Natürliche Infektion mit dem Parvovirus bei wilden Fischkatzen (Prionailurus viverrinus) enthüllt eine vorhandene virale Lokalisierung in den Nieren

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Abstrakt

Das Carnivore Protoparvovirus-1 (CPPV-1), eine Virusart, die Varianten des felinen Panleukopenievirus (FPV) und des caninen Parvovirus (CPV) enthält, ist unter Haus- und Wildfleischfressern weit verbreitet und verursacht systemische tödliche Krankheiten. Wilde Fischkatzen (Prionailurus viverrinus), eine weltweit gefährdete Art, wurden tot aufgefunden. Die postmortale Untersuchung der Kadaver ergab Läsionen in Darm, Milz undNieren. Die Identifizierung des CPPV-1-Antigens in diesen Geweben mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Immunhistochemie (IHC) unterstützte die Infektion durch das Virus. PCR- und IHC-Positivität in Nierengewebezeigte eine atypische Lokalisierung des Virus, während In-situ-Hybridisierung (ISH) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) mit der Pop-Off-Technik die erste Beschreibung der Viruslokalisierung bestätigtenNieren. Vollständige Genomcharakterisierung und abgeleitete Aminosäureanalyse des erhaltenen CPPV-1 von den Fischkatzen offenbarte FPV als verursachendes Agens. Die detektierten FPV-Sequenzen zeigten Aminosäuremutationen bei I566M und M569R im Kapsidprotein. Phylogenetische und evolutionäre Analysen vollständiger codierender Genomsequenzen zeigten, dass die CPPV-1-Genome der Fischkatze genetisch mit den FPV-Genomen gruppiert sind, die aus Hauskatzen in Thailand isoliert wurden. Seit den 1970er Jahren wurde auch gezeigt, dass diese Genome eine genetische Evolution mit chinesischen FPV-Stämmen teilen. Diese Studie ist der erste Nachweis einer CPPV-1-Infektion bei Fischkatzen und es ist die erste, die ihre Lokalisation in derNieren. Diese Ergebnisse unterstützen die Multi-Host-Reichweite dieses Parvovirus und deuten darauf hin, dass tödliche CPPV-1-Infektionen zu anderen gefährdeten wilden Fleischfressern führen können.

Schlüsselwörter: Nierengewebe; Nierenerkrankungen, Niere, Niere, Nierentubuli

Einführung

Die Gattung Prionailurus, Familie Felidae, wird als eine Gruppe von gefleckten, kleinen Wildkatzen kategorisiert, die in Asien beheimatet sind [1]. Die Gattung Prionailurus umfasst vier offiziell anerkannte Wildkatzenarten, darunter die Leopardenkatze (P. begalensis), die Flachkopfkatze (P. planiceps), die Rostfleckkatze (P. rubiginosus) und die Fischkatze (P. viverrinus). [2]. Die Fischkatze lebt hauptsächlich in der Nähe von Sümpfen und Mangroven. Es lebt ausschließlich in Süd- und Südostasien und ist häufiger in Thailand [3, 4]. Derzeit sind Fischkatzenpopulationen bedroht, da die Feuchtgebiete, in denen sie leben, im letzten Jahrzehnt zerstört wurden. Daher gilt diese Art derzeit als gefährdet und steht auf der Roten Liste der International Union for Conservation of Nature (IUNC) [3]. Aufgrund des Verlusts ihres Lebensraums sind Fischkatzenkolonien abgewandert und leben gelegentlich in Gebieten, in denen domestizierte Tiere und Menschen leben [5]. Dieses Phänomen der gemeinsamen Umgebung kann zu einem erhöhten Übergreifen von Krankheitserregern zwischen anfälligen Wild- und Haustieren und umgekehrt führen. In den letzten Jahrzehnten wurden Berichte über tödliche Ausbrüche bei Wild- oder Haustieren dokumentiert, die möglicherweise durch das Überlaufen von Krankheitserregern verursacht wurden [6–9]. Daher sollte die Übertragungsdynamik von Krankheitserregern von diesen Tieren untersucht werden und bedarf weiterer Untersuchungen.

CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/NIERENFUNKTION VERBESSERN

Fleischfresser-Protoparvovirus-1 (CPPV-1), eine Virusart, zu der das Nerz-Enteritis-Virus (MEV), das Waschbär-Parvovirus (RPV), das Katzen-Panleukopenie-Virus (FPV) und Varianten des Hunde-Parvovirus (CPV) gehören als wichtiger Erreger anerkannt, der mit tödlichen Krankheiten sowohl in wilden als auch in einheimischen Canidae- und Felidae-Familien in Verbindung gebracht wird [10, 11]. FPV, ein häufiger Erreger der Felidae-Spezies, wurde als gemeinsamer Vorfahr von CPV vermutet [12–14]. CPV infiziert häufig Tiere der Canidae-Familie und es gibt zunehmend Hinweise auf eine Infektion in der Familie der Felidae [9, 15, 16]. Zuvor wurde angenommen, dass es sich bei FPV und CPV um einen wirtsbeschränkten Virus handelt. Allerdings deuteten später mehrere Befunde darauf hin, dass einige Tiere der Familie Canidae eine Rolle als Reservoir für FPV oder umgekehrt spielen könnten [11, 17, 18]. Darüber hinaus haben mehrere Berichte darauf hingewiesen, dass die FPV- und CPV-Varianten (CPV-2a, -2b und -2c) anfällige Hosts teilen. Diese Wirte sind nicht nur Haustiere, sondern auch eine Vielzahl fleischfressender Arten [15, 19, 20], was auf eine Vielzahl von CPPV-1 hindeutet [11].

Von 1996 bis 1997 wurden CPV-Varianten erstmals bei Leopardenkatzen nachgewiesen und zunächst als Leopardenkatzen-Parvovirus (LCPV) bezeichnet, was auf die Erstbeschreibung von CPPV-1 in der Gattung Prionailurus hindeutet [21, 22]. Einige dieser LCPV-Stämme erwiesen sich aufgrund einer Mutation der G300A-Aminosäure im Kapsidprotein (VP) als genetisch von den zuvor beschriebenen CPV-2a und -2b abweichend. Dies führte zu einer Veränderung seiner antigenen Eigenschaften, die nun als eindeutiger Mutationspunkt verwendet wird, um CPV-2c von anderen CPV-Varianten zu unterscheiden [22]. Die Entdeckung der neuen CPV-Variante (derzeit bekannt als CPV-2c) bei Leopardenkatzen stützte die Idee einer Co-Evolution von CPPV-1 unter Tierarten. Später wurde über Infektionen mit FPV- und CPV-Varianten bei Leopardenkatzen berichtet [9]. Dies deutet darauf hin, dass andere Arten derselben Gattung wie die Leopardenkatze (Gattung Prionailurus) für eine CPPV-1-Infektion anfällig sein könnten. Bisher ist die Anfälligkeit für eine CPPV-1-Infektion bei anderen Arten der Gattung Prionailurus noch weitgehend unbekannt. Die Entschlüsselung, wie sich CPPV-1-Varianten entwickeln und wie sich neu auftretende Varianten verhalten, kann dabei helfen, aufzuklären, wie ein möglicher Ausbruch der neuen Variante verhindert werden kann. Selbst wenn das neue Virus ein breiteres Wirtsspektrum erreicht, können bei einem neuen, anfälligen Wirt tödliche Ausbrüche oder atypische Läsionen im Zusammenhang mit der Infektion beobachtet werden. Diese Studie beschreibt eine tödliche CPPV-1-Infektion bei wilden Fischkatzen (Prionailurus viverrinus). Die genetische Charakterisierung des erhaltenen CPPV-1 zeigt FPV als Erreger. Dieser Befund liefert den ersten Beweis für eine FPV-Infektion bei dieser Art und enthüllt den einzigartigen zellulären Tropismus dieses Virus. Eine weitere Aufklärung der FPV-Infektion und ihrer Varianten bei dieser Art ist notwendig, um der globalen Infektion bei zahlreichen gefährdeten Arten Rechnung zu tragen.

Materialen und Methoden

Tiere und routinemäßige ObduktionIm Juni 2019 wurden zwei wilde Fischkatzen (P. viverrinus), die mit den Fall-Nr. 1 & 2 wurden in einem Vorort der Provinz Nakhon Ratchasima, Thailand, tot aufgefunden. Später im August 2019 wurde eine weitere Fischkatze mit der Bezeichnung Fall-Nr. 3, wurde aus dem Bereich gerettet, in dem die ersten beiden Fischkatzen gefunden wurden. Aufgrund der Schwere der Dehydrierung, Fall-Nr. 3 starben während der Überweisung in die Tierklinik. Diese drei Fischkatzen wurden routinemäßig einer postmortalen Untersuchung unterzogen. Leider waren Proben von freilaufenden domestizierten Tieren oder Wildarten, die im selben Gebiet beherbergt wurden, nicht verfügbar; daher wurden sie nicht in diese Studie aufgenommen. Bei allen Fischkatzen wurde eine routinemäßige postmortale Untersuchung durchgeführt. Selektive lebenswichtige Organe einschließlich Lunge, Leber, Herz, Milz undNierewurden von allen Fischkatzen entnommen, während Darm und Mesenteriallymphknoten zusätzlich von Fischkatze Nr. 3 entnommen wurden. Alle ausgewählten Gewebe wurden zur histologischen Untersuchung eingereicht und einzeln für weitere molekulare Untersuchungen entnommen. Für die Histologie wurden die Gewebe für mindestens 24 Stunden in 10 % (v/v) neutral gepuffertes Formalin getaucht und routinemäßig verarbeitet. Dann wurden sie mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt

(H&E) unter Verwendung von Standardverfahren vor der Untersuchung durch einen vom ACVP-Vorstand zertifizierten Veterinärpathologen (TK). Frische Gewebeproben der drei Fischkatzen wurden für molekulare Untersuchungen bei –80 °C gelagert. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften nach Genehmigung durch das Animal Care and Use Committee der Chulalongkorn University (Nr. 1931036) durchgeführt.

Allgemeine virologische molekulare AssaysDie frischen Gewebeproben einschließlich Herz, Lunge, Leber, Milz undNierealler Fischkatzen plus zusätzliches intestinales und mesenteriales Lymphknotengewebe der Fischkatze Nr. 3, wurden einer viralen Nukleinsäureextraktion unterzogen, indem sie einzeln mit 1 Prozent (v/v) phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) homogenisiert wurden. Anschließend wurde die gesamte virale Nukleinsäure unter Verwendung eines kommerziellen viralen Nukleinsäure-Extraktions-II-Kits (Geneaid, Taipeh, Taiwan) gemäß den Empfehlungen des Herstellers extrahiert. Die extrahierten Nukleinsäuren wurden dann durch ihr E260/E280-Absorptionsverhältnis unter Verwendung des Spektrophotometrieverfahrens (NanoDrop, Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA) qualifiziert und quantifiziert. Alle extrahierten Nukleinsäuren wurden einer weiteren viralen molekularen Untersuchung unter Verwendung von Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (PCR) mit mehreren panvirologischen Familien-PCR-Testpanels unterzogen, einschließlich des Nachweises des Herpesvirus [23], Paramyxovirus [24], Pneumovirus [25], Calicivirus [26], Influenzavirus [27], Bocavirus [26, 28], Parvovirus [29] und Corona-Virus [30, 31]. Die in den Reaktionen verwendeten PCR-Protokolle, Reagenzien, Zyklusbedingungen und Positiv-/Negativkontrollen sind in der S1-Datei beschrieben. Der PCR-Nachweis, der für das Glyceraldehyd- 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH)-Gen der Katze spezifisch ist, wurde als interne Kontrolle verwendet, wie zuvor beschrieben [32]. Anschließend wurden die positiven PCR-Amplikons unter Verwendung einer QIAxcel-Kapillarelektrophoreseplattform (Qiagen, Hilden, Deutschland) wie zuvor beschrieben sichtbar gemacht [33]. Die positiven Amplikons jedes PCR-Assays wurden gereinigt und einer bidirektionalen Sanger-Sequenzierung (Macrogen Inc, Seoul, Südkorea) unterzogen. Aufgrund einer mäßigen Autolyse der Gewebe war eine bakteriologische Untersuchung dieser Fischkatzen nicht möglich.

In-situ-CPPV-1-Nachweis mittels Immunhistochemie (IHC), In-situ-Hybridisierung (ISH) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Das anfängliche virologische molekulare Screening ergab positive Amplikons der Pan-Parvovirus-PCR und die Sequenzierungsergebnisse zeigten auch potenzielle DNA-Sequenzen von CPPV-1. Diese Ergebnisse veranlassten uns, das Vorhandensein von CPPV-1 weiter zu bestätigen und die Verteilung von CPPV-1 im Gewebe von Fischkatzen zu lokalisieren. Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettetes (FFPE) Gewebe einschließlich Lunge, Leber, Herz, Milz,Niereund Darm wurden einem CPPV-1 IHC-Nachweis unter Verwendung eines monoklonalen Maus-Anti-Hunde-Parvovirus-Antikörpers (ab59832, Abcam, Cambridge, UK) mit dem Nachweissystem für Meerrettichperoxidase (HRP) (EnVision Polymer, Dako, Glostrup, Dänemark) unterzogen. . Kurz gesagt, die FFPE-Schnitte wurden auf eine Dicke von 4- μm geschnitten und weiter entparaffiniert und rehydriert. Die Objektträger wurden dann vorbehandelt, endogene Peroxidase blockiert und wie zuvor beschrieben verarbeitet [11]. Schnitte des Darmgewebes einer FPV-infizierten Katze und eines CPV-infizierten Hundes wurden als Positivkontrollen verwendet, während identische Schnitte mit gereinigten Ziegen-Maus- und Kaninchen-IgGs (IHC Universal Negativkontrollreagenz, Code ADI-950-231-0025, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) wurden als Negativkontrollen verwendet. Bezüglich derNieren-tubuläre Nekrose in den Bereichen, in denen positive CPPV-1-IHC-Signale beobachtet wurden, dieNiereSchnitte aller Fischkatzen wurden einer speziellen Periodic AcidSchiff (PAS)-Färbung unterzogen, um die Zellarchitektur von zu demonstrierenNiereGewebe.

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENERKRANKUNGEN VERBESSERN

Darüber hinaus ist die FFPENiereAbschnitte von Angelkatzennr. 1 & 3 wurden einer ISH- und TEM-Analyse unterzogen, um das Ergebnis einer positiven CPPV-1-IHC-Färbung zu stützen und die Viruspartikel darin ultrastrukturell nachzuweisenNierengewebe, beziehungsweise. Für die ISH wurde die CPPV-1-DNA-Sonde, die 393 bp [34] des Kapsidgens von CPPV-1 abdeckt, unter Verwendung eines PCR-DIG-Sondensynthesekits (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) gemäß konstruiert die Vorschläge des Herstellers. Die Thermocycling-Reaktion und -Bedingung wurden wie zuvor beschrieben [34] durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die mit Digoxigenin (DIG) markierten Oligonukleotide verwendet wurden. Die konstruierte Hybridisierungssonde wurde sichtbar gemacht und durch Größenauflösung auf 1,5 % (w/v) Agarosegelelektrophorese bestätigt. Die ISH mit chromogener DNA wurde wie zuvor beschrieben [26] mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, nach Entparaffinierung, Rehydrierung und anschließendem Spülen in PBS wurden die 4- μm dicken FFPE-Objektträger einem proteolytischen Verdau, einer Nachfixierung und einer Vorhybridisierung unterzogen. Die Objektträger wurden dann mit der 25 ng/μl ISH-Sonde bei 42 °C über Nacht hybridisiert. Die Hybridisierungssignale wurden durch Kopplung mit 100 μL Anti-DIG-AP-Fab-Fragmenten (Roche, Basel, Schweiz) (1:200 in 1X Blocking-Lösung) in Kombination mit Liquid Permanent Red (LPR) (Dako, Glostrup, Dänemark) sichtbar gemacht. . Die Objektträger wurden dann mit Hämatoxylin gegengefärbt. Rote Präzipitate in der Korrelation der Zellmorphologie wurden als positiv für ISH angesehen. Für Negativkontrollen wurden anstelle der CPPV-1-Sonde die Tilapia-Lake-Virus (TiLV)-Sonden [35] verwendet. Die TEM-Proben wurden gemäß Pop-Off-Techniken mit Modifikationen [36–38] präpariert und wie zuvor beschrieben mit Schwermetallen gefärbt [39, 40]. Die Ultrastruktur wurde unter Verwendung von TEM (HT7800; Hitachi, Tokio, Japan) untersucht, das bei 80 kV betrieben wurde

Vollständige genetische Charakterisierung von Fischkatzen-CPPV-1Da die Ergebnisse der virologischen PCR und des IHC-Screenings übereinstimmten und die Ergebnisse partieller VP-2-Genomsequenzen, die aus der pan-parvoviralen PCR erhalten wurden, auf eine genetische Ähnlichkeit zwischen den Fällen Nr. 1 & 2, aber nicht für Fall Nr. 3, haben wir die CPPV-1-Sequenz in voller Länge von diesen Fischkatzen weiter charakterisiert (Fall Nr. 1 & 3) und den CPPV-1-Ursprung unter Verwendung von a klassifiziert Satz von degenerierten Primerpaaren, die für FPV und CPV spezifisch sind und aus einer früheren Veröffentlichung stammen [26]. Kurz gesagt, die aus Milz und erhaltenen extrahierten NukleinsäurenNierenvon zwei Fischkatzen plus zusätzliches Darmgewebe von Fischkatze Nr. 3, wurden einzeln unter Verwendung eines GoTaq1 Hot Start Green Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) und spezifischer Primer (S1-Datei) amplifiziert. Die PCR-Bedingungen wurden zuvor beschrieben [26]. Die Ziel-Amplikons wurden unter Verwendung von 2-prozentiger (w/v) Agarose-Gelelektrophorese sichtbar gemacht und vor der kommerziellen Sanger-Sequenzierung unter Verwendung eines Monarch-DNA-Gel-Extraktionskits (New England Biolab, Frankfurt, Deutschland) weiter gereinigt. Die vollständigen Genomsequenzen der CPPV-1-Isolate, die von den beiden Fischkatzen erhalten wurden, wurden in der GenBank hinterlegt (Zugangsnummern MW145540-MW145541).

Phylogenetische, Rekombinations- und Evolutionsanalysen von Fischkatzen-CPPV-1 Die vollständigen Genomsequenzen der Fischkatzen-CPPV-1-Stämme wurden mit den veröffentlichten vollständigen CPPV-1-Sequenzen abgeglichen, die von verschiedenen Wirtsarten erhalten wurden , verfügbar in GenBank mit MAFFT V. 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) und MEGA7-Software (http://www.megasoftware.net). Die Sequenzalignments wurden dann einer phylogenetischen Baumkonstruktion unterzogen. Der phylogenetische Baum wurde unter Verwendung der Maximum-Likelihood (ML)-Methode mit dem Hasegawa-Kishino-Yano-mit-Gammaverteilungsmodell (HKY plus G) erstellt, das mit dem Find-Best-Fit-Modellalgorithmus in MEGA7 gemäß dem Bayes'schen Informationskriterium ausgewählt wurde . Der Baum wurde mit 1,000 Replikationen gebootstrapped. Die sequenzpaarweise Ähnlichkeit zwischen CPPV-1-Genomen wurde unter Verwendung des Maximum-Composite-Likelihood-Modells berechnet und ihre evolutionäre Distanz wurde in MEGA7 analysiert. Die paarweise ausgegebenen Nukleotididentitäten wurden generiert und im Microsoft Excel-Format (S2-Datei) visualisiert. Die Ausgabe-Alignment-Sequenz von CPPV-1 wurde dann als Vorlage für die genetische Rekombinationsanalyse unter Verwendung von zwei statistisch unabhängigen Softwarepaketen verwendet. Kurz gesagt, das Alignment identifizierte die potenziellen Rekombinationsstämme unter Verwendung der integrierten Rekombinationserkennungsprogramm 4 (RDP4)-Paket V. Beta 4.94-Software und dies wurde mit einem Ähnlichkeitsdiagramm und einer Bootsscanning-Analyse im SimPlot-Softwarepaket V. 3.5.1 gegengeprüft. Die Einstellungen der Programme und Interpretation der Ergebnisse erfolgten wie zuvor beschrieben [26, 41].

Für die evolutionäre Analyse der Fischkatze CPPV{{0}} wurde ein Datensatz von 224 vollständigen Genomsequenzen mit 26 FPV-, 6 MEV- und 192 CPV-Sequenzen abgerufen, die alle zwischen 1979 und 2019 aus 18 Ländern stammten aus der GenBank-Datenbank. Eine evolutionäre Analyse wurde mit den 2 potentiellen CPPV-1-Sequenzen durchgeführt, die von Fischkatzen unter Verwendung des in BEAST V. 2.4.8 [42] implementierten Monte-Carlo-Modells der Bayes'schen Markov-Kette (BCMMC) erhalten wurden. Der jModelTest [43] wurde durchgeführt, um das am besten passende Nukleotid-Substitutionsmodell für multiple Alignment-Sequenzen zu identifizieren. Die am besten passenden Substitutionsmodelle unter lognormal entspannten und strengen Uhrenmodellen bei konstanten Populationsgrößen als Priors wurden implementiert, um unterschiedliche Evolutionsraten zwischen Abstammungslinien zu berücksichtigen. Die Prior- und empirischen Basisfrequenzen des koaleszierenden Bayes'schen Skyline-Baums wurden unter dem am besten angepassten Uhrenmodell ermittelt und für 100 Millionen Ketten ausgeführt, wobei jede 10 000 Generation abgetastet wurde, wobei die ersten 10 % als Burn-In verworfen wurden. Die Konvergenz der Parameter wurde durch Berechnung der effektiven Stichprobengröße mit dem TRACER-Programm V. 1.7.0 [44] bestätigt. Die Bäume der maximalen Clade-Glaubwürdigkeit wurden mit TreeAnnotator V. 1.8.3 [42] kommentiert. Der phylogenetische Baum mit geschätzter Divergenz, variabler Zeitlinie, Posterior-Wahrscheinlichkeit und 95 Prozent höchster Posterior-Dichte (HPD) wurde mit FigTree V. 1.4.3 [45] generiert und angezeigt.

Retrospektive Studie des CPPV-1-Antigens bei Fleischfressern in WildtierenUm die Rolle von CPPV-1 im Zusammenhang mit Morbidität und Mortalität mit unbekannten Ursachen bei wilden Fleischfressern in der fernen und jüngsten Vergangenheit zu untersuchen, wurden 305 selektive frische Proben für die genomische Extraktion und Identifizierung des CPPV{{2} eingeschlossen. } Capsid-Gen wie oben beschrieben. Diese Proben werden seit 2013 entweder als Kotabstriche oder als Darminhalt gewonnen. Sie wurden von 136 Zootieren aus 27 verschiedenen fleischfressenden Arten erhalten (S1-Tabelle). Ergebnisse Postmortem-Befunde und Gewebelokalisierung von Fischkatzen CPPV-1 Alle sezierten Fischkatzen waren mäßig abgemagert mit unterschiedlichem Grad an Dehydration, während 2 der 3 Fischkatzen (Fall Nr. 1 & 2) eine mäßige Autolyse zeigten. Vor allem die Milz undNierenwaren bei allen Fischkatzen überlastet. Fischkatze Nr. 3 hatte makroskopische Läsionen einer katarrhalischen Enteritis, die einen wässrigen braun-gelblichen Inhalt in ihren Lumen und eine Stauung des mesenterischen Lymphknotens enthielten. Histologisch ist die Lunge der Fischkatze Nr. 3 zeigte eine schwere Kongestion mit Infiltration von mononukleären Zellen in Alveolen. Die Leber zeigte eine leichte periportale Hepatitis, die durch mononukleäre Zellinfiltration an Leberportaltriaden gekennzeichnet war. Bei allen Angelkatzen wurde ein ähnlicher Grad an Milzstauung mit einer geringen Anzahl von Milzlymphoidfollikeln beobachtet. Die Lymphfollikel waren erschöpft und die verbleibenden Lymphfollikel inmitten einer kollabierten Milzarchitektur mit einer erhöhten Anzahl prominenter Milzbälkchen (Abb. 1A). Es waren verstreute karyorrhektische Trümmer von Lymphozyten mit

Abb. 1. CPPV-1-Infektion bei Fischkatzen. Demonstrative H&E (A, C) und CPPV-1 IHC (B, D) Bilder von fischenden Katzen. (A) Fischkatzen-Nr. 1. Diffus verstopfte Milz mit spärlicher Anzahl von Lymphfollikeln. Die Mitte eines der verbleibenden lymphatischen Follikel enthielt eosinophiles fibrilläres Material (Fibrin), vermischt mit verstreuten karyorrhetischen Lymphozytentrümmern (Lymphozytenlyse) (Einschub). Wenige dieser Lymphozyten enthielten 5–7 μm große basophile intranukleäre Einschlusskörperchen, die das nukleäre Chromatin (Pfeil) begrenzten. (B) Fischkatzen-Nr. 3. Verkürzung der Zotten mit gelegentlich erweiterten Krypten, die eosinophile proteinartige Substanzen enthielten und von deutlich attenuierten oder nekrotischen Kryptenepithelzellen ausgekleidet waren (Einschub). Viele Kryptenepithelzellen waren pyknotisch und karyorrhektisch und seltene Zellen enthielten ähnliche basophile intranukleäre Einschlusskörperchen (Pfeile). (C) Fischkatzen-Nr. 1. Die CPPV-1-Immunreaktivität wurde häufig im Zytoplasma mononukleärer Zellen im Bereich der Lymphfollikel der Milz beobachtet. (D) Fischkatzen-Nr. 3. CPPV-1-IHC-Signale wurden diffus detektiert und die Immunreaktivitätssignale waren deutlich im Zytoplasma kryptaler Epithelzellen lokalisiert (Einschub). Die Balken zeigen 25 μm für (A) und 120 μm für (B–D).

Ansammlungen von eosinophilen fibrillären Materialien im Zentrum eines solchen Follikels. Wenige dieser Lymphozyten enthalten 5–7 μm große basophile intranukleäre Einschlusskörperchen, die das nukleäre Chromatin begrenzen. Eine Verkürzung der Darmzotten mit Zusammenbruch der Schleimhautarchitektur war im Darmabschnitt der Fischkatze Nr. 3 (Abb. 1B). Einige Krypten waren erweitert, und sie enthielten eosinophiles proteinhaltiges Material und waren von deutlich abgeschwächten oder nekrotischen Kryptenepithelzellen ausgekleidet. Viele kryptale Epithelzellen waren pyknotisch und karyorrhektisch und seltene Zellen enthielten ähnliche basophile intranukleäre Einschlusskörperchen. CPPV-1 IHC wurde verwendet, um das Vorhandensein des Virus in Geweben nachzuweisen und die pathologische Rolle von CPPV-1 in den Läsionen zu beschreiben, die bei Routineuntersuchungen nach dem Tod beobachtet wurden. Die vorhandenen mononukleären Zellen in der Milz zeigten eine positive intensive Immunreaktivität von CPPV-1 bei allen Fischkatzen (Fig. 1C). Die Immunreaktivität wurde auch im größten Teil des Zytoplasmas kryptaler Epithelzellen beobachtet und war kompatibel mit den intestinalen Läsionen der Fischkatze Nr. 3 (Abb. 1D). Insbesondere verschiedene Grade vonrenal tubulärVakuolisierung und multifokalNieren-Blutungen waren bei allen Fischkatzen offensichtlich (Abb. 2A). EtwasNieren-tubuläre Epithelzellen waren hypereosinophil mit nukleärer Pyknose, während die seltenen vakuolisierten tubulären Epithelzellen vesikulierte Kerne mit angrenzendem Kernchromatin zeigten (Abb. 2B). Bezüglich derNiereLäsionen führten wir außerdem eine PAS-Färbung durch, um die zelluläre Architektur von zu demonstrierenNierengewebeund systemische Hypoxie als mögliche Ursache dieser Läsion auszuschließen. PAS-Färbung zeigte dierenal tubulärBasalmembranen waren intakt (Abb. 2B, Einschub). Innerhalb derNiereAbschnitten war die CPPV-1-Immunmarkierung stark und häufig im Zytoplasma von zu sehenrenal tubulärEpithelzellen (Abb. 2C) und Urothelzellen an derNierenbeckenauf alle Fälle. Bei den Negativkontrollen wurde kein Hinweis auf eine immunogene Reaktion beobachtet (S1 Abb.). Die atypische CPPV-1-Lokalisierung inNierengewebevom IHC aufgedeckt wurde, schlug vor, dass wir zusätzliche Untersuchungen durchführen sollten, um das Vorhandensein und die Lokalisierung des CPPV-1 in zu bestätigenNieremittels ISH und TEM mit Pop-Off-Technik. Die CPPV-1-ISH-Immunreaktivität war bei allen Fischkatzen positiv und diffus im Zellkern lokalisiertNieren-tubuläre Epithelzellen, wo die tubulären Läsionen beobachtet wurden (Abb. 2D). In den Negativkontrollen wurde keine Reaktion beobachtet (S1 Abb.) In Übereinstimmung mit den Ergebnissen von positiven immunologischen Signalen von ISH, die im Zellkern lokalisiert warenNieren-Epithelzellen wurden zahlreiche kleine, elektronendichte Viruspartikel mit einem geschätzten Durchmesser von etwa 19–22 nm beobachtet. Diese wurden in den Kernen von diesen geclustertrenal tubulärund Urothelzellen (Abb. 3).

Nachweis von Fischkatzen-CPPV-1 und GenomanalyseIn erster Linie wurden die für verschiedene Viren, einschließlich Herpesvirus, Paramyxovirus, Pneumovirus, Calicivirus, Influenzavirus, Bocavirus, Coronavirus und Parvovirus, spezifischen familienübergreifenden PCR-Panels an den extrahierten viralen Nukleinsäureproben getestet. Diese ergaben positive Ergebnisse nur mit der Pan-Parvovirus-PCR in Darm, Lymphknoten uNiereProben der drei Fischkatzen. Umgekehrt waren andere pan-PCRs für die anderen Virusnachweise in allen getesteten Gewebeproben negativ. Aus zuvor erhaltenen Ergebnissen der Pan-Parvovirus-PCR-Positivität bei allen Fischkatzen haben wir die codierenden Genomsequenzen in zwei Fischkatzen unter Verwendung mehrerer Primerpaare weiter charakterisiert extrahierte Nukleinsäureproben aus dem Darm (Fall Nr. 1) undNiere(Fall Nr. 3). Die 4.462 und 4.430 Basenpaare des vollständigen codierenden Genoms von zwei Fischkatzen-CPPV-1-Stämmen wurden nachgewiesen und als Stamm 19ZP004-TH/2019 (Fall Nr. 1, Zugangsnummer MW145540) und 19ZP{ bezeichnet. {12}}TH/2019 (Fall Nr. 3, Zugangsnummer MW145541). Nach der genetischen Analyse zeigten die vollständigen codierenden Genome genetisch ähnliche Ergebnisse zwischen CPPV-1-Stämmen, die von Fischkatzen erhalten wurden, indem sie zeigten, dass diese Fischkatzen-CPPV-1 FPV waren. Abgeleitete Aminosäurevergleiche zwischen den CPPV-1-Varianten und dem Fischkatzen-FPV sind in Tabelle 1 beschrieben. Zu beachten ist, dass das Fischkatzen-FPV einzigartige Aminosäuremutationen von I566M und M569R im Strukturprotein (VP1 & 2) offenbarte , die in früheren CPPV-1-Varianten nicht erkannt wurden.

Abb. 2. CPPV-1-Infektion bei Fischkatzen. Demonstrative H&E (A), PAS-Färbung (B), CPPV-1 IHC (C) und In-situ-Hybridisierung (ISH) (D) Mikrofotografien vonNierevon Fischkatzen. (A, B) Fischkatze Nr. 3. (A) MultifokalNieren-Blutung mitrenal tubulärVakuolisierung. Wenige tubuläre Epithelzellen waren hypereosinophil mit pyknotischen Kernen (Einschub, Pfeile). (B)NierentubulusEpithelzellen zeigten eine zytoplasmatische Vakuole und die Kerne seltener Epithelzellen sind blasig mit angrenzendem Kernchromatin. Die PAS-Färbung hob die intakte Basalmembran hervor (Einschub). (C) Fischkatzen-Nr. 2. CPPV-1 IHC-Immunreaktivität (dunkelbraune Farbe) wurde diffus im beobachtetNierentubuliund häufig im Zytoplasma von nachgewiesenrenal tubulärEpithel (Einschub). (D) Fischkatze Nr. 1. CPPV-1-ISH-Immunreaktivität (rötlich-rosa Farbe) wurde reichlich beobachtet inNierentubuli(Sternchen), und es lokalisiert in den Kernen vonrenal tubulärEpithelien (Einschub, Pfeile). Balken zeigen 50 μm für (A, C) und 120 μm für (B, D).

Phylogenetische und evolutionäre AnalyseZum Vergleich der genetischen Verwandtschaft zwischen dem nachgewiesenen Fischkatzen-CPPV-1 und anderen zuvor veröffentlichten CPPV-1-Genomen wurde eine phylogenetische Analyse basierend auf der vollständigen codierenden Genomsequenz durchgeführt. Der ML-Stammbaum zeigte, dass die meisten FPV, MEV und CPV eine sehr unterschiedliche Klade zwischen den Gruppen bildeten (Abb. 4). Die beiden CPPV-1-Genome der untersuchten Fischkatzen (angezeigt durch rote Dreiecke) wurden zusammen mit der gleichen Abstammungslinie von zuvor veröffentlichten FPV-Sequenzen geclustert, die von verschiedenen Wirten erhalten wurden, was bestätigt, dass die erhalten wurden

Abb. 3. CPPV-1-Viruspartikel im Kern vonrenal tubulärEpithelzellen. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) mit der Pop-off-Technik. Ultrastrukturelle Demonstration der Clusterbildung von elektronendichten Teilchen (Pfeile). Die ikosaedrische Partikelgröße betrug 19–22 nm Durchmesser und befand sich im Kern vonrenal tubulärEpithelzellen (Einschub). Maßstabsleisten wie in der Abbildung gezeigt.

Angelkatzen-CPPV-1s waren FPV. Die nachgewiesenen Genome wurden geclustert und waren am engsten mit dem FPV-Genom verwandt, das in Hauskatzen in Thailand nachgewiesen wurde (Zugangsnummer MN127780). Um den Evolutionsprozess des nachgewiesenen Fischkatzen-CPPV-1 weiter aufzuklären, wurden mehrere Rekombinationsnachweise und Evolutionsanalysen an einem Datensatz von 224 vollständigen CPPV-1-Genomsequenzen durchgeführt. Die Rekombinationsanalyse ergab, dass keine Rekombinationsereignisse in CPPV-1-Sequenzen von Fischkatzen gefunden wurden. Der Evolutionsbaum dieser Daten zeigte zwei deutlich voneinander getrennte Hauptklassen (Abb. 5). Eine Clade umfasste FPV und MEV und eine andere Clade umfasste alle CPV-Sequenzen. Die gesamte Evolutionsrate wurde auf 1,08 × 10–4 Substitutionen/Stelle/Jahr geschätzt (95 Prozent HPD: 1,95–2,87 × 10–4). Der Evolutionsbaum zeigte, dass FPV-Sequenzen von Fischkatzen in der gleichen FPV-Linie angehäuft waren wie die aus Thailand isolierten. Sie haben die genetische Evolution mit FPV-Genomen geteilt, die bei Hauskatzen in China entdeckt wurden, und haben möglicherweise seit etwa 1970 denselben Ursprung.

Diskussion

Zirkulation von CPPV-1-Varianten, die CPV und FPV umfassen, wurden sowohl bei einheimischen als auch bei wilden Fleischfressern identifiziert. Während eine tödliche Infektion mit CPPV-1 bei Haushunden und -katzen häufig vorkommt, wird diese Infektion sporadisch bei wilden Fleischfressern beobachtet [46]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass viele wilde Fleischfresser anfällig für eine CPPV-1-Infektion sind, darunter wilde Katzenartige, Nerze, Otter, Stinktiere, Waschbären, Füchse, Wölfe, Kojoten, Zibetkatzen und Marder [11, 19]. Insbesondere für die Gattung Prionailurus wurde nur von Leopardenkatzen berichtet, dass sie mit CPPV-1-Varianten infiziert sind [9]. In dieser Studie beschreiben wir die natürliche Infektion mit FPV, einem Mitglied von CPPV-1, bei wilden Fischkatzen (Prionailurus viverrinus). Dies ist der erste Bericht mit einer Beschreibung der ausgeprägten Virusverteilung und des Tropismus inNierengewebewie durch Antigennachweis unter Verwendung von PCR, IHC, ISH und TEM-Analyse der Ultrastruktur bestätigt.

Eine artübergreifende Übertragung von CPPV-1-Varianten zwischen einheimischen und wilden Fleischfressern wurde beobachtet, und es wurde spekuliert, dass einige tödliche CPPV-1-Ausbrüche mit einem Übergreifen von Krankheitserregern zwischen Lebensräumen in Verbindung stehen [9, 11]. Aufgrund des derzeitigen Verlusts von Lebensräumen für Wildtiere sind Wildkolonien abgewandert und haben sich Lebensräume mit Haustieren geteilt, was zu einem erhöhten Übergreifen von Krankheitserregern zwischen empfänglichen Tieren geführt hat. In dieser Studie fanden wir heraus, dass die CPPV-1-Genome der Fischkatze ein evolutionäres Muster mit den darin nachgewiesenen FPV-Stämmen teilen

Abb. 4. Phylogenetische Topologie, die die genetische Verwandtschaft der kodierenden Sequenzen in voller Länge zwischen der Fischkatze CPPV-1 und anderen CPPV-1-Varianten offenbart. Der Stammbaum zeigte, dass die CPPV-1-Sequenzen der Fischkatze (angezeigt durch rote Dreiecke) zusammen mit den FPV-Genomen gruppiert waren, wobei das Genom am stärksten mit dem in der Thai-Katze nachgewiesenen FPV-Genom verwandt war (MN127780). Die GenBank-Zugangsnummern von zuvor beschriebenen CPPV-1-Sequenzen, die in dieser Analyse verwendet wurden, wurden angegeben.

Hauskatzen in Thailand. Diese Ergebnisse zeigen ein ähnliches Evolutionsmuster wie die FPV-Stämme von gemeinsamen Vorfahren, die seit den 1970er Jahren in China aus Hauskatzen isoliert wurden. Dieses Ergebnis kann entweder einen möglichen Beweis für eine artübergreifende Übertragung zwischen Hauskatzen und Fischkatzen oder eine Co-Evolution der CPPV-1-Varianten implizieren. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Proben, die von freilaufenden Tieren in denselben Lebensräumen stammen, und der geringen Anzahl untersuchter Fischkatzen konnte das Hauptreservoir des CPPV-1 in dieser Studie jedoch nicht identifiziert werden, und es sind weitere Untersuchungen erforderlich . Obwohl mehrere Studien darauf hindeuten, dass verschiedene Aminosäurereste im Capsid-Gen sowohl mit der Fähigkeit, neue Wirte zu infizieren, als auch mit der Antigenität von CPPV-1 [18, 47], der einzelnen Aminosäure-Mutation an Position 300 des Kapsidprotein (VP2) wurde als Schlüsseldeterminante für mehrere Wirtsbereiche beschrieben [48]. In dieser Studie zeigte die CPPV-1-Variante, die von den Fischkatzen erhalten wurde, die gleichen Aminosäuremuster wie in FPV-Sequenzen gefunden, mit der Anwesenheit von Alanin (A) als Schlüssel-Aminosäure-Determinante an Kapsidposition 300. While das Fischkatzen-Kapsidprotein von CPPV-1 zeigte Asparagin (N)- und Alanin (A)-Aminosäuren, die sich an den Positionen 564 bzw. 568 befinden (die als kritisch für die FPV-Replikation im katzenartigen Wirt angesehen werden). 2 einzigartige Aminosäuremutationen an den Positionen I566M und M569R. Diese Mutationen können dieses Virus von zuvor beschriebenen CPPV-1-Varianten unterscheiden. Frühere Analysen der Ahnenrekonstruktion ergaben, dass FPV verschiedene Fleischfresser mit wenigen Änderungen im VP2-Gen infizieren kann [49]. Daher wurde das FPV-ähnliche Parvovirus vorläufig als potenziell neues Virus benannt, das bei Fischkatzen nachgewiesen wurde, und dies könnte die erste Identifizierung dieses Virus in dieser Art unterstützen. Eine kleine Anzahl untersuchter Fischkatzen im Vergleich zu einer kleinen Anzahl anderer Sequenzen gibt jedoch möglicherweise keine endgültige Interpretation. Dies erfordert weitere Untersuchungen, um genauere Schlussfolgerungen ziehen zu können.

CPPV-1-Lokalisationen bei Fischkatzen wurden in verschiedenen Geweben beobachtet, einschließlich intestinaler Epithelzellen und lymphatischer Zellen, wobei die häufigste Gewebelokalisation der CPPV-1-Infektion bei anderen Arten zu finden ist [20, 26, 50, 51 ]. Interessanterweise ergaben erste Untersuchungen des viralen Genomnachweises mit PCR und der viralen Lokalisierung mit IHC eine unterschiedliche virale Lokalisierung inNierengewebeführten wir eine PAS-Färbung durch, um die zelluläre Architektur von zu demonstrierenNierengewebeund eine systemische Hypoxie als mögliche Ursache einer tubulären Nekrose auszuschließen. Die PAS-Färbung zeigte, dass die meisten tubulären Basalmembranen intakt waren, was darauf hindeutet, dass diese Läsion möglicherweise nicht von einer systemischen Hypoxie herrührt [52]. Jedoch können auch andere Ursachen wie Toxin-induzierte tubuläre Nekrose diese Läsion verursachen. Somit ist die Rolle der FPV-ähnlichen Parvovirus-Infektion damit verbundenNiereLäsionen müssen noch weiter untersucht werden. Darüber hinaus haben wir versucht, die vorhandene Lokalisierung des Virus in weiter aufzuklärenNierengewebeunter Verwendung von ISH und TEM mit der Pop-Off-Technik [37] in den Bereichen, in denen CPPV-1-IHC-Immunreaktivität nachgewiesen wurde. Die elektronendichten Teilchen wurden im Kern von beobachtetrenal tubulärEpithelzellen und Urothelzellen, was die positive In-situ-Immunreaktivität von CPPV-1 unterstütztNierengewebe. FPV-infizierte Katzen scheiden das Virus hauptsächlich mit dem Kot aus, aber das Vorhandensein von aktivem Virus im Urin wurde beschrieben [53, 54]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Parvovirus-Infektionen eine Rolle spielenNierenversagen[55]. Allerdings ist die Lokalisierung von FPV und dem CPV-Gegenstück in derNierengewebewurde bisher nicht untersucht. Außerdem eine MausNiereParvovirus (MKPV) hat sich als nephrotropes Virus erwiesen, da es eine Affinität zur Infektion und Lokalisierung zeigtrenal tubulärEpithelzellen, wodurchNierenerkrankungen [56, 57].

Basierend auf unserem Wissen ist die CPPV-1-Lokalisierung in derNierenwurde bisher nicht beschrieben. Dies legt die neuartige Beschreibung einer einzigartigen viralen Lokalisation in dieser Spezies nahe oder sogar, ob sie in FPV-infizierten Katzen gefunden werden kann. Dieser Befund kann frühere Studien stützen, in denen FPV im Urin gefunden wurde. Einzigartige pathologische Befunde können subjektiv sein und bei Personen als Infektion beobachtet werden. Daher wird eine großangelegte Untersuchung von Fischkatzen-CPPV-1 eine endgültige Interpretation erleichtern. Darüber hinaus sind Proben, die überwiegend von toten Tieren eingereicht wurden und bereits einer postmortalen Autolyse unterzogen wurden, für eine weitere Organentnahme bei diesen Tieren nicht geeignet. Daher konnten wir die virale Lokalisation in anderen Organen nicht bestimmen. Die Aufklärung einer atypischen viralen Lokalisierung von Fischkatzen-CPPV-1 wäre eine nützliche Untersuchung.

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENERKRANKUNGEN VERBESSERN

CPPV-1 wurde bei verschiedenen wilden Fleischfressern identifiziert und wird mit tödlichen Ausbrüchen in Verbindung gebracht. Der negative Nachweis des retrospektiven CPPV-1-Nachweises in Zoo-Wildproben in dieser Studie kann entweder auf keinen engen Kontakt zwischen empfänglichen Tieren oder andererseits auf eine längere Lagerung der Proben zurückzuführen sein, die die Stabilität des genomischen Materials beeinträchtigt. Die neuartige Identifizierung von CPPV-1 im Zusammenhang mit einer tödlichen Infektion von Fischkatzen in dieser Studie wirft Bedenken hinsichtlich einer neuartigen, potenziell virulenten Krankheit bei diesem gefährdeten Tier auf. Daher ist eine weitere Untersuchung der Übertragung von CPPV-1 bei Fischkatzen unerlässlich, um den Verlust anderer anfälliger Tierarten zu verhindern. Dementsprechend sollten Präventionsstrategien betont werden, um CPPV-1-Infektionen zu bewältigen, nicht nur bei dieser Art, sondern auch bei freilaufenden Haustieren, die als potenzielle Wirte für dieses Virus dienen können.