CD4^PlusUntergruppen von T-Zellen benötigen MTHFD2 für Aktivierung, Proliferation, Überleben und Zytokinproduktion

Als nächstes testeten wir die Rolle von MTHFD2 bei der Aktivierung, Differenzierung, Proliferation und Funktion von CD4 plus T-Zell-Untergruppen. CD4^PlusT-Zellen wurden in vitro in Gegenwart von Zytokinen für eine optimale Differenzierung von Th1-, Th17- und Treg-Zellen und Vehikel oder einem MTHFD2-Inhibitor (MTHFD2i; DS18561882) aktiviert (Kawai et al., 2019). Nach 72 h hatten alle Untergruppen eine reduzierte Proliferation (Abbildung 2A) und die Anzahl lebender zyklischer Zellen (Abbildungen S2A und S2B). Die Lebensfähigkeit war in Th1- und Th17-Zellen reduziert (Abbildung 2B), und die Aktivierung, gemessen anhand der CD25-Expression, war in allen Untergruppen reduziert (Abbildung 2C). Die Expression des abstammungscharakteristischen Transkriptionsfaktors (TF) war in Th1-Zellen (T-bet^Plus), aber unverändert in Th17-Zellen (ROR t^Plus) und in Treg-Zellen minimal verändert (FoxP3^Plus) (Abbildung 1D). Um die Teff-Zellfunktion zu messen, wurden die Zellen mit 12-Myristat 13-acetat (PMA) und Ionomycin restimuliert. Deutlich weniger Th1-Zellen exprimierten Interferon-g (IFNg) und weniger Th17-Zellen exprimierten IL-17, wenn sie in Gegenwart von MTHFD2i differenziert wurden (Abbildung 2E). Dies war nicht auf eine beeinträchtigte anfängliche Aktivierung zurückzuführen, da diese Phänotypen aufrechterhalten wurden, wenn die Arzneimittelexposition bis 24 h nach der Aktivierung verzögert wurde, obwohl die das Linienalter charakterisierende TF-Expression in dieser Einstellung unverändert blieb (Abbildungen S2C–S2F). MTHFD2 wird also für maximales CD4 benötigt^PlusAktivierung, Proliferation, Überleben und Zytokinproduktion von T-Zellen.

Um diese pharmakologischen Wirkungen genetisch zu validieren, haben wir ein Mthfd2 generiert^fl/flMausstamm und kreuzte ihn mit Cd4- cre-transgenen Mäusen, um eine bedingte genetische Deletion zu erreichen. Wie erwartet, aktiviertes CD4^PlusT-Zellen von Mthfd2^fl/flCD4-cre plus (CD4^ΔMthfd2)-Mäuse hatten eine niedrigere MTHFD2-Expression im Vergleich zu Zellen von Mthfd2^fl/flCD4-cre^Plus(Wildtyp [WT]) Wurfgeschwister (Abbildung 2F). Zu Studienbeginn hatten CD4DMthfd2-Mäuse etwas weniger CD4^PlusT-Zellen in der Milz im Vergleich zum WT (Abbildung 2G). Nach In-vitro-Aktivierung und -Differenzierung, Zellzahlen und Lebensfähigkeit von CD4^ΔMthfd2Th17-Zellen und in geringerem Maße Treg-Zellen waren signifikant niedriger (Abbildung 2H). Darüber hinaus war die CD25-Expression in Th17- und Treg-Zellen verringert und tendierte in Th1-Zellen niedriger (Abbildung 2I). Endlich CD4^ΔMthfd2Th1- und Th17-Zellen hatten eine niedrigere Expression von T-bet bzw. ROR t. FoxP3 in Treg-Zellen war jedoch unverändert (Abbildung 2J). Trotz Veränderungen in der TF-Expression produzierten Teff-Zellen, die sich differenzierten, normale Mengen an Zytokinen (Abbildung 2K). Unterschiede in den Ergebnissen zwischen dem pharmakologischen und dem genetischen Ansatz können dem Zeitpunkt und der Vollständigkeit des Enzymfunktionsverlusts während der Entwicklung und möglichen Kompensationsmechanismen zugeschrieben werden.

Das MTHFD2i induziert die FoxP3-Expression in Th17-Zellen und verstärkt die Differenzierung von Treg-Zellen

Angesichts der Abhängigkeit von Teff-Zellen von MTHFD2 testeten wir die MTHFD2i-Regulation von FoxP3- und Treg-Zellen. Bemerkenswerterweise induzierte die MTHFD2i-Behandlung dosisabhängig eine aberrante Hochregulierung von FoxP3 in Th1- und stärker ausgeprägt in Th17-Zellen (Abbildung 3A). Dies trat auch auf, wenn die Behandlung bis 24 h nach der Aktivierung verzögert wurde (Abbildung 3B). Ein ähnlicher Trend wurde in den CD4DMthfd2-Th17-Zellen beobachtet (Abbildung 3C). Diese FoxP3-Hochregulierung war funktionell, weil mit MTHFD2i behandelte Th17-Zellen eine unterdrückende Kapazität erlangten, wenn sie mit CD8 co-kultiviert wurden^PlusT-Zellen (Abbildung 3D). Das MTHFD2i kann somit FoxP3- und Treg-Zell-ähnliche Phänotypen in Th17-Zellen fördern. Das MTHFD2i verstärkte auch die Differenzierung von induzierten Treg-Zellen. Treg-Zellen wurden mit einer Reihe von Konzentrationen des transformierenden Wachstumsfaktors b (TGF-b) in Gegenwart von MTHFD2i differenziert. Bei jeder getesteten Konzentration außer der höchsten nahm die FoxP3-Expression mit der MTHFD2i-Behandlung zu (Abbildungen 3E und 3F). Dieser Phänotyp wurde auch bei verzögerter Behandlung mit MTHFD2i aufrechterhalten (Abbildung 3G).

Abbildung 3. MTHFD2-Mangel induziert die FoxP3-Expression und fördert eine Verschiebung hin zur oxidativen Phosphorylierung

(A) FoxP3-Expression in MTHFD2i-behandelten Th1- und Th17-Zellen 72 h nach Aktivierung (Mittelwert ± SD, einfache ANOVA, Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit insgesamt 9 biologischen Wiederholungen).

(B) FoxP3-Expression in Th1- und Th17-Zellen, die für 24 h aktiviert und dann für 48 h mit Vehikel oder 500 nM MTHFD2i behandelt wurden (Mittelwert ± SD, ungepaarter t-Test, Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit insgesamt 9 biologischen Wiederholungen).

(C) FoxP3-Expression in Th1- und Th17-Zellen von WT- und CD4DMthfd2-Wurfgeschwistern 72 h nach Aktivierung (Mittelwert ± SD, ungepaarter t-Test, Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit insgesamt 9 biologischen Wiederholungen).

(D) Suppressionstest, der die anormale Suppressionskapazität von mit MTHFD2i behandelten Th17-Zellen misst. Vorbehandelte Th17-Zellen wurden mit CTV-gefärbten CD8 plus T-Zellen kokultiviert, um die Proliferation nach Aktivierung mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern zu messen (Mittelwert ± SD, einfache ANOVA, n=3 biologische Wiederholungen) .

(E) FoxP3-Expression in Treg-Zellen, die mit einer Reihe von TGF-b-Konzentrationen differenziert und mit dem MTHFD2i behandelt wurden (Mittelwert ± SD, ungepaarter t-Test, Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit insgesamt 9 biologischen Wiederholungen).

(F) Durchflusszytometrie-Plots für die in (E) tabellierten Daten.

(G) FoxP3-Expression in Treg-Zellen, die mit niedrigen Konzentrationen von TGF-b für 24 h aktiviert und differenziert und dann für 48 h mit dem MTHFD2i behandelt wurden (Mittelwert ± SD, ungepaarter t-Test, Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit insgesamt 9 biologischen Wiederholungen ).

(H) Seahorse XF Cell Mito Stresstest durchgeführt an MTHFD2i-behandelten Th17- und Treg-Zellen (Mittelwert ± SD, n=3 biologische Wiederholungen). (I) Basal-ECAR, Basal-OCR, Max-OCR und Basal-OCR/ECAR Verhältnis gemessen in (H) (Mittelwert ± Standardabweichung, ungepaarter t-Test, Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente mit insgesamt 6 biologischen Wiederholungen). Statistisch signifikante Ergebnisse sind gekennzeichnet (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p Prozent 0,001).

Treg-Zellen haben einen größeren mitochondrialen Stoffwechsel als Th17-Zellen (Michalek et al., 2011). Um die metabolischen Folgen der MTHFD2i-Behandlung zu bestimmen, wurden Th17- und Treg-Zellen durch extrazelluläre Flussanalysen bewertet. Das MTHFD2i erhöhte die basale und maximale Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von Th17-Zellen, um eine Verschiebung hin zur mitochondrialen Atmung anzuzeigen (Abbildung 3H). Umgekehrt hatten Th17- und Treg-Zellen eine verringerte basale extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) mit MTHFD2i-Behandlung, was auf eine verringerte Glykolyse hindeutet (Abbildung 3I). Das basale Verhältnis von OCR zu ECAR war in Th17- und Treg-Zellen signifikant erhöht, weil das MTHFD2i das Stoffwechselprogramm von der Glykolyse in Richtung oxidative Phosphorylierung verschoben hat. Diese Daten zeigen, dass MTHFD2i die FoxP3-Expression in Th17-Zellen und Treg-Zellen verstärkt, die unter niedrigen TGF-b-Bedingungen differenziert wurden, und Th17-Zellen zu einem Treg-Zell-ähnlichen Metabolismus verschiebt.

MTHFD2-Mangel in menschlichen CD4 plus T-Zellen verringert die Th17-Zellproliferation und -lebensfähigkeit, während die FOXP3-Expression erhöht und die mTORC1-Aktivität gedämpft wird

Um die Übertragbarkeit der obigen Befunde auf menschliche Zellen zu testen, wurde CD4^PlusAus peripherem Blut gesunder Spender isolierte T-Zellen wurden in vitro in Th1-, Th17- und Treg-Zellen differenziert und ab dem Zeitpunkt der Aktivierung mit Vehikel oder MTHFD2i behandelt. Die Proliferation war in MTHFD2i-behandelten Th17- und Treg-Zellen signifikant verringert (Abbildung 4A), und Th17-Zellen zeigten auch eine erhöhte Apoptose (Abbildung 4B). Die verringerte Proliferation in Th17-Zellen wurde mit einem genetischen Ansatz unter Verwendung kleiner interferierender RNA (siRNA) rekapituliert (Abbildungen 4C und S2G). Ähnlich wie bei murinen Zellen war die FOXP3-Expression in MTHFD2i-behandelten menschlichen Th17-Zellen höher und tendierte in MTHFD2i-behandelten menschlichen Treg-Zellen höher (Abbildungen 4D und S2H). Da die mTORC1-AMPK-Achse entscheidend für die Differenzierung von Th17- und Treg-Zellen ist, wurde auch die Phosphorylierung des ribosomalen mTORC1-Zielproteins S6 (Phospho-S6) gemessen. Dies zeigte eine verringerte mTORC1-Aktivität in Th17-Zellen mit MTHFD2i oder siMTHFD2 (Abbildung 4E). Somit können der Verlust der Proliferationsfähigkeit und die Induktion der FOXP3-Expression in Th17- und Treg-Zellen in primärem humanem CD4 rekapituliert werden^PlusT-Zellen.

Abbildung 4. MTHFD2-Mangel beeinträchtigt die Proliferation und induziert die FOXP3-Expression in menschlichen Th17-Zellen

(A) Proliferation gemessen durch CTV-Verdünnung in menschlichen CD4-plus-T-Zell-Untergruppen, die 72 h lang nach Aktivierung mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern mit Vehikel oder 2 mM MTHFD2i behandelt wurden (gepaarter t-Test, Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit 5 –6 gesunde Spender).

(B) Apoptose, gemessen durch Annexin V in menschlichen CD4 plus T-Zellen, die 72 h lang mit dem MTHFD2i behandelt wurden (gepaarter t-Test, Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit 5–6 gesunden Spendern).

(C) Ki-67-Expression in humanen CD4 plus T-Zellen, die mit NTC oder siMTHFD2 transduziert wurden (gepaarter t-Test, Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit 4 gesunden Patientenspendern).

(D) FOXP3-Expression in humanen CD4 plus T-Zellen, die 72 h mit MTHFD2i behandelt wurden (gepaarter t-Test, Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit 6–10 gesunden Spendern).

(E) Veränderung der Phospho-S6-Expression in humanen CD4 plus T-Zellen, die 72 h mit MTHFD2i behandelt oder mit siMTHFD2 transduziert wurden (Mittelwert ± SD, ein Stichproben-t-Test, Daten repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit 4–6 gesunden Spendern). Statistisch signifikante Ergebnisse sind gekennzeichnet (* p < 0.{{10}}5,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" prozent="">

T-Zellen verlassen sich auf die enzymatische Funktion von MTHFD2, und Phänotypen können durch das Produkt gerettet werden

MTHFD2 ist für die Aufrechterhaltung des mitochondrialen Formiatpools für die Purinsynthese erforderlich (Ma et al., 2017), kann aber auch nicht-enzymatische Rollen spielen. Die MTHFD2i-Behandlung unterstützte die essentielle enzymatische Aktivität und führte zu einer kompensatorischen Aufnahme von Formiat aus dem Medium in CD4-plus-T-Zell-Untergruppen (Abbildung 5A). Die für die Formiatsynthese verwendete 1C-Einheit wird durch Umwandlung von Serin in Glycin bereitgestellt, und intrazelluläres Serin akkumuliert, während Glycin durch MTHFD2i-Behandlung in allen Untergruppen erschöpft wurde (Abbildung 5B). Auch die Methioninkonzentrationen waren leicht erhöht, was auf eine Hemmung des Methioninzyklus hindeutet. Angesichts der Tatsache, dass der Serin-Glycin-Umwandlungsschritt MTHFD2 vorgeschaltet ist, wurden diese Veränderungen erwartungsgemäß nicht durch die Bereitstellung von Formiat im Medium gerettet.

Abbildung 5. MTHFD2i-Effekte auf T-Zell-Untergruppen werden durch exogenes Formiat gerettet

(A) Formiaaufnahme, gemessen durch 1 H-Magnetresonanzspektroskopie (MRS) in CD4 plus T-Zell-Untergruppen, die mit Vehikel oder 500 nM MTHFD2i für 72 h nach Aktivierung behandelt wurden (Mittelwert ± SD, ungepaarter t-Test, Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente mit insgesamt 6 biologischen Wiederholungen).

(B) Veränderung der Serin-, Glycin- und Methioninkonzentrationen in CD4 plus T-Zellen, die mit 500 nM MTHFD2i oder 500 nM MTHFD2i plus 1 mM Formiat für 4–6 h behandelt wurden, verglichen mit Vehikel, gemessen durch Massenspektrometrie (Mittelwert ± SD, n { {8}} biologische Replikate).

(C) Lebendzellzahl, Lebensfähigkeit und CD25-Expression in MTHFD2i-behandelten CD4 plus T-Zellen, die mit 1 mM Formiat oder 60 mM Adenin- und Guanin-Purin-Lösung für 72 h nach Aktivierung gerettet wurden (Mittelwert ± SD, einfache ANOVA, Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit insgesamt 9 biologischen Wiederholungen).

(D) Lebendzellzahl, Lebensfähigkeit und CD25-Expression in CD4 plus T-Zellen von WT- oder CD4DMthfd2-Wurfgeschwistern, die mit Formiat oder Purinen für 72 h nach Aktivierung gerettet wurden (Mittelwert ± SD, einfache ANOVA, n=3 biologische Replikate ).

Als nächstes testeten wir, ob die Zugabe von Formiat oder einer Adenin- und Guanin-Purin-Lösung eine mangelhafte enzymatische Funktion retten und nachgeschaltete Wirkungen eines MTHFD2-Mangels umkehren könnte. Tatsächlich stellte 1 mM Formiat die Proliferation, Lebensfähigkeit und Aktivierung in mit MTHFD2i behandelten Zellen wieder her (Abbildung 5C). Die Purin-Supplementierung rettete die Proliferation in allen Untergruppen und die Aktivierung in Th1- und Th17-Zellen, aber nicht die Lebensfähigkeit in allen Untergruppen und die Aktivierung in Treg-Zellen. Format rettete auch die Proliferation, Lebensfähigkeit und Aktivierung in CD4^ΔMthfd2T-Zellen (Abbildung 5D). Die beeinträchtigte Zytokinproduktion in mit MTHFD2i behandelten Th1- und Th17-Zellen wurde durch Formiat- oder Purinzugabe auf Vehikelmengen umgekehrt (Fig. 5E). Bemerkenswerterweise wurde die abweichende Hochregulierung von FoxP3 in Th17-Zellen durch Purinzugabe, aber nicht durch Formiat gerettet, während Formiat und Purinzugabe die FoxP3-Expression auf die Grundlinie in Treg-Zellen reduzierten, die mit niedrigen Konzentrationen von TGF-b differenziert wurden (Abbildung 5F). MTHFD2i-Phänotypen scheinen von der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Formiat- oder Purinpools durch MTHFD2 abhängig zu sein.

MTHFD2 reguliert mTORC1-Aktivität und DNA- und Histon-Methylierung in CD4^PlusT-Zellen

In immortalisierten Krebszellen kann ein MTHFD2-Mangel zur Akkumulation der Purinsynthese-Zwischenprodukte GAR, SAICAR und AICAR führen, die den 10-FormylTHF-vermittelten Formylierungsschritten vorgeschaltet sind (Ducker et al., 2016). CD4^PlusT-Zell-Untergruppen wurden 72 h lang kultiviert, bevor sie 4–6 h lang MTHFD2i ausgesetzt wurden. Dieser kurze Zeitrahmen wurde gewählt, um Nebenwirkungen, einschließlich kompensatorischer Änderungen, zu vermeiden. Eine vorübergehende Behandlung mit MTHFD2i führte zu einer Akkumulation von GAR, SAICAR und AICAR in allen Untergruppen (Abbildung 6A). Dieser Effekt wurde durch Zugabe von 1 mM Formiat vollständig aufgehoben, was eine enzymatische Rolle von MTHFD2 unterstützt. Nukleotide und Nukleobasen, einschließlich Guanin, wurden ebenfalls durch MTHFD2i abgereichert und durch Formiat in Th17- und Treg-Zellen gerettet (Abbildung 6B).

Abbildung 6. MTHFD2i führt zu einer Akkumulation von Purin-Synthese-Zwischenprodukten, dämpfte die mTORC1-Aktivität und veränderte die DNA- und Histon-Methylierung

(A) Veränderung der GAR-, SAICAR- und AICAR-Konzentrationen in CD4 plus T-Zellen, die mit 500 nM MTHFD2i oder 500 nM MTHFD2i plus 1 mM Formiat für 4–6 h behandelt wurden, relativ zum Vehikel, gemessen durch Massenspektrometrie (Mittelwert ± SD, ein- Weise ANOVA, n=3 biologische Wiederholungen).

(B) Veränderung der Nukleotidstoffwechselspezies in Th17- und Treg-Zellen, die mit MTHFD2i mit oder ohne Formiat für 4–6 h behandelt wurden, relativ zum Vehikel, gemessen durch Massenspektrometrie (n=3 biologische Replikate).

(C) Immunoblot von Phospho-S6, S6, Rheb, Phospho-ACC, ACC, HIF-1a und b-Aktin in CD4 plus T-Zellen, die mit MTHFD2i mit oder ohne Formiat für 72 h nach Aktivierung behandelt wurden (Daten repräsentativ für drei unabhängige Experimente mit n=3 biologischen Wiederholungen).

(D) Veränderung der Metaboliten des TCA-Zyklus in Th17-Zellen, die mit MTHFD2i mit oder ohne Formiat für 6 h behandelt wurden, relativ zum Vehikel, gemessen durch Massenspektrometrie (Mittelwert ± SD, einfache ANOVA, n=3 biologische Wiederholungen).

(E) Heatmaps des H3K27me3-zu-IgG-Kontrollverhältnisses in ±10- kb-Regionen um Promotoren bekannter UCSC-Gene in mit MTHFD2i behandelten Th17- und Treg-Zellen, gemessen mit CUT&RUN (Daten gepoolt aus 3 biologischen Replikaten).

(F) Heatmap der mittleren DNA-Methylierungshäufigkeit des Foxp3-Locus nach CpG-Stelle in Th1- und Th17-Zellen, die mit Vehikel oder 500 nM MTHFD2i behandelt wurden, und in nTreg-Zellen von WT- oder CD4DMthfd2-Wurfgeschwistern (Mood-Test, n=3 biologische Replikate).

(G) Tabellierung von (F) nach proximalem Promotor, distalem Promotor und TSDR (gepaarter t-Test). Siehe auch Abbildungen S3 und S4. Statistisch signifikante Ergebnisse sind gekennzeichnet (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" prozent="">

AICAR und Nukleotide sind etablierte Regulatoren der mTORC1-AMPK-Achse (Emmanuel et al., 2017; Kim et al., 2016). Tatsächlich wurde die Phospho-S6-Expression durch die MTHFD2i-Behandlung in allen Untergruppen verringert und durch die Zugabe von Formiat vollständig wiederhergestellt (Abbildungen 6C und S3A). Das GTP-bindende Protein Rheb, ein obligatorischer Aktivator von mTORC1, kann empfindlich auf die intrazelluläre Verfügbarkeit von Guanin reagieren (Emmanuel et al., 2017), und die Rheb-Expression wurde durch die Behandlung mit MTHFD2i gedämpft (Abbildungen 6C und S3B). AICAR ist ein Adenosin-Analogon und AMPK-Aktivator (Rae und Mairs, 2019; Su et al., 2019). 72 Stunden nach der Aktivierung änderte sich die Phosphorylierung von AMPK oder seiner Ziele, der Acetyl-Coenzym-A(CoA)-Carboxylase (Phospho-ACC) und der Unc-51--ähnlichen autophagieaktivierenden Kinase (Phospho-ULK1), jedoch nicht mit der Behandlung mit MTHFD2i (Abbildungen 6C, S3C und S3D). mTORC1-Aktivität fördert Th17 und dämpft die Treg-Zelldifferenzierung teilweise durch Induktion des HIF-1a-abhängigen glykolytischen Metabolismus (Shi et al., 2011). In Übereinstimmung damit war die HIF-1a-Expression in MTHFD2i-behandelten und CD4DMthfd2-Th17-Zellen verringert (Abbildungen 6C, S3E und S3F). Diese Änderungen der mTORC1-Aktivität waren nicht mit Defiziten in der TCR-Signalübertragung verbunden, gemessen anhand der Nur77-Expression mit und ohne Restimulation (Abbildung S3G). Die Aktivität des Signaltransducers und Aktivators der Transkription 3 (STAT3), die für die Th17-Zellentwicklung entscheidend ist, blieb unverändert oder nahm leicht mit der Behandlung mit MTHFD2i zu (Abbildung S3H). Eine verringerte mTORC1-Aktivität und eine Verschiebung von der Glykolyse zur oxidativen Phosphorylierung bei der Behandlung mit MTHFD2i deuteten auf Veränderungen in der relativen Häufigkeit von Metaboliten des Tricarbonsäurezyklus (TCA) hin. Die Succinat- und Fumaratkonzentrationen wurden durch MTHFD2i signifikant reduziert, aber durch Formiat gerettet (Abbildung 6D).

TCA-Metabolite sind bekannte Inhibitoren von DNA und Histon-Demethylasen (Su et al., 2016), und die Erschöpfung von Succinat- und Fumarat-Pools kann einen hypomethylierten Zustand unterstützen. Die H3K27-Trimethylierung (H3K27me3) im gesamten Genom wurde durch CUT&RUN-Sequenzierung (Spaltung unter Zielen und Freisetzung unter Verwendung von Nuklease) gemessen (Skene und Henikoff, 2017). Tatsächlich hatten MTHFD2i-behandelte Th17-Zellen im Vergleich zu Vehikel reduziertes H3K27me3 (Abbildungen 6E und S4A). Die DNA-Methylierung am Foxp3-Locus wurde auch durch Bisulfatsequenzierung gemessen, um zu bestimmen, ob die unterschiedliche Methylierung zur MTHFD2i-induzierten FoxP3-Hochregulierung beitrug. Obwohl sich mehrere CpG-Loci in der Methylierungshäufigkeit zwischen Vehikel- und MTHFD2i-Bedingungen unterschieden, gab es kein erkennbares Muster in der Treg-zellspezifischen demethylierten Region (TSDR). Es gab auch keine Unterschiede zwischen nTreg-Zellen (CD4 plus CD25 plus ), die aus WT- und CD4DMthfd2-Mäusen isoliert wurden (Abbildung 6F), obwohl die Reinheit jeder angereicherten Population gering war (Abbildung S4B). Es gab jedoch eine signifikante Abnahme der DNA-Methylierungshäufigkeit über der proximalen Promotorregion von Foxp3 in MTHFD2i-behandelten Th17-Zellen im Vergleich zu Vehikel ( 6G ), was auf eine mögliche Verstärkung der Transkription mit MTHFD2i hinweist.

Zusätzlich zur Aufrechterhaltung des intrazellulären Formiatpools trägt die MTHFD2-Aktivität durch die Umwandlung von NAD zum zellulären Redoxgleichgewicht bei^Pluszu NADH und NADP^Pluszu NADPH (Shin et al., 2017) und Unterstützung des Transsulfurierungswegs und der anschließenden Glutathionsynthese. Mit MTHFD2i behandelte Th17-Zellen hatten verringerte Konzentrationen von NAD^Plus, NADH, NADP^Plusund NADPH, das mit Formiat gerettet wurde (Abbildung S4C). Allerdings NAD^Plus/NADH und NADP^PlusDie /NADPH-Verhältnisse blieben unter allen Bedingungen unverändert. Dies, kombiniert mit der fehlenden Veränderung der zellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und des mitochondrialen Superoxids (Abbildung S4D), legt nahe, dass Änderungen im Redoxzustand wahrscheinlich nicht wesentlich zum MTHFD2i-Phänotyp beitragen.

MTHFD2-Mangel in vivo reduziert die Schwere mehrerer entzündlicher Erkrankungen

Die Wirksamkeit von MTHFD2 als therapeutisches Ziel wurde als nächstes in einem T-Zell-abhängigen In-vivo-Modell für Hypersensitivität vom verzögerten Typ (DTH) getestet. Mäuse wurden immunisiert und am Ohr mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) herausgefordert, um lokale Entzündungen zu induzieren, und mit oralem Vehikel oder MTHFD2i behandelt. Die Behandlung zeigte keine offensichtliche Toxizität, da die Tiere ihr Gewicht beibehielten (Abbildung S5A). Wichtig ist, dass Ohrdicke und -gewicht bei Kontroll-DTH-Mäusen erhöht waren, aber nicht bei mit Inhibitor behandelten Tieren, was auf einen Schutz vor Entzündungen bei MTHFD2i-Behandlung hinweist ( 7A , 7B und 55B ). KLH-spezifisches Immunglobulin G (IgG) war bei der höchsten Inhibitordosis ebenfalls reduziert, was auf potenzielle Auswirkungen hinweist, die sich auf die B-Zellfunktion erstrecken ( 7C ).

Abbildung 7. Das Targeting von MTHFD2 in vivo reduziert die Schwere der Erkrankung in DTH-, EAE- und IBD-Modellen

(A und B) Ohr (A) relative Dicke und (B) Biopsiegewicht 10 Tage nach KLH mit CFA-Immunisierung und 3 Tage nach KLH-Challenge zur Induktion von DTH (Einweg-ANOVA). Mäuse wurden zweimal täglich mit oralen 0, 100 oder 300 mg/kg MTHFD2i (Mittelwert ± SEM, n=8 biologische Wiederholungen) behandelt.

(C) KLH-spezifische IgG-Konzentrationen an Tag 10 von KLH-induziertem DTH (Mittelwert ± SEM, Kruskal-Wallis-Test, n=8 biologische Wiederholungen).

(D) Durchschnittliche klinische Bewertung über die Zeit bei WT- und CD4DMthfd2-Wurfgeschwistern, die mit MOG mit CFA und PTX immunisiert wurden, um EAE zu induzieren (Mittelwert ± SEM, mehrere Mann-Whitney-Tests, Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente mit jeweils 5 biologischen Wiederholungen).

(E) Zellzahl und Häufigkeit von CD4 plus T-Zellen im Rückenmark von EAE-Mäusen bei der höchsten Krankheitsschwere (Mittelwert ± SEM, ungepaarter t-Test, Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente mit insgesamt 9 biologischen Wiederholungen).

(F) CD25- und CD44-Expression in CD4 plus T-Zellen aus dem Rückenmark von EAE-Mäusen (Mittelwert ± SEM, ungepaarter t-Test, n=4 biologische Wiederholungen).

(G und H) Zellenanzahl von (G) T-bet plus , RORgt plus , FoxP3 plus , FoxP3 plus /T-bet plus ratio, FoxP3 plus /RORgt plus ratio und (H) IL-17 plus , IFNg plus , und IL-17 plus IFNg plus CD4 plus T-Zellen aus dem Rückenmark von EAE-Mäusen (Mittelwert ± SEM, ungepaarter t-Test, Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente mit insgesamt 9 biologischen Wiederholungen).

(I) H&E-, Anti-CD3-IHC- und Luxol-Fast-Blue (LFB)-Färbung für Myelin im Rückenmark einer WT-Maus ohne Immunisierung und WT- und CD4DMthfd2-Wurfgeschwister mit EAE am Höhepunkt der Erkrankung (Vergrößerung von 2003, repräsentativ für 5 biologische Wiederholungen ).

(J) Veränderung des Körpergewichts von Rag1 über die Zeit^__/__Mäusen wurden ip WT- oder CD4DMthfd2-naive CD4-plus-T-Zellen injiziert, um IBD-Kolitis zu induzieren (Mittelwert ± SEM, multiple t-Tests, n=8 biologische Wiederholungen).

(K und L) Zellzahl von (K) Gesamt-CD4 plus T-Zellen und (L) T-bet plus , RORgt plus und FoxP3 plus CD4 plus T-Zellen aus MLNs von IBD-Mäusen (Mittelwert ± SEM, ungepaarter t-Test n { {4}} biologische Replikate). Siehe auch Abbildungen S5 und S6. Statistisch signifikante Ergebnisse sind gekennzeichnet (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" prozent="">

In ähnlicher Weise war der duale MTHFD1/2-Inhibitor LY345899 (Gustafsson et al., 2017) bei der Linderung der Erkrankung in einem EAE-Modell wirksam. EAE wurde mit MOG und PTX induziert, und Mäuse wurden täglich mit intraperitonealer (ip) Injektion von DMSO oder LY345899 behandelt. Die Behandlung mit Inhibitoren führte zu einer signifikant verringerten Schwere der Erkrankung und einem kumulativen klinischen Score im Vergleich zum Vehikel (Abbildungen S5C und S5D). Die Mäuse wurden am Tag 26 getötet und Rückenmarks-infiltrierende Zellen wurden für die Erstellung von Immunprofilen gesammelt. Vor allem deutlich weniger CD45^Plus, CD4^Plus, und CD8^PlusZellen infiltrierten das Rückenmark von mit LY345899- behandelten Mäusen (Abbildungen S5E–S5G). Es gab keine Änderungen in der Häufigkeit von ROR t^Plusoder FoxP3^PlusZellen unter den infiltrierenden CD4^PlusT-Zellen (Abbildung S5H). Es gab jedoch eine Abnahme der Häufigkeit von IFNg plus IL-17-plus-Zellen und eine Zunahme von IL-17-plus-Zellen (Abbildung S5I), was auf einen möglichen Wechsel zu einem weniger pathogenen Phänotyp hindeutet.

Um die T-Zell-intrinsische Abhängigkeit von MTHFD2 in vivo direkt zu testen, wurden WT- und CD4DMthfd2-Wurfgeschwister drei verschiedenen Modellen unterzogen: EAE, entzündliche Darmerkrankung (IBD) und allergische Atemwegserkrankung. EAE wurde erneut mit MOG und PTX induziert, und ähnlich wie beim Inhibitorexperiment hatten CD4DMthfd2-Mäuse über 26 Tage eine signifikant verringerte Schwere der Erkrankung ( 7D ). Eine separate Kohorte wurde am Tag 15 nach der Induktion für die T-Zell-Phänotypisierung am Höhepunkt der Erkrankung eingeschläfert (Abbildungen S6A und S6B). Obwohl CD4^Plusoder CD8^PlusDie Anzahl der T-Zellen in der Milz blieb unverändert (Abbildung S6C), die Infiltration von CD4 plus T-Zellen in das Rückenmark war signifikant verringert (Abbildung 7E). Rückenmark-infiltrierende CD4 plus T-Zellen in CD4DMthfd2-Mäusen hatten eine ähnliche CD25-Expression wie die WT, aber eine reduzierte Expression von CD44, was auf eine teilweise beeinträchtigte Aktivierung hinweist (Abbildung 7F). Die Zahlen der T-Wette^Plus, ROR t plus und FoxP3 plus Zellen (Abbildung 7G) sowie IL-17 plus und IFNg plus Zellen (Abbildung 7H) waren auch im Rückenmark von CD4DMthfd2 Mäusen relativ zum WT reduziert. Bemerkenswerterweise waren die Verhältnisse von FoxP3 plus- zu T-bet plus- und RORgt plus-Zellen bei CD4DMthfd2-Mäusen im Vergleich zu den WT am Höhepunkt der Erkrankung erhöht, was die In-vitro-Befunde einer erhöhten FoxP3-Expression bei MTHFD2-Mangel widerspiegelt (Abbildung 7G). Obwohl die Häufigkeit von TF-exprimierenden Zellen unter den infiltrierenden Zellen insgesamt höher tendierte, blieb die Häufigkeit der Zytokinexpression unverändert (Abbildungen S6D und S6E). Histologie des Rückenmarks von Kontrollmäusen ohne EAE und WT und CD4^ΔMthfd2Mäuse mit EAE zeigten eine erhöhte Zellularität und CD3-Positivität im Rückenmark von WT-Mäusen, die mit Demyelinisierung assoziiert war, wie durch Luxol Fast Blue-Färbung gezeigt ( 7I ). Diese Veränderungen fehlten bei der Kontrolle ohne EAE und CD4^ΔMthfd2Mäuse.

Die Rolle von MTHFD2 wurde als nächstes in Modellen für IBD und allergische Atemwegserkrankungen getestet. WT- und CD4DMthfd2-naive CD4 plus T-Zellen wurden auf Rag1/Empfänger übertragen, um IBD zu initiieren. Obwohl Mäuse, die WT-Zellen erhielten, mit fortschreitender IBD an Gewicht zu verlieren begannen, nahmen Empfänger von CD4DMthfd2-T-Zellen weiter an Gewicht zu (Abbildung 7J). Signifikant weniger Zahlen und Frequenzen von CD4DMthfd2-T-Zellen wurden in Milzen (Abbildung S6F) und mesenterischen Lymphknoten (MLNs) gefunden, die den Dickdarm entwässern (Abbildungen 7K und S6G). Die Anzahl der T-bet plus -, ROR t plus - und FoxP3 plus CD4DMthfd2-T-Zellen war in MLN ebenfalls verringert, aber die Häufigkeit von FoxP3 plus-Zellen war erhöht ( 7L und 56H ). Zu diesem Zeitpunkt im Spätstadium gab es jedoch keine Unterschiede in den FoxP3/T-bet- und FoxP3/RORgt-Zellzahlverhältnissen in MLNs (Abbildung S6I). Ähnlich wie die Befunde von MTHFD2 als bescheidener Treffer im CRISPR-Screening bei In-vivo-Atemwegsentzündungen (Abbildung 1C) zeigten CD4DMthfd2-Mäuse, die einer Alternaria-induzierten allergischen Atemwegserkrankung ausgesetzt waren, einen Trend zu einer verringerten Neutrophilenhäufigkeit in der bronchioalveolären Lavage-Flüssigkeit (BALF), obwohl nein Veränderungen wurden in der Anzahl der BALF-Lymphozyten, Eosinophilen und Makrophagen beobachtet (Abbildung S7A).

Schließlich wurde die Wirkung des MTHFD2i auf die allgemeine Immunaktivität getestet. OVA-spezifisches OT-II CD45.2^PlusCD4^PlusT-Zellen wurden adoptiv in CD45.1 übertragen^PlusMäuse, die dann subkutan mit einer OVA-Emulsion mit komplettem Freund-Adjuvans (CFA) immunisiert und täglich mit oralem Vehikel oder dem MTHFD2i behandelt wurden. Das Körpergewicht blieb unter allen Bedingungen unverändert (Abbildung S7B). Erweiterung des übertragenen OT-II CD45.2^PlusZellen war bei immunisierten, mit MTHFD2i behandelten Mäusen leicht verzögert, erreichte jedoch die Vehikelzahlen am 7. Tag (Abbildungen S7C–S7E). Allerdings war die Häufigkeit von IFNg-Plus-Zellen bei der Drainage von LNs reduziert (Abbildung S7F). Diese Daten zeigen, dass die In-vivo-Behandlung mit MTHFD2i eine antigenspezifische T-Zell-Expansion nach akuter Stimulation ermöglicht, wenn auch mit gedämpfter entzündlicher Zytokinproduktion.

DISKUSSION

Die Aktivierung, Differenzierung und Funktion von T-Zellen erfordern eine angemessene metabolische Reprogrammierung, um den erhöhten Bedarf der Zellen an Energie, biosynthetischen Bausteinen und Signalmolekülen zu decken. In dieser Studie untersuchten wir die Funktion des 1C-Metabolismus in primären CD4 plus T-Zellen. Unter Verwendung einer Kombination aus CRISPR-basiertem In-vivo-Screening auf primäre T-Zellen und Genexpressionsdaten wurde MTHFD2 als potenzielles Ziel für entzündungshemmende Therapien identifiziert. MTHFD2-Hemmung oder -Mangel führte im Allgemeinen zu einer verringerten Proliferation von CD4 plus T-Zellen. Bemerkenswerterweise war dies mit der Induktion der FoxP3-Expression und der unterdrückenden Funktion in Th17-Zellen sowie mit einer verstärkten Treg-Zelldifferenzierung verbunden. Diese Daten deuten darauf hin, dass MTHFD2 als metabolischer Kontrollpunkt in der Th17-Treg-Zellachse fungieren könnte, wobei die Behandlung mit MTHFD2i das Gleichgewicht von einem pathogenen zu einem eher entzündungshemmenden Phänotyp herstellt. Tatsächlich verbesserten MTHFD2-Hemmung oder genetischer Mangel die Schwere der Erkrankung in mehreren In-vivo-Modellen von Autoimmunität und Überempfindlichkeit.

Der 1C-Stoffwechsel besteht aus dem Serin-Glycin-Stoffwechsel, dem Folatzyklus und dem Methioninzyklus und ist von zentraler Bedeutung für mehrere Prozesse, einschließlich der de novo Purinsynthese, der Methyldonorerzeugung und der Redoxregulation (Yang und Vousden, 2016). Der 1C-Stoffwechsel ist stark an der TCR-Stimulation beteiligt (Tan et al., 2017) und zur Unterstützung der T-Zell-Expansion erforderlich (Ma et al., 2017). Der Folatzyklus ist in zytosolische und mitochondriale Komponenten unterteilt. Im Zytosol wandelt MTHFD1 5, 10-MethylenTHF, 10-FormylTHF und Formiat ineinander um. In Mitochondrien werden die gleichen Reaktionen von MTHFD2 und MTHFD1L durchgeführt. Diese resultierenden Zwischenprodukte werden verwendet, um Formylierungsschritte in der de novo Purinsynthese zu unterstützen. MTHFD1 und MTHFD2 können auch den Redoxzustand durch NAD(H)- und NADP(H)-Erzeugung modulieren (Ducker und Rabinowitz, 2017). Obwohl einige Zelltypen Flexibilität beim Umschalten auf die zytosolische Quelle unter Bedingungen einer Dysfunktion des mitochondrialen Signalwegs zeigen (Ducker et al., 2016), wurde früher vorgeschlagen, dass T-Zellen hauptsächlich vom mitochondrialen Signalweg abhängen, um 1C-Einheiten und reduktive Spezies bereitzustellen (Ron- Harel et al., 2016). Es wurde auch gezeigt, dass T-Zellen auf Serinaufnahme angewiesen sind, und in vivo-Immunantworten können durch diätetische Serinmengen moduliert werden. Die Auswirkungen des Serinmangels werden durch die Begrenzung der Purinbiosynthese selbst bei Vorhandensein intakter Rettungswege vermittelt und können durch die Bereitstellung von Glycin und Formiat umgangen werden (Ma et al., 2017). Unsere Daten ergänzen diese Ergebnisse und weisen auf MTHFD2 als einen kritischen Regulator hin, der CD4 beeinflusst^PlusT-Zell-Proliferation und -Differenzierung.

Echanicosid

Obwohl der 1C-Stoffwechsel eine breite Rolle im Zellstoffwechsel spielt, fanden wir heraus, dass einige Funktionen für ausgewählte T-Zell-Untergruppen unterschiedlich waren. Alle T-Zellen von Mensch und Maus vermehrten sich bei MTHFD2-Mangel in geringerem Maße, was auf eine gemeinsame Funktion von MTHFD2 zur Unterstützung des Wachstums und der Teilung von T-Zellen hinweist. Die Auswirkungen des MTHFD2-Mangels auf die T-Zell-Differenzierung und die Effektorfunktion waren jedoch in jeder getesteten Untergruppe unterschiedlich. Th1-Zellen zeigten eine gestörte Differenzierung mit reduzierter T-bet-Induktion und verminderter Zytokinproduktion. Th17-Zellen hatten auch eine veränderte Differenzierung und eine verringerte Zytokinproduktion. Obwohl ROR t nicht verändert wurde, regulierten MTHFD2--defiziente Th17-Zellen den Treg-Zell-TF FoxP3 hoch und erlangten die Fähigkeit, die Proliferation von aktivierten CD8-plus-T-Zellen zu unterdrücken. Treg-Zellen zeigten eine verstärkte Differenzierung unter niedrigen TGF-b-Bedingungen. Es ist mittlerweile allgemein bekannt, dass jede dieser Untergruppen unterschiedliche metabolische Anforderungen haben kann (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Unsere Daten zeigen, dass MTHFD2 auch selektiv für Teff-Zellen benötigt wird, während es das Schicksal und die Funktion von Treg-Zellen fördert. Es ist bemerkenswert, dass sich diese Ergebnisse von GLUT1-, GLS- oder ASCT2-Mangel unterscheiden, die die Teff-Zelldifferenzierung beeinträchtigen oder verändern, während sie bescheidene Auswirkungen haben, um die Treg-Zelldifferenzierung oder Transdifferenzierung von Th17 zu Treg-Zellen direkt zu fördern (Johnson et al., 2018; Macintyre et al ., 2014; Nakaya et al., 2014).

Diese unterschiedlichen Schicksale der T-Zellen scheinen von der enzymatischen Aktivität von MTHFD2 abzuhängen, da die Wirkungen des MTHFD2-Mangels mit Formiat- oder Purin-Nukleobasen gerettet wurden. Obwohl wir keinen signifikanten Effekt einer veränderten Redoxbalance bei MTHFD2-Mangel fanden, scheint eine veränderte De-novo-Purinsynthese kritisch zu sein. Die Behandlung mit MTHFD2i führte zu verringerten Purinkonzentrationen, insbesondere Guanin, während sie gleichzeitig eine Akkumulation der Purinsynthese-Zwischenprodukte GAR, SAICAR und AICAR induziert. Diese Zwischenprodukte erfordern eine Formylierung für die weitere Biosynthese, und die Wirkungen wurden gerettet, als das von MTHFD2- abgeleitete Metabolitformat dem Medium hinzugefügt wurde, was einen zielgerichteten biochemischen Mechanismus für MTHFD2i unterstützt. Die De-novo-Nukleotidsynthese zur Unterstützung der DNA- und RNA-Synthese ist essentiell für die T-Zell-Proliferation (Que´ me´ neur et al., 2003, 2004). Somit scheint eine Komponente des Mechanismus, durch den MTHFD2i die T-Zell-Expansion beeinträchtigt, eine unzureichende Nukleotiderzeugung zu sein.

Flavonoid

Wenn keine ausreichenden Nukleotide synthetisiert werden, können Effektor-T-Zellen durch mehrere Mechanismen unterdrückt werden. AMPK und mTORC1 sind wichtige Treiber der metabolischen Reprogrammierung mit im Allgemeinen gegensätzlichen Rollen in Teff- und Treg-Zellen (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Wir zeigen, dass die MTHFD2i-Behandlung in T-Zellen zu einer akuten Akkumulation von AICAR führte, einem Metaboliten, der als Adenosin-Analogon und AMPK-Aktivator bemerkenswert ist (Rae und Mairs, 2019; Su et al., 2019). Zu den ausgewählten Zeitpunkten gab es jedoch keine Hinweise auf eine erhöhte AMPK-Aktivität. Dies kann eine zusätzliche Regulierung von AMPK widerspiegeln, aber AICAR kann auch AMPK-unabhängige Wirkungen haben (Dembitz et al., 2019). mTORC1 ist auch empfindlich gegenüber Purinkonzentrationen, da eine verringerte Verfügbarkeit von Guanin die Aktivität des mTORC1-Aktivators Rheb unterdrückt (Emmanuel et al., 2017; Hoxhaj et al., 2017). Die Akkumulation von AICAR und die Verringerung der mTORC1-Aktivität können somit zu einer beeinträchtigten Bildung von mit MTHFD2i behandelten Th1- und Th17-Zellen und einer verstärkten Bildung von Treg-Zellen beitragen. Die Unterdrückung der mTORC1-Signalgebung kann auch zur Verschiebung des Stoffwechselprogramms von der Glykolyse zur mitochondrialen Atmung und zu einer veränderten Häufigkeit von TCA-Metaboliten in MTHFD2i-behandelten Th17-Zellen beitragen. Der mTORC1-Weg spielt eine zentrale Rolle bei der Förderung des anabolen Stoffwechsels und kann die Akkumulation des TF ATF4 vorantreiben, was wiederum die MTHFD2-Expression induzieren kann (Ben-Sahra et al., 2016).

Der Stoffwechselfluss ist an die epigenetische Regulation gebunden, da Metaboliten zu vielen epigenetischen Modifikationen beitragen (Sharma und Rando, 2017), einschließlich des 1C-Stoffwechsels zur Erzeugung des universellen Methyldonors S-Adenosylmethionin (SAM) für die Protein- und DNA-Methylierung. Kohlenstoffverfolgungsexperimente in aktivierten T-Zellen deuten jedoch darauf hin, dass 1C-Einheiten, die von Glucose-abgeleitetem und exogenem Serin stammen, nicht wesentlich zum Methioninzyklus und zur Methylierung beitragen (Ma et al., 2017). Der metabolische Fluss kann auch Methylierungsmuster durch Änderungen in der Häufigkeit von TCA-Metaboliten, einschließlich Alpha-Ketoglutarat, Fumarat und Succinat, beeinflussen. Fumarat und Succinat hemmen insbesondere DNA- und Histon-Demethylasen (Su et al., 2016). In Übereinstimmung mit der Depletion dieser Metaboliten in mit MTHFD2i behandelten Th17-Zellen wurde H3K27me3 im gesamten Genom stark reduziert, und die DNA-Methylierung wurde speziell am proximalen Foxp3-Promotor reduziert, was möglicherweise zum Transdifferenzierungsphänotyp beiträgt. Der Phenotyp der Th17-Zelltransdifferenzierung wurde durch Formiat-Supplementierung nicht gerettet, was darauf hindeutet, dass wahrscheinlich zusätzliche Wege zur FoxP3-Regulierung beitragen, beispielsweise durch die Aktivität anderer Mechanismen zur Erkennung der Nukleotidkonzentration

Acteosid (Verbascosid)

Es wurde auch berichtet, dass MTHFD2 nicht-enzymatische Rollen spielt, die zu den entzündungsfördernden Wirkungen dieses Enzyms beitragen können. In Krebszellen kann MTHFD2 Kernfunktionen haben, indem es sich mit DNA-Replikationsstellen kolokalisiert, um das Fortschreiten des Zellzyklus zu fördern (Gustafsson Sheppard et al., 2015). In murinen Stammzellen wurde gezeigt, dass MTHFD2 die DNA-Reparatur moduliert, um die genomische Stabilität aufrechtzuerhalten (Yue et al., 2020). Beim Nierenzellkarzinom hat sich MTHFD2 als entscheidend für die metabolische Reprogrammierung über mRNA-Methylierung herausgestellt (Green et al., 2019). Obwohl sich diese Rollen für MTHFD2 mit unseren Ergebnissen nicht gegenseitig ausschließen, legt die Fähigkeit von Formiat, viele der Phänotypen des MTHFD2-Mangels in T-Zellen zu retten, nahe, dass die enzymatische Aktivität von MTHFD2 der primäre Treiber für die Proliferation und das Schicksal von T-Zellen ist.

MTHFD2 wurde weitgehend als Wirkstoffziel in der Krebsbekämpfung angesehen. Es kann auch ein vielversprechendes entzündungshemmendes Ziel sein und im Vergleich zu derzeit verfügbaren Anti-Folaten weniger Nebenwirkungen haben, da es in den meisten Geweben von Erwachsenen nur wenig exprimiert wird. Beispielsweise wird ein Target von MTX, DHFR, extensiv in erwachsenen Geweben exprimiert (Nilsson et al., 2014). Daher kann MTX mit einer Vielzahl von Nebenwirkungen in Verbindung gebracht werden, einschließlich gastrointestinaler Toxizität. Darüber hinaus ist der Wirkungsmechanismus von MTX trotz seiner langen Geschichte noch wenig verstanden (Cronstein und Aune, 2020). Die stark regulierte Expression von MTHFD2 und das Potenzial für eine Redundanz mit dem zytosolischen MTHFD1-Weg können zu einer selektiven Abhängigkeit spezifischer Zellpopulationen von MTHFD2 führen. Unsere Ergebnisse identifizieren MTHFD2 als kritischen metabolischen Kontrollpunkt in CD4^PlusT-Zellen. Obwohl es eine breite Überschneidung zwischen der Krebszellbiologie und der Biologie schnell proliferierender T-Zellen gibt, stellen wir fest, dass CD4 plus T-Zell-Untergruppen eine zusätzliche Sensitivität durch Modulation der Zelldifferenzierung und -funktion aufweisen. Es ist wahrscheinlich, dass das Targeting von MTHFD2 in Krebstherapien die Anti-Tumor-Immunität einschränken kann. Situationen wie das kolorektale Karzinom, bei denen eine Th17-Zell-vermittelte Entzündung zur Erkrankung beiträgt, können jedoch gut für MTHFD2is geeignet sein. Die T-Zell-Sensitivität gegenüber MTHFD2is kann eine wirksame Form der Immuntherapie bei CD4 sein^PlusT-Zell-gesteuerte Entzündungen jenseits von Krebs und führen zu weniger Nebenwirkungen als derzeit verfügbare Therapeutika.

Grenzen des Studiums

Das in dieser Studie verwendete MTHFD2i hat einen IC50-Wert von 0,0063 mM für MTHFD2 und 0,57 mM für MTHFD1; daher können geringfügige Off-Target-Effekte der dualen Hemmung von MTHFD2 und MTHFD1 nicht ausgeschlossen werden. Angesichts der Tatsache, dass die fehlerhafte FoxP3-Hochregulierung in Th17-Zellen nicht durch die Bereitstellung von Formiat gerettet wurde, die mTORC1-Aktivität jedoch, erfordert der diesem Phänotyp zugrunde liegende Mechanismus weitere Untersuchungen. Darüber hinaus wurden alle In-vivo-Modelle mit MTHFD2i-Behandlung oder genetischer Ablation ab dem Zeitpunkt der Krankheitsinduktion durchgeführt, und die T-Zell-Phänotypisierung wurde zu einem einzigen Zeitpunkt durchgeführt. Um die Wirkung des MTHFD2-Mangels auf die Pathogenese der Krankheit besser zu charakterisieren, sollten weitere Studien Zeitverlaufsexperimente mit serieller Charakterisierung von T-Zellpopulationen umfassen, um definitiver zu bestimmen, ob CD4 plus T-Zell-Untergruppen in vivo unterschiedlich betroffen sind. Um die Relevanz dieser Studie für klinische Anwendungen zu verbessern, sollte schließlich die Wirksamkeit einer MTHFD2i-Behandlung, die nach dem Ausbruch der Krankheit begonnen wurde, getestet werden.

STAR★METHODEN

Detaillierte Methoden werden in der Online-Version dieses Dokuments bereitgestellt und umfassen Folgendes:

• TABELLE DER WICHTIGEN RESSOURCEN

• VERFÜGBARKEIT VON ROHSTOFFEN

• B Leitungskontakt

• B Materialverfügbarkeit

• B Daten- und Codeverfügbarkeit

  
  

• EXPERIMENTELLES MODELL UND DETAILS ZUM THEMA

• B Mäuse B Menschliche T-Zellen

• B-Zelllinien

  
  

• METHODENDETAILS

• B In-vitro-Maus-CD4^PlusT-Zell-Aktivierung und -Differenzierung

• B-Th17-Zellsuppressionsassay

• B Humanes CD4 in vitro^PlusT-Zellkulturbedingungen

• B CRISPR-Screening B Massenspektrometrie-Metabolomik

• B Protonen-Kernresonanzspektroskopie (1H-MRS)

• B Immunoblotting

• B CUT&RUN B EpigenDx Gezielte Bisulfifit-Sequenzierung der nächsten Generation

• B In-vivo-EAE-Modelle für IHC und Durchflusszytometrie

• B In-vivo-Behandlung von LY345899 im EAE-Modell

• B In-vivo-DS18561882-Behandlung im DTH-Modell B In-vivo-IBD-Modell mit WT und CD4^ΔMthfd2Wurfgeschwister

• B In-vivo-Modell für allergische Atemwegserkrankungen mit WT und CD4^ΔMthfd2Wurfgeschwister

• B In-vivo-DS18561882-Behandlung im OVA-Immunisierungsmodell

  
  

• QUANTIFIZIERUNG UND STATISTISCHE ANALYSE

ZUSÄTZLICHE INFORMATIONEN

Ergänzende Informationen finden Sie online unter https://doi.org/10.1016/j. immun.2021.10.011.

DANKSAGUNGEN

Wir danken den Mitgliedern des Rathmell-Labors für ihren Beitrag zu diesem Projekt. Wir danken Thomas Aune für die Bereitstellung von RNA-seq-Daten und J. Cools (VIB) für die Bereitstellung des pMx-U6--gRNA-GFP-Konstrukts. Wir danken Max R. Van Belkum für die Entwicklung der MTHFD2-qPCR-Primer. Wir danken Nello Mainolfifi, Vipin Suri, Adam Friedman und Mark Manfredi von Raze Therapeutics, Inc. (Boston, MA) für die Bereitstellung der Verbindung Raze 1459, die zur Bestätigung der Ergebnisse verwendet wurde (Daten nicht gezeigt). Diagramme wurden mit BioRender erstellt. Wir danken der Translational Pathology Shared Resource, unterstützt vom NCI/NIH Cancer Center Support Grant 5P30 CA68485-19 und dem Shared Instrumentation Grant S10 OD023475-01A1, für den Leica Bond RX. Diese Arbeit wurde unterstützt durch den William E. Paul Distinguished Innovator Award für die Lupus Research Alliance (an JCR), R01s DK105550 (an JCR), HL136664 (an JCR und DCN), CA217987 (an JCR), AI153167 (an JCR), AI137075 (an AKM), T32 DK101003 (KV) und T32 GM007347 (an AS).

AUTORENBEITRÄGE

AS, GA und JCR gestalteten die Forschung. AS, GA, KV, DRH, XX, MZM, XY, KLB, NC, MMW, ACY, DLG, AES, SKS, SNF, AMC, PF, TB und JCG-C. die Recherche durchgeführt. AS-, GA-, XY-, JK-, DCN-, AKM-, JDR- und JCR-analysierte Daten. AS und JCR haben das Papier mit Beiträgen der anderen Autoren geschrieben.

INTERESSENERKLÄRUNG

JCR ist Gründer, Mitglied des wissenschaftlichen Beirats und Aktionär von Sitryx Therapeutics; Mitglied des wissenschaftlichen Beirats und Aktionär von Caribou Biosciences; Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von NirogyTherapeutics; hat in den letzten 3 Jahren Merck, Pfizer und Mitobridge beraten; und erhielt Forschungsunterstützung von Incyte Corp., CalitheraBiosciences und Tempest Therapeutics. JDR ist Mitbegründer und Anteilseigner von Raze Therapeutics, Toran, Serien Therapeutics und Farber Partners sowie Berater und Anteilseigner von Agios Pharmaceuticals, Kadmon Pharmaceuticals, Bantam Pharmaceuticals, Colorado Research Partners, RafaelHoldings, dem Barer Institute und LEAF Pharmaceuticals; Er hat Beratungshonorare und Forschungsgelder von Pfizer und Rafael erhalten und ist der Erfinder von Patenten der Princeton University. AMC, PF und TB sind Mitarbeiter von Sitryx Therapeutics.

INKLUSION UND VIELFALT

Wir haben daran gearbeitet, bei der Auswahl nichtmenschlicher Versuchspersonen ein ausgewogenes Geschlechterverhältnis zu gewährleisten. Einer oder mehrere der Autoren dieses Artikels bezeichnen sich selbst als eine unterrepräsentierte ethnische Minderheit in der Wissenschaft. Während wir für diese Arbeit wissenschaftlich relevante Referenzen zitierten, arbeiteten wir auch aktiv daran, das Geschlechtergleichgewicht in unserer Referenzliste zu fördern. Die Autorenliste dieses Papiers umfasst Mitwirkende aus dem Ort, an dem die Forschung durchgeführt wurde, die an der Datenerhebung, dem Design, der Analyse und/oder der Interpretation der Arbeit beteiligt waren.

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STAR★METHODEN

TABELLE DER WICHTIGEN RESSOURCEN

VERFÜGBARKEIT VON ROHSTOFFEN

Kontakt führen

Weitere Informationen und Anfragen nach Ressourcen und Reagenzien sind an den Lead Contact, Dr. Jeffrey Rathmell (jeff.rathmell@vumc.org), zu richten und werden nach Abschluss des entsprechenden MTA erfüllt.

Materialverfügbarkeit

Plasmide und Mauslinien, die in dieser Studie generiert wurden, werden nach Abschluss der entsprechenden MTA auf Anfrage zur Verfügung gestellt.

Daten- und Codeverfügbarkeit

CUT&RUN-Sequenzdaten wurden bei GEO hinterlegt und sind ab dem Datum der Veröffentlichung (GSE180356) öffentlich zugänglich. Mikroskopiedaten und Original-Western-Blot-Bilder, die in diesem Dokument berichtet werden, werden auf Anfrage vom Hauptansprechpartner weitergegeben. Alle zusätzlichen Informationen, die für die erneute Analyse der in diesem Dokument berichteten Daten erforderlich sind, sind auf Anfrage beim leitenden Ansprechpartner erhältlich.

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