Mehrfarbige Bildgebung von kalziumbindenden Proteinen in menschlichen Nierensteinen zur Aufklärung der Auswirkungen von Proteinen auf das Kristallwachstum

edmund.chen@wecistanche.com

NiereDie Steinkrankheit ist eine häufige Erkrankung, von der 1,7–14,8 Prozent der Bevölkerung mindestens einmal im Leben betroffen sind1,2. In bis zu 50 Prozent der Fälle tritt diese Krankheit innerhalb von 5 Jahren nach dem ersten Schub wieder auf. Trotz der Bedeutung dieses Gesundheitsproblems ist eine präventive Therapie der Steinbildung nicht verfügbar. Verständnis der Pathogenese vonNiereSteinbildung ist wichtig, um das Auftreten und Wiederauftreten von zu reduzierenNiereSteinkrankheit3. Etwa 80 Prozent derNiereSteine ​​sind Calciumoxalat (CaOx)-Steine4,5. CaOx-Steine ​​bestanden zu etwa 90 Prozent aus Mineralphase, dh CaOx, das weiter in Calciumoxalat-Monohydrat [Ca(C2O4)·H2O](COM) und Calciumoxalat-Dihydrat [Ca(C2O4)·2H2O](COD) kategorisiert wird, und ein relativ kleiner Anteil organischer Substanz, der als Department of Nephro‑Urology, Graduate School of Medical Sciences, Nagoya City University, 1‑Kawasumi, Mizuho‑cho, Mizuho‑Ku, Nagoya 467‑8601, Japan angesehen wird . 2Institute for Advanced Co-Creation Studies, Osaka University, 2-1, Yamadaoka, Suita 565-0871, Japan. 3Graduate School of Engineering, Osaka University, 2-1, Yamadaoka, Suita 565-0871, Japan. 4Graduate School of Life and Environmental Sciences, Kyoto Prefectural University, 1-5, Hangi-cho, Shimogamo, Sakyo-ku, Kyoto, Kyoto 606-8522, Japan. 5Department of Earth Science, Tohoku University, 6-3 Aza-Aoba, Aramaki, Aoba-ku, Sendai 980-8578, Japan. 6Nationalmuseum für Natur und Wissenschaft, 4-1-1 Amakubo, Tsukuba 305-0005, Japan. 7Health and Medical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2217-14, Hayashi-cho, Takamatsu, Kagawa 761-0395, Japan. 8Tajiri Thin Section Laboratory, 3-1-11 Sannose, Higashiosaka, Osaka 577-0849, Japan. 9Institute of Laser Engineering, Osaka University, 2-6, Yamadaoka, Suita City, Osaka 565-0871, Japan. *E-Mail: maruyama@cryst.eei.eng.osaka-u.ac.jp; a-okada@med.nagoya-cu.ac.jp

Schlüsselwörter:Niere; Nierenstein; Nierenerkrankung; Nieren; Nierenphysiologie

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENVERSAGEN VERBESSERN

als Proteinmatrix6. Die Pathogenese derNiereDie Steinbildung umfasst mehrstufige Prozesse mit komplexen Wechselwirkungen zwischen mineralischen Komponenten und Proteinmatrix7,8. Mehr als 100 Arten von Proteinen wurden in identifiziertNiereSteine9–11. Darunter spielen mehrere Proteine, insbesondere Calcium-bindende Proteine, eine wichtige Rolle bei CaOx-Steinbildungsprozessen12–16. Die spezifischen Wirkungen dieser Proteine ​​wurden in vielen Schritten der Steinbildung, einschließlich Kristallkeimbildung, Kristallwachstum, Kristallaggregation und Kristalladhäsion, mit zahlreichen In-vitro-Kristallisationsstudien intensiv untersucht17–19. In-vitro-Studien sind nützlich, um die Auswirkungen spezifischer Proteine ​​auf die spezifischen Schritte bei der Steinbildung zu bewerten. In realen Steinbildungsumgebungen wirken jedoch mehrere Proteine ​​gleichzeitig, und die Urinzusammensetzung in den Konzentrationen von Proteinen, Calciumionen und Oxalat schwankt. Diese Sorge motivierte uns, den echten Menschen zu untersuchenNiereSteinen, um die wahren Auswirkungen von Proteinen auf das Kristallwachstum herauszufinden. In den meisten früheren Studien war die Identifizierung der Proteine ​​inNiereSteinen wurde nach dem Zerkleinern und Extrahieren massenspektroskopisch durchgeführt9–11. Dadurch gehen Informationen über die räumliche Verteilung von Proteinen im Stein verloren. In sehr begrenzten Untersuchungen ist die Proteinidentifizierung inNiereSteinen wurde mit Scheibenschnitten von Nierensteinen durchgeführt, bei denen CaOx-Kristalle durch Entkalkung vollständig entfernt wurden20,21. Dieser Ansatz ist nützlich, um die Verteilung eines Proteins in zu findenNiereSteinen, die möglicherweise helfen, spezifische Proteineffekte auf die Steinbildung zu verstehen. Allerdings ist eine große Menge an Informationen über die Steinbildung in aufgezeichnetNiereSteinkristalle, geht bei dieser Methode verloren. Die Bedeutung von Mineralinformationen von Nierensteinen, die durch die Identifizierung von Kristallphasen und die Kristalltexturklassifikationen gewonnen werden können, die unter Verwendung von Scheibenschnitten und polierten Dünnschliffen durchgeführt werdenNiereSteinen mit optischer Mikroskopie wurde in mehr als 70 Jahren früherer Studien gezeigt22,23.

Das Fehlen der Analyse zur Bewertung von Proteinverteilungen mit reinen CaOx-Kristallen inNiereSteine ​​war ein erhebliches Hindernis für das Verständnis der Steinbildung. Eine koordinierte Auswertung von Proteinverteilungen und Kristallphasen/Morphologien kann signifikante Informationen über die Geschichte der Steinbildung liefern. Multiple Immunfluoreszenzfärbung (Multi-IF-Färbung) wurde verwendet, um die Verteilung von zwei oder mehr Proteinen in vielen Arten von Weichgeweben biologischer Proben zu zeigen24. Die Anwendung der Technik auf Knochengewebe, das aus porösen Calciumphosphatkristallen besteht, lieferte auch bedeutende Einblicke in die dynamische Regulierung der Knochenmineralhomöostase25. Dies wurde jedoch nicht zur Untersuchung verwendetNiereSteine, die aus dichten und harten Kristallen bestehen, obwohl eine einzelne Immunfluoreszenzfärbung verwendet wurde, um die Verteilung eines spezifischen Proteins in entkalkten Proben zu zeigenNiereSteine, die keine Mineralinformationen enthalten20,21. Diese Studie untersuchte die Bedingungen, die die Multi-IF-Färbung von ermöglichenNiereSteinproben, um die ursprünglichen Mineralinformationen zu erhalten. Wir untersuchten die Verteilung von drei verschiedenen Proteinen, Osteopontin (OPN),Nieren-Prothrombinfragment 1 (RPTF-1) und Calgranulin A (Cal-A) in dünnen Schnitten von CaOx-Steinen. Diese Proteine ​​kommen in den meisten CaOx-Steinen vor und sind als kalziumbindende Proteine ​​bekannt, die möglicherweise die Bildung von CaOx-Steinen beeinflussen26–28. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Studie, in der mehrere Matrixproteine ​​in einem gleichzeitig visualisiert werdenNiereStein. Wir interpretieren ferner die unterschiedlichen in vivo-Effekte jedes Proteins auf das Wachstum von CaOx-Kristallen basierend auf ihren Verteilungen, physikalisch-chemischen Eigenschaften und den komplexen Änderungen der physikalischen Umgebung jedes Proteins während der Bildung von CaOx-Steinen.

CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/RENALE DIALYSE VERBESSERN

Ergebnisse

Basierend auf mikroskopischer Beobachtung, gekoppelt mit FT-IR-Analyse, Domänen derNiereSteinproben wurden in drei Arten von Texturen kategorisiert, die mit der von Schubert und Brien23 berichteten übereinstimmen: unregelmäßige Textur aus euhedralen CSB-Kristallen (Typ 1, bezeichnet als euhedrales CSB-Aggregat; Abb. 1c), Mosaiktextur aus unregelmäßig orientierten COM Kristalle (Typ 2, bezeichnet als Mosaik-COM; Abb. 1f) und konzentrisch laminierte COM-Kristalle (Typ 3, bezeichnet als konzentrisches COM; Abb. 1i). Die meisten der beobachteten CaOx-Steinproben bestanden aus diesen drei Texturen (Tabelle 1). Das für biologische Proben verwendete Multi-IF-Färbeprotokoll wurde auf die Analyse von Dünnschnitten angewendetNiereGesteinsproben, die durch ein typisches geologisches Verfahren hergestellt wurden. Für die Anwendung wurde der Ätzzustand des Dünnschliffs vor der Färbung angepasst und es zeigte sich, dass die Visualisierung nur dann erfolgreich war, wenn der polierte Dünnschliff leicht angeätzt wurde (mit einer pH 6,0 Citratlösung für 1 min ) vor dem typischen Färbeprozess. Die Multi-IF-Färbung ermöglichte die Co-Visualisierung von drei Proteinen in verschiedenen Farben (OPN: Grün, RPTF-1: Blau und Cal-A: Rot) in den drei verschiedenen Steintexturen.

Wir fanden heraus, dass jedes Protein abhängig von seiner Position in COM und COD ein charakteristisches Verteilungsmuster aufwies. Die euhedralen CSB-Aggregate wurden in 7 Proben von 15 Proben gefunden (Tabelle 1). Die euhedralen CSB-Aggregate waren überwiegend an der Peripherie von CaOx vorhandenNiereSteine ​​(Abb. 1a–c). Es ist bekannt, dass diese COD-Kristalle eine tetragonale Bipyramidenform haben, die aus {101}-Flächen besteht29. Viele der COD-Bipyramiden haben auch eine {110}-Fläche an der Spitze beider Pyramiden (Abb. 2b und ergänzende Abb. S1). Ein Multi-IF-Färbungsbild der COD-Kristalle ist in Fig. 2a gezeigt, und OPN präsentiert sich periodisch auf der {110}-Fläche von COD, wie durch weiße Pfeile in Fig. 2c gezeigt. Diese Fläche ist dieselbe Fläche der Bipyramidenspitze, die beim typischen COD-In-vitro-Kristallwachstum29 nicht erscheint. RPTF-1 erschien als parallele Schichten entlang der {101}-Fläche mit Intervallen im µm-Maßstab, wie durch den gelben Pfeil in Fig. 2d gezeigt. Diese Kristallfläche ist charakteristisch für das typische COD-Wachstum29. Cal-A war außerhalb der COD-Kristalle vorhanden und zeigte keine bevorzugte Adsorption auf bestimmten Flächen (Fig. 2e). Die gleichen Verteilungsmuster wurden in anderen Steinproben beobachtet (ergänzende Abb. S2). Die Mosaik-COM-Textur ist die am weitesten verbreitete Textur in CaOx-Steinen (Abb. 1d–f). Diese Textur wurde in 12 von 15 Proben beobachtet (Tabelle 1). Die Multi-IF-Färbung des Mosaik-COM ist in Abb. 3a, b dargestellt. OPN und RPTF-1 waren in allen COM-Kristallen vorhanden (Abb. 3c, d). Umgekehrt war Cal-A ausschließlich entlang der Korngrenzen vorhanden (dh auf den Oberflächen von COM-Körnern) (Abb. 3e). Wir haben ferner ein Linienintensitätsprofil der Proteine ​​analysiert, wie in Abb. 3a gezeigt, um jedes Proteinverteilungsmuster im Detail zu bewerten (gelbe Linie in Abb. 4a). OPN und RPTF-1 zeigten höhere Intensitäten im Kristallbereich, während Cal-A eine geringere Intensität im Kristallbereich zeigte

Kristallfläche (Abb. 4b). Die hohe Intensität von Cal-A wurde ausschließlich entlang der Kristallgrenzen beobachtet. Diese Proteinverteilungen wurden in vielen Proben beobachtet, obwohl die Größen und Formen der COM-Körner unterschiedlich waren (ergänzende Abb. S3). Die konzentrische COM ist auch eine typische Textur in CaOx-Steinen (Abb. 1g–i). Wir fanden diese Textur in 10 von 15 Proben (Tabelle 1). OPN, RPTF-1 und Cal-A waren in konzentrischen Schichten verteilt (Abb. 5a). OPN und RPTF-1 waren als konstante und regelmäßige Schichten in den COM-Kristallen vorhanden, wodurch ein Intervall im µm-Maßstab entstand (Abb. 5b, c). Im Gegensatz dazu bestand die Cal-A-Verteilung aus unregelmäßigen Schichten mit relativ großen Intervallen, die sich auf der äußeren Oberfläche des Steins befanden (Abb. 5d). Die SEM-Untersuchung zeigte eine Lückenschicht in der Nähe jeder Cal-A-Schicht (Abb. 6a, b). Beide Oberflächen, die den Spaltraum bildeten, waren mit winzigen Ablagerungen besetzt, die sich deutlich von den Haupt-COM-Kristallen unterschieden, aus denen sich das konzentrische COM zusammensetzte (Abb. 6c, d). Die Linienintensitätsprofile dieser Proteine ​​im konzentrischen COM zeigten Spitzen in jedem Proteinprofil (Abb. 4c, d). Die Profile von OPN und RPTF-1 waren ähnlich (dh 5,58 ± 2,70 µm/Schicht von OPN und 5,99 ± 2,56 µm/Schicht von RPTF-1) (Ergänzungstabelle S1). Die Cal-A-Schichten hatten jedoch deutlich größere Intervalle (dh 23,17 ± 18,57 µm/Schicht) als OPN und RPTF-1. Ähnliche Verteilungsmuster und Intervalle wurden in den meisten anderen 9 Proben gesehen, obwohl die Cal-A-Schicht in einigen Proben nicht gesehen wurde (ergänzende Abb. S4 und Tabelle S1).

In dieser Studie hatten die Anteile der drei Texturen in CaOx-Steinen und die Verteilungen der drei Proteine ​​in den drei Texturen keinen eindeutigen Zusammenhang mit Alter und Geschlecht des Steinbildners, obwohl die Menge der untersuchten Steine ​​für eine Korrelationsanalyse nicht ausreichte . Es ist bekannt, dass OPN, RPTF-1 und Cal-A in CaOx-Steinen vorhanden sind, basierend auf dem Nachweis aus den Extrakten von Steinpulvern mit Elektrolyse9–11. Mikroskalige Verteilungen von OPN in entkalkenden CaOx-Steinen mit immunzytochemischer Technik zeigten OPN-Verteilungen in den konzentrischen Lamellen in CaOx-Steinen21,30. Das vorliegende Verfahren visualisierte anschaulich die Positionen von drei verschiedenen Proteinen in zuvor betrachteten "organischen Schichten" (Abb. 7a, b). Das Verteilungsmuster von OPN, das wir in der vorliegenden Studie im konzentrischen COM zeigen, stimmt mit früheren Beobachtungen überein. Wir fanden weiter heraus, dass das Verteilungsmuster von RPTF-1 im konzentrischen COM fast dasselbe ist wie das von OPN, wohingegen sich die Verteilung von RPTF-1 in COD-Kristallen von der von OPN unterscheidet. Umgekehrt unterscheidet sich das Verteilungsmuster von Cal-A vollständig von den anderen beiden Proteinen. Diese verschiedenen mikroskaligen Verteilungen von OPN, RPTF-1 und Cal-A zeichnen die Geschichte der CaOx-Steinbildung auf.

Diskussion

Der primäre Kontrollfaktor des Proteineinbaus in Kristalle.Sowohl OPN als auch RPTF{{0}} waren in euhedralen COD-Kristallen, Mosaik-COM-Körnern und konzentrischem COM vorhanden (Abb. 2a, 3a und 5a). Dieser Befund bestätigt, dass diese Proteine ​​sowohl in COD- als auch in COM-Kristallen eingebaut sind. Cal-A war auf der Außenseite von euhedralen COD-Kristallen und um Mosaik-COM-Körner herum vorhanden (Fig. 2e und 3e). Im Fall der konzentrischen COM deutet ein typischerweise um die Cal-A-Schichten herum gefundener Lückenraum darauf hin, dass die Cal-A-Schichten nicht in den Kristallen enthalten, sondern auf der Kristalloberfläche verteilt sind (Abb. 5d und 6a–d). Diese Verteilungen zeigen, dass OPN und RPTF-1 dazu neigen, in CaOx-Kristalle eingebaut zu werden, während Cal-A kaum eingebaut wird. Die Proteinadsorption und der Einbau in CaOx-Kristalle werden theoretisch durch die Bindungskraft ihrer Aminosäureseitenketten und andere spezifische Eigenschaften der jeweiligen Proteine ​​wie elektrostatische negative Ladung31,32 beeinflusst. Die Nettoladung zeigt an, dass OPN und RPTF-1 negativer geladen sind als Cal-A, mit isoelektrischen Punkten von OPN, RPTF-1 und Cal-A von 3,5, 2,5–3.{{28} } bzw. 6,5–7,033–35. Von Te OPN, RPTF-1 und Cal-A ist bekannt, dass sie Calcium-bindende Domänen haben36–38. Diese Domänen können zusätzlich als lokale Bindungsstellen an den wachsenden Kristalloberflächen wirken. Die Calcium-bindenden Domänen von OPN, RPTF-1 und Cal-A können 10, 7 bzw. 2 Calciumionen binden36–38. Allerdings verursachen die Bulk- und lokalen Affinitäten dieser Proteine ​​zum positiv geladenen Ca auf der Oberfläche von CaOx die unterschiedliche Einbaueffizienz dieser Proteine ​​in CaOx. Das Kristallwachstum erfolgt durch Einbau von Wachstumseinheiten in Stufen und Knickstellen, die auf Kristalloberflächen erscheinen39,40 . Dreidimensionale Kompatibilitäten zwischen Proteinen und wachsenden Kristalloberflächen würden bestimmt

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENSCHMERZEN VERBESSERN

das Ausmaß des Proteineinbaus in die Kristalloberfläche. Proteine ​​mit einer starken Bindungsfähigkeit an die wachsenden Knickstellen und Stufen neigen dazu, effizienter in den wachsenden Kristall eingebaut zu werden41–43. Die derzeit berichteten Verteilungen und die Calciumaffinitäten der drei Proteine ​​legen nahe, dass die starke Affinität von OPN und RPTF-1 die Bindung und den Einbau in COD- und COM-Kristalle erleichtert. Umgekehrt haftet Cal-A, das eine geringere Affinität hat, nur an der Kristalloberfläche, wird aber nicht in den Kristall eingebaut. Eine frühere Studie, die höhere Raten des Peptideinbaus in COM durch stärker phosphorylierte Peptide zeigte, unterstützt diese Erklärung43. Diese Diskussionen würden es uns ermöglichen, die Verteilungen vieler anderer Proteine ​​basierend auf ihren kalziumbindenden Eigenschaften vorherzusagen.

Selektive In-vivo-Absorption und Hemmwirkung von OPN und RPTF-1 auf das CaOx-Kristallwachstum.Es wurde angenommen, dass die euhedralen CSB-Kristalle, die überwiegend an der Peripherie von CaOx-Steinen vorhanden sind, mit einer charakteristischen laminierten Textur wachsen, in der sich die sogenannte „organische Substanzschicht“ und „Mineralschicht“ während des Kristallwachstums abwechseln44,45. Obwohl die genauen Gründe für die Schichtverschiebung unklar bleiben, umfassen mögliche Erklärungen die Umweltveränderungen im menschlichen Wirt,NierePhysiologie und biochemische Veränderungen im Urin sowie kinetische Feedback-Mechanismen, die oszillierende Zonierungsstrukturen bilden, die in Mineralien zu finden sind8. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass OPN und RPTF-1 eine laminierte Textur aufbauen, die den {110} bzw. {101} der COD-Flächen als intrakristalline Proteine ​​entsprechen, während Cal-A nicht in der laminierten Textur enthalten ist (Abb. 2c –e). Dieser In-vivo-Nachweis einer oberflächenselektiven Adsorption/Inkorporation von Proteinen an/inNiereSteinkristalle weisen darauf hin, dass die Verteilungen von Proteinen nicht identisch sind mit der traditionellen "organischen Substanzschicht", die durch optische Mikroskopie beobachtet wird (Abb. 7a). In-vitro-Beweise zur selektiven Adsorption von OPN an COD-Kristallen wurden von Chien et al. (2009 und 2018)46,47. Gemäß diesen Berichten bindet OPN an die typische kristallographische {110}-Fläche von COD und wird in die Mineralphase eingebaut, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt (Abb. 7b). Die oberflächenselektive Adsorption/Inkorporation resultiert wahrscheinlich aus der Calciumbindungsfähigkeit jedes Proteins und/oder unterschiedlichen molekularen Kompatibilitäten zwischen den funktionellen Gruppen an den Proteinmolekülen und der Anordnung von Gitterionen auf jeder Kristalloberfläche.

Berichten zufolge hemmen die meisten Proteine ​​das CaOx-Kristallwachstum während der Steinbildung48,49. Die Hemmung des Kristallwachstums durch Peptide wird als durch das Step-Pinning und/oder das Kink-Blocking angesehen41–43. In früheren In-vitro-Studien sind OPN und RPTF-1 als Inhibitoren des CaOx-Kristallwachstums bekannt48,49. Allerdings ist das Ausmaß der Hemmung inNiereSteinbildung bleibt unklar.

Die vorliegende Beobachtung zeigt, dass die meisten CSB-Kristalle aus Nierensteinen eine typische Kristallform mit {101}-Flächen aufweisen (Abb. 2b). Kristalloberflächen mit relativ langsamen Wachstumsraten sind im Allgemeinen gut entwickelt40. Diese Finanzierung zeigt, dass die Wachstumsrate von {101}-Flächen von COD im Vergleich zu anderen Oberflächen (z. B. {110}) langsam ist. Die bevorzugte Adsorption von RPTF-1, das möglicherweise das Kristallwachstum verlangsamt, indem es in COD eingebaut wird, wurde als laminierte Struktur zusammen mit {101}-Flächen gefunden (Fig. 2d). Andererseits fanden wir {110}-Flächen als laminierte OPN-Strukturen im Inneren des COD-Kristalls (Abb. 2c). Die {110}-Flächen traten auf, da die laminierte OPN-Struktur weiter entwickelt war als die {110}-Flächen von OPN-freien COD-Kristallen, die in einer In-vitro-Studie erhalten wurden46. Die {110}-Fläche von COD mit bevorzugter Adsorption von OPN ist nicht die Kristallfläche, die auf dem COD des typischen Kristallhabitus erscheint47. Tus, OPN-Absorption auf {110} würde die relative Oberflächenwachstumsrate extrem verlangsamen, und die Verlangsamung war langsam genug, um die {110}-Flächen erscheinen zu lassen. Das Auftauchen der {110}-Flächen ändert mit anderen Worten die allgemeine Kristallform in vielen Proben von Nierensteinen. COM-Kristalle erscheinen entweder als Mosaiktextur oder als konzentrische Textur (Abb. 3a und 5a). Sowohl OPN als auch RPTF-1 sind homogen in COM-Körnern in der Mosaiktextur vorhanden (Abb. 3c, d). Allerdings sind die Auswirkungen dieser Proteine ​​auf die Wachstumsrate dieser Art von COM nicht klar. In konzentrischer COM, lattenartige Kristalle, die radial von der Mitte nach außen ausgerichtet sind50. Die Kristallflächen der lattenartigen Kristalle sind nicht klar, aber die dem Urin ausgesetzte äußere Oberfläche des kugelförmigen COM sollte die gleichen kristallographischen Flächen aufweisen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen deutlich, dass OPN und RPTF-1 ähnliche Verteilungslinienprofile aufweisen, in denen sie sich periodisch im konzentrischen COM als etwa 4 bis 6 µm große Intervallschichten verteilen (Abb. 4c, d, 5b, c und Ergänzende Tabelle S1). Dies weist darauf hin, dass OPN und RPTF-1 einen vernachlässigbaren Unterschied in der Adsorption und Inkorporation auf den spezifischen Kristallflächen von COM aufweisen, die Urin ausgesetzt sind. Frühere In-vitro-Arbeiten zeigten, dass OPN hemmende Wirkungen auf das COM-Wachstum von {100}-, {121}- und {010}-Flächen hat 51. Wenn diese hemmende Wirkung berücksichtigt wird, zeigt das vorliegende Ergebnis, dass das konzentrische COM-Wachstum durch OPN gehemmt wurde und möglicherweise durch RPTF-1, da RPTF-1 eine ähnliche Calciumbindungskapazität und somit eine ähnliche Einbaueffizienz wie COM hat.

Abbildung 7. Schematische Darstellung der Proteinverteilung in drei Haupttexturen in CaOx. (a) Die Verteilung der Proteinmatrix wird in früheren Studien betrachtet (weiße Farbe: Mineralphase, schwarze Farbe: organische Substanz). (b) Spezifische Proteinverteilung, die in der vorliegenden Studie gefunden wurde (grün: Osteopontin (OPN), blau: renales Prothrombinfragment 1 (RPTF-1) und rot: Calgranulin A (Cal-A). Typ1 idiomorphe COD, Typ2 Mosaik-COM und Typ3 konzentrisch laminierte COM.

In-vivo-Hemmwirkung von Cal‑A auf das Wachstum von CaOx-Kristallen.Cal-A-Adsorption auf spezifischen Kristallflächen sowohl von COM- als auch von COD-Kristallen wurde im vorliegenden Ergebnis nicht gesehen (Fig. 2a und 3a). Cal-A hat eine geringere Calciumbindungskapazität als OPN und RPTF-1 und war an der Außenseite von euhedralen COD-Kristallen und um Mosaik-COM-Körner ohne laminierte Struktur vorhanden (Abb. 2a, e und 3a, e). Es ist jedoch auch bekannt, dass Cal-A das CaOx-Kristallwachstum in einer In-vitro-Studie hemmt28. Tus, Cal-A könnte als Tensidmolekül gewirkt haben, das die Morphologie und Kristallwachstumsrate beeinflusst, ohne in den Kristall eingebaut zu werden39,40,52. Unter normalen Urinbedingungen (dh ohne unregelmäßig hohe Cal-A-Konzentration) kann Cal-A eine geringere hemmende Wirkung auf das Kristallwachstum von COM und COD haben als OPN und RPTF-1, da OPN und RPTF{{17} } hemmen die Entwicklung von Stufen auf Kristallflächen durch Pinning und/oder Blockierung durch Einbau in Kristalle. Daher würde die Kalziumbindungskapazität von Proteinen in Nierensteinen helfen, das Ausmaß ihrer hemmenden Wirkung auf das CaOx-Wachstum zu bewerten. In konzentrischer COM zeigte Cal-A nicht periodische Schichten mit Abständen von 20 bis 50 µm (Abb , 5d und Ergänzungstabelle S1). Cal-A wurde im Urin von Steinbildnern nachgewiesen28. Daher sollten natürlich Schwankungen in seiner Konzentration im Urin auftreten. Aufgrund seiner geringeren Affinität zu Calciumionen werden kleine Schwankungen der Cal-A-Konzentration jedoch möglicherweise nicht in der COM-Textur aufgezeichnet. Cal-A wird nicht periodisch als entzündungshemmende Proteine ​​als Reaktion auf eine Entzündung im Urin ausgeschieden53,54. Allerdings können die nichtperiodischen Schichten von Cal-A aufgrund von unregelmäßigen Umweltveränderungen wie Infektionen, Verletzungen und Blutungen gelegentlich hohe Konzentrationen von Cal-A im Urin aufzeichnen. Seine hemmende Wirkung auf das COM-Wachstum würde stark von seiner Konzentration um wachsende Kristalle herum abhängen, da mehrere Peptide eine solche Abhängigkeit vom Calcit-Kristallwachstum haben42. Cal-A kann das COM-Wachstum schwach verlangsamen, indem es teilweise die wachsende Oberfläche besetzt, wenn seine Konzentration um den Kristall herum gering ist, da das Protein nicht dazu neigt, in CaOx eingebaut zu werden. Bei der konzentrischen COM weisen Lückenschichten, die von winzigen Ablagerungen umgeben sind, die durch SEM-Beobachtung gefunden wurden, fast identische Stellen auf wie die Cal-A-Schichten, die durch Multi-IF-Bildgebung gefunden wurden (Abb. 6a-d). Wenn die Cal-A-Schicht aufgrund ihrer unregelmäßig hohen Konzentration durch einige biologische Veränderungen dick wird, kann Cal-A daher als potenter Inhibitor des CaOx-Wachstums wirken, indem es die wachsende Oberfläche weit einnimmt. Eine Entzündung, die ein Auslöser der Cal-A-Sekretion ist, kann auch einen anderen Schritt der Steinbildung beeinflussen, da in Experimenten eine Art von weißen Blutkörperchen (dh Makrophagen) gefunden wurde, die fördernde und hemmende Wirkungen auf die Nierensteinbildung haben ein Nierensteinmodell Maus16.

Die mögliche Anwendung der Multi-IF-Bildgebung auf die gesamte Nierensteinbildung.Die vorliegende Arbeit erweiterte die Anwendung der Multi-IF-Bildgebung von Proteinen auf härtere Biomineralproben, dh Nierensteine. Kristallkeimbildung, Kristallwachstum, Kristallaggregation und Kristalladhäsion wurden als wichtige Schritte bei der Bildung von Nierensteinen angesehen. OPN, RPTF-1 und Cal-A werden in In-vitro-Studien als Inhibitoren der Keimbildung, des Wachstums und der Aggregation von CaOx beschrieben48,49. Die vorliegende erweiterte Anwendung der Multi-IF-Bildgebung liefert In-vivo-Beweise für die hemmende Wirkung des CaOx-Wachstums durch Proteine, die durch die früheren In-vitro-Studien impliziert wurden. Untersuchungen zu den Wirkungen von Proteinen in jedem Schritt wurden durch In-vivo-Studien an Mäusen sowie durch eine Reihe von In-vitro-Studien durchgeführt14,15,26. Beispielsweise wurde auf der Grundlage von In-vivo-Experimenten an Mäusen26 über eine kritische renoprotektive Rolle von OPN als Inhibitor der Kristallbildung und als Inhibitor der Kristalladhäsion berichtet, während OPN die Kristalladhäsion an tubuläre Epithelzellen fördert und den CaOx-Stein verstärkt Bildung wurden basierend auf neueren In-vivo-Experimenten mit OPN-Knockout-Mäusen berichtet14,15. Eine völlig andere Kristallmorphologie, die in Nierensteinen einer OPN-Knockout-Maus gefunden wird, unterstützt auch die Wirkung von OPN in mehreren Schritten der Nierensteinbildung. Das vorliegende Visualisierungsverfahren wäre bei der Bewertung von Proteineffekten in diesen In-vitro-Studien an Mäusen und sogar bei der Bewertung verschiedener Schritte der menschlichen Nierensteinbildung nützlich. Diese neuartige Analyse würde es uns ermöglichen, die In-vivo-Effekte verschiedener Proteine ​​auf die Bildung von CaOx-Steinen zu interpretieren, was einen Weg für die pathologische Untersuchung und personalisierte Medizin zur Behandlung menschlicher Nierensteinerkrankungen eröffnen kann.

Methoden

Ethik-Erklärung. Das in diesem Dokument vorgestellte Forschungsprojekt wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss der Graduiertenschule für Medizin der Universität Nagoya City genehmigt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Die schriftliche Einverständniserklärung aller Probanden wurde gemäß den vom Vorstand der Ethikkommission genehmigten Verfahren eingeholt.

Steinsammlung und Aufbereitung von Steinschnitten. Nierensteine ​​wurden von Patienten gesammelt und an der Universität der Stadt Nagoya in Japan analysiert. Fünfzehn CaOx-Nierensteinproben wurden aus unseren Tausenden von menschlichen Nierensteinsammlungen ausgewählt, basierend auf den Informationen der Infrarot-Massenspektroskopie (IR), und es wurden dünne Schnitte angefertigt. Die mineralogische Gesamtzusammensetzung des Gesteins wurde mit der IR-Analyse geschätzt. Bei dieser Nierensteinuntersuchung wurde eine petrologische Dünnschliffmethode angewendet, die ursprünglich für geologische Untersuchungen entwickelt wurde55. Nierensteinproben wurden vollständig in Epoxidharz eingebettet und geschnitten. Der Querschnitt wurde mit Schleifmitteln (SiC und Al2O3) geschliffen, und dann wurde die polierte Fläche unter Verwendung von Epoxidharz auf einen Objektträger aus Glas geklebt. Ein zweiter Schnitt wurde durchgeführt, um eine 1- mm dicke Probe parallel zum Objektträger herzustellen. Die Probe wurde dann auf eine Dicke von 20–30 µm herunterpoliert und mit der Politur durch Diamantschlamm fertiggestellt.

Polarisierte Mikroskopie und Fourier-Transformations-Infrarot-Spektrophotometrie.Die optischen Eigenschaften jedes Kristalls, aus dem die Nierensteine ​​bestehen, wurden durch polarisierte Mikroskopie mit den 20–30 µm dicken Steinfragmentschnitten beobachtet. Der Oberflächenindex jeder COD-Ebene wurde bestimmt, indem die Beobachtung mit der typischen COD-Kristallform verglichen wurde, die von VESTA56 berechnet wurde. Basierend auf den optischen Merkmalen wurden Kristalle klassifiziert und dann mit einem Fourier-Transformations-Infrarot-Spektrophotometer (FT/IR6100, JASCO) analysiert. Der gemessene Wellenzahlbereich war 7800–350 cm-1. Alle Messungen wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Die Größe des Messflecks wurde auf 20 × 20 &mgr;m2 eingestellt. Kristallphasen wurden basierend auf dem erhaltenen IR-Spektrum mit der RRUFF-Datenbank identifiziert.

Mehrfarbige Immunfluoreszenzfärbung der Proteinmatrix.Die für die Analyse von Mineralphasen verwendeten Steinschnitte wurden auch für die Analyse von Proteinverteilungen mit Multi-IF-Färbung verwendet. Die Dünnschnitte wurden mit einer Citratlösung (pH 6,0) für 1 min für eine minimale Ätzung behandelt. Der Schnitt wurde mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, dann für 6 0 min in 1-prozentigem Rinderserumalbumin in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (PBST) blockiert. Nach dem Blockieren wurde der Schnitt mit primären Antikörpern über Nacht bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die verwendeten primären Antikörper waren monoklonales Maus-Anti-Calgranulin A (1:100-Verdünnung, Santa Cruz Biotechnology, sc-48352), polyklonales Kaninchen-Anti-Osteopontin (1:100-Verdünnung, Santa Cruz Biotechnology, sc-20631 ) und monoklonales Anti-Mensch-Prothrombinfragment 1 vom Schaf (Verdünnung 1:500, Cedarlane Ontario, Kanada, CL20111AP). Der Schnitt wurde dann dreimal mit PBS für 10 min gewaschen, bevor er mit fluoreszenzkonjugierten sekundären Antikörpern für 1 h lichtgeschützt inkubiert wurde. Die verwendeten fluoreszenzkonjugierten sekundären Antikörper waren Anti-Kaninchen-IgG (H plus L), kreuzadsorbiert, konjugiert an Alexa Fluor 488, Anti-Maus-IgG (H plus L), kreuzadsorbiert, konjugiert an Alexa Fluor 546, und Anti-Schaf-IgG (H plus L) Kreuzadsorbiert konjugiert an Alexa Fluor 647. Nach ausgiebigem 3-maligem Waschen mit PBS für 10 min wurde die Fluoreszenz unter Verwendung einer konfokalen Autofluoreszenzmikroskopie (Nikon A1R) nachgewiesen. Die erfassten Anregungs- und Emissionswellenlängen umfassten 487 nm Anregung (Emission zwischen 500 und 550 nm erfasst), 561 nm Anregung (Emission zwischen 570 und 620 nm erfasst) und 639 nm (Emission zwischen 663 und 738 nm erfasst) für OPN, RPTF{{ 46}} bzw. Cal-A. Bei einem Teil der Proben wurde Autofluoreszenz (AF) beobachtet, aber die Signalintensität war weit geringer als die in dieser Studie diskutierten Proteinsignale. Die Bindung von Antikörpern, die nicht spezifisch für die Zielproteine ​​sind, wurde ebenfalls bewertet. Das Fehlen von IF-Signalen von dem unspezifischen Antikörper wurde bestätigt. Es wurden Negativkontrolltests durchgeführt, um das Fehlen falsch positiver Signale zu bewerten (ergänzende Abb. S5). Für die Antikörperfärbung wurden Isotypkontrollen verwendet, um jegliche unspezifische Bindung nachzuweisen. Insbesondere waren die als Kontrollen verwendeten Primärantikörper Kaninchen (DA1E) mAb IgG XP Isotypkontrolle (1:100 Verdünnung Cell Signaling), Maus (G3A1) mAb IgG1 Isotypkontrolle (1:100 Verdünnung Cell Signaling) und Schaf mAb IgG Isotyp (1 :100 Verdünnung Novus) unter Verwendung der gleichen fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper wie oben. Die Linienprofile wurden mit ImageJ erstellt und zeigen den höchsten und niedrigsten Kontrastpunkt als 100 Prozent bzw. 0 Prozent für jedes Protein.