Teil 1 Neuroprotektive Wirkungen von Phenylethanoidglykosiden in einem In-vitro-Modell der Alzheimer-Krankheit
Mar 10, 2022
Ist die neuroprotektive Wirkung von Cistanche echt?
JIANHUA YANG1*, BOWIE JU1,2*, YAO YAN1, HUAN HUAN XU1,
SHANSHAN WU1, DANDAN ZHU1, DANDAN CAO1 und SPRINGEN HU2
1 Abteilung für Pharmazie, das erste angeschlossene Krankenhaus; 2 Institut für Naturheilkunde,
College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang 830011, VR China
Erhalten am 8. Januar 2016; Akzeptiert am 6. Januar 2017
Abstrakt.
Die vorliegende Studie zielte darauf ab, die neuroprotektiven Wirkungen von zu untersuchenPhenylethanoidglykoside(PhGs) auf H2O2-- und -amyloidpeptid (A)1-42--induzierter Schädigung von PC12-Zellen als In-vitro-Modell der Alzheimer-Krankheit (AD). Die optimalen Induktionsbedingungen wurden durch Screening verschiedener Inkubationszeiten und Konzentrationen ermittelt. PC12-Zellen wurden mit 0,5 µM A 1-42 und H2O2 in Gegenwart von PhGs für 24 h behandelt und die Zelllebensfähigkeit wurde dann durch einen MTT-Assay bewertet; Die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) und der Gehalt an Malondialdehyd (MDA) wurden ebenfalls gemessen. Die optimalen Bedingungen zur Etablierung des AD-Modells waren die Behandlung von PC12-Zellen mit 0,5 µM A 1-42 für 48 h oder mit 25 µM H2O2 gelöst in DMEM mit PBS. PhGs in Konzentrationen von 5, 25 und 50 µg/ml erhöhten die Lebensfähigkeit und verringerten die Freisetzung von LDH und MDA durch PC12-Zellen, die mit A 1-42 oder H2O2 verletzt wurden. Zusammenfassend wurde das Modell der durch A1-42- und H2O2- induzierten Schädigung von PC12-Zellen erfolgreich etabliert. Es wurde gezeigt, dass PhGs eine signifikante neuroprotektive Wirkung gegen A1-42-- oder H2O2--induzierte Zellverletzungen haben.
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Einführung
Die Alzheimer-Krankheit (AD), eine neurodegenerative Erkrankung mit den klinischen Merkmalen fortschreitender Gedächtnisverlust und Beeinträchtigung der kognitiven Funktion (1), ist weltweit die häufigste Ursache für Demenz (2). Der finanzielle Aufwand ist aufgrund der Prävalenz der AD immens (3). Daher ist es dringend erforderlich, geeignete Mittel für das Management und die Prävention von AD zu entwickeln.
Die Pathogenese von AD ist eng mit der Akkumulation von neurofibrillären Tangles und senilen Plaques (SPs) in betroffenen Hirnregionen verbunden (4,5). -Amyloid-Peptid (A), der Hauptbestandteil von SPs, soll eine ursächliche Rolle beim Fortschreiten von AD spielen, da es eine toxische Wirkung auf neuronale Zellen hat (6). A-Fragmente, einschließlich A 1-40, A 25-35 und A 1-42, wurden durch die Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins (7) erzeugt. Die Neurotoxizität von A 1-42 war signifikant höher als die von A 25-35 und A 1-40, und A 1-42 ist in der Lage, ein AD-Modell zu induzieren (1,{ {13}}). Oxidativer Stress kann an der Pathogenese von AD beteiligt sein und ist der Hauptmechanismus, der der A-induzierten Neurotoxizität zugrunde liegt (11-13). Mehrere Studien deuteten darauf hin, dass A 1-42 eine intrazelluläre Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verursachte, was zu Lipid- und Proteinoxidation, DNA-Schäden und Aktivierung der Zellzyklus-Checkpoint-Signalgebung führte (1,14,15). Übermäßige Mengen an H2O2 können zu oxidativen Schäden führen und die Apoptose von PC12-Zellen induzieren (16). Daher könnte die Bekämpfung von oxidativem Stress ein vielversprechender Ansatz für die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Hemmung der A-induzierten Neurotoxizität bei AD sein. Herba (H.)Cistanche, ein chinesisches Kräuterarzneimittel, das auf dem chinesischen Festland häufig zur Ernährung der Nieren und zum Auffüllen von Essenz und Blut verwendet wird, wurde zur Behandlung von Gedächtnisverlust und seniler Verstopfung eingesetzt (17).Phenylethanoidglykosid(PhG), einer der Hauptbestandteile von H.Cistanche, verbessert die Beeinträchtigung der neuronalen Apoptose, die durch A 25-35 verursacht wird, über seine antioxidativen Wirkungen (18,19). Eine frühere Studie identifizierte fünf Hauptkomponenten der gesamten PhGs, nämlichActeosid, 2'-Acetylacteosid, Echinacosid, Cistanoside undIsoacteosid(20). Unter diesen Komponenten sindActeosidundEchinacosidEs wurde berichtet, dass sie neuroprotektive Wirkungen auf A25-35-- oder H2O2--induzierte Neurotoxizität haben (21-23). Zum Beispiel haben Wu et al. (24) dies vorgeschlagenActeosidundEchinacosidverbesserte kognitive Dysfunktion, verursacht durch A 1-42. Die vorliegende Studie zielte darauf ab, die schützenden Wirkungen von PhGs in einem In-vitro-Rattenzellmodell von AD zu untersuchen.
Materialen und Methoden
VorbereitungvonPhGs. Gesamt-PhGs wurden extrahiertH. Cistanchewie zuvor beschrieben (25). Der luftgetrocknete Stamm vonH. Cistanche wurde pulverisiert und durch Perkolation mit 80-prozentigem EtOH extrahiert. Das Perkolat wurde unter reduziertem Druck eingedampft
Druck, gefolgt von Resuspension in einer geeigneten Menge H2O2(100 µmol/l). Das Gemisch wurde auf einer makroporösen SP-825-Harzsäule (Mitsubishi Chemical, Tokio, Japan) isoliert und mit 0, 30, 50, 70 und 90 % EtOH in Wasser eluiert. Um die PhG-reiche Fraktion zu erhalten, wurden die 30-50 Prozent EtOH-Elutionsmittel konzentriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Ultraviolett (UV)-Spektrophotometrie wurde durchgeführt, um die Gesamt-PhGs zu bestimmen. Der Inhalt vonEchinacosidundActeosidwurde nach einem früheren Protokoll (26) durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt. Eine Hypersil ODS-2-Säule (4,6 x 250 mm, 5 µm; Dalian Elite Analytical Instruments, Co., Ltd., Dalian, China) wurde verwendet und bei Raumtemperatur gehalten. Die mobilen Phasen waren Methylcyanide und Wasser mit 0,4 Prozent Phosphorsäure (v/v; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland). Die Flussrate betrug 0,75 ml/min und die Wellenlänge wurde auf 333 nm eingestellt.
Zellkulturundmedikamentöse Behandlung.Die PC12-Ratten-Phäochromozytom-Zelllinie wurde von Dr. He Chunhui, der Medizinischen Fakultät der Medizinischen Universität Xinjiang (Urumqi, China) bereitgestellt. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit hohem Glukosegehalt (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) mit 10 % fötalem Rinderserum (Sangon Biotech Co. Ltd., Shanghai, China), 100 U/ml, kultiviert Penicillin und 100 U/ml Streptomycine in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2und 95 Prozent Luft. Nach Erreichen von 8 0 Prozent Konfluenz wurden die Zellen mit 0,25 Prozent Trypsin behandelt und passagiert.
Um die Beeinflussung des Wachstums von PC12-Zellen durch das Medikament selbst zu eliminieren, wurde ein Toxizitätsexperiment durchgeführt. Kurz gesagt, PC12-Zellen (3x104Zellen/ml) wurden in Platten mit 96- Vertiefungen mit 100 ul/Vertiefung ausgesät und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Nach Verwerfen des Überstands wurden 200 µl vollständiges DMEM in die Blindgruppe gegeben, während Zellen in den Interventionsgruppen mit PhGs in verschiedenen Dosierungen (5, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 und 200 µg/ ml). Nach 48-stündiger Inkubation der Zellen bei 37 °C wurden 20 µl MTT-Lösung (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) in jede Vertiefung gegeben. Nach 4-stündiger Inkubation wurde der Überstand verworfen und 150 &mgr;l Dimethylsulfoxid wurden pro Vertiefung zugegeben, gefolgt von 10-minütigem Rühren. Die Werte der optischen Dichte (OD) bei 490 nm wurden unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesegeräts erfasst.
A 1‑ 42-induziertPC12Zellverletzung.Ein von Bioss Biotech (Peking, China) erworbenes 1-42-Peptid wurde in Wasser (100 ug/ml) gelöst. Anschließend wurde die Mischung 4 Tage bei 37 °C inkubiert und vor der Verwendung bei 4 °C gelagert.
PC12-Zellen wurden in 96-Well-Platten (3xl04Zellen in 100 µl pro Vertiefung). Nach 24-stündiger Kultivierung zur Adhärenz wurden 50 µl A 1-42 in verschiedenen Endkonzentrationen (0, 0.25, 0,5, 1, 1,5 oder 2 µM) gelöst in serumfreiem DMEM wurde zugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 24, 48, 72 oder 96 h. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch einen MTT-Assay bewertet. Die optimale A 1-42-Konzentration betrug 0,5 und wurde als µM bestimmt. PC12 Zellen (3xl04Zellen pro Vertiefung) wurden mit verschiedenen Dosen von PhGs ({{0}}, 0,5, 5, 25 oder 50 µg/ml) in Gegenwart von 0,5 µM A {{8 }} für 24 Std. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch einen MTT-Assay bewertet.
H2O2-induziertPC12Zellverletzung. PC12-Zellen wurden ausplattiert, ausgesät in 96-Well-Platten (3xl04Zellen in 100 µl pro Vertiefung). Nach der Kultivierung
für 24 h für die Adhärenz, 100 ul H2O2in verschiedenen Endkonzentrationen ({{0}}, 25, 50, 100, 200, 300, 400 und 500 µM) gelöst in DMEM mit oder ohne PBS (0,01 mol/l) zugegeben, gefolgt von Inkubation für 24 Std. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch einen MTT-Assay bewertet. Das optimale H2O2Konzentration und Lösungsmittel wurden bestimmt, um die zu ermittelnin-vitroModell von AD.
PC12 Zellen (3xl04Zellen pro Well) wurden mit verschiedenen Dosen von PhGs ({{0}}, 0,5, 5, 25 und 50 µM) behandelt. Nach 24-stündiger Kultivierung zur Adhärenz wurden PC12-Zellen mit 100 &mgr;l H behandelt2O2gelöst in DMEM mit PBS in Gegenwart von PhGs für 24 h. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch einen MTT-Assay bewertet.
LaktatDehydrogenase (LDH)Freisetzungstest. Die Zellschädigung wurde durch Messen der LDH-Aktivität im Überstand von PC12-Zellen unter Verwendung eines LDH-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers (Kat.-Nr. 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) bewertet. Kurz gesagt, doppelt destilliertes H2O, {{0}},2 µmol/ml Brenztraubensäure, Matrixpuffer und Coenzym-I-Puffer wurden nacheinander 48 h nach der Arzneimittelbehandlung zugegeben. Nach 15-minütiger Inkubation bei 37 °C wurde 2,4-Dinitro-Phenylhydrazin hinzugefügt. Anschließend wurden 250 &mgr;l einer 0,4 M NaOH-Lösung zu jeder Vertiefung gegeben. Der Überstand wurde nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur gesammelt. Die Extinktion bei 450 nm wurde dann mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen.
MessungvonMalondialdehyd(MDA). MDA wurde im Überstand von PC12-Zellen unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Kat.-Nr. 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen. Kurz gesagt, dehydrierter Alkohol und andere Reagenzien wurden der Reihe nach zugegeben, gefolgt von einer Inkubation in einem Wasserbad bei 95˚C für 40 min. Die Mischung wurde bei 1006 x zentrifugiertg und 25˚C für 10 min nach dem Abkühlen. Der Überstand wurde dann zur Bestimmung des MDA-Gehalts verwendet. Die Absorption wurde anschließend mit einem Mikroplattenlesegerät bei 532 nm gemessen.
Bewertung von schützend Auswirkungen von Echinacosid und Acteosid gegen ANZEIGE in vitro. PC12-Zellen wurden mit einer Dichte von 3xl ausgesät04Zellen/Well in {{0}}Well-Platten (100 µl/Well). Die Zellen wurden mit Arzneimitteln einschließlich Echinacosid (Kat.-Nr. 111670-200503; National Institutes for Food and Drug Control, Peking, China) und Acteosid (Kat.-Nr. 111530-200505; National Institutes for Food and Drug Control) inkubiert ) in verschiedenen Konzentrationen (0,5, 25 und 50 µg/ml). Anschließend wurden die Zellen mit A 1-42 oder H behandelt2O2für 24 h und die Zelllebensfähigkeit wurde durch einen MTT-Assay gemessen.
Statistisch Analyse. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Der Student's t-Test wurde für Vergleiche zwischen den Gruppen verwendet. Statistische Analysen wurden mit SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Ergebnisse
Quantifizierung von PhGs von H. Cistanches.Die UV-Spektren der extrahierten PhGs sowie Standardlösungen vonEchinacosidund Acteosid wurden aufgezeichnet, und die Ergebnisse zeigten, dass die UV-Spektren konsistent waren (Abb. 1). UV-Spektrophotometrie
zeigte, dass der PhG-Gehalt 87,6 Prozent betrug. Die HPLC-Ergebnisse zeigten, dass die Gehalte Echinacosid und Acteosid waren
37,7 bzw. 17,8 Prozent (Abb. 2).
FestlegungvondasIdealPhGKonzentration. Verglichen mit der Blindgruppe hatte PhG bei 75, 100, 125, 150, 175 und 200 µg/ml eine signifikante hemmende Wirkung auf PC12-Zellen (P<0.05), while="" phg="" at="" 5,="" 25="" and="" 50="" µg/ml="" showed="" low="" toxicity="" on="" pc12="" cells,="" and="" the="" cell="" viability="" was="">80 Prozent (Abb. 3). Daher wurden PhGs in Konzentrationen von 5, 25 und 50 &mgr;g/ml zur Behandlung von PC12-Zellen in nachfolgenden Experimenten verwendet, da sie die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigten.
A 1‑42-induziertPC12Zellverletzung.Verglichen mit der Kontrollgruppe betrug die Zelllebensfähigkeit in der Verletzungsgruppe 0,5 µM A 1-42 63 Prozent (P<0.05). the="" cell="" viability="" was="" decreased="" by="" aβ1-42="" in="" a="" concentration-dependent="" manner,="" and="" the="" viability="" was=""><50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups="" (fig.="" 4).="" thus,="" treatment="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="">in-vitroAD-Modell.
Die Aktivität von PC12-Zellen, die mit 0,5 µM A 1-42 in Gegenwart sicherer Dosen von PhGs (5, 25 und 50 µg/ml) für 24 h behandelt wurden, wurde ebenfalls bestimmt. Verglichen mit der Modellgruppe (P<0.01), phgs="" showed="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" rescued="" by="" phgs="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="">
H2O2-induziertPC12Zellverletzung. Die Lebensfähigkeit von PC12-Zellen, die mit 25 µM H behandelt wurden2O2gelöst in DMEM mit PBS betrug 56,43 % . Die Lebensfähigkeit von PC12-Zellen, die mit 200 µM H behandelt wurden2O2gelöst in DMEM ohne PBS betrug 71,64 Prozent (Tabelle I). Somit wurden PC12-Zellen, die mit 25 µM H2O2gelöst in DMEM mit PBS wurden als optimale Bedingung für die Etablierung des AD-Modells ausgewählt.
Im Vergleich zur Kontrollgruppe betrug die Zellviabilität in der Modellgruppe 48,8 Prozent (P<0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" phgs="" had="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" dose-dependently="" increased="">
PhGs und die Lebensfähigkeit von PC12-Zellen, die mit PhGs bei Konzentrationen von 5, 25 und 50 &mgr;g/ml behandelt wurden, betrugen 54, 57 bzw. 64 Prozent (Tabelle II).
PhGs hemmen die verletzungsinduzierte LDH-Freisetzung durch PC12-Zellen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe war der LDH-Gehalt im Überstand verletzter PC12-Zellen erhöht, was konzentrationsabhängig durch PhGs gehemmt wurde. Dieses Ergebnis zeigte, dass PhGs eine signifikante neuroprotektive Wirkung auf PC12-Zellen haben ( 6 ).
durch PhGs konzentrationsabhängig gehemmt. Dieses Ergebnis zeigte, dass PhGs eine signifikante neuroprotektive Wirkung auf PC12-Zellen hat ( 7 ). PhG und seine Bestandteile Echinacosid und Acteosid retten die Lebensfähigkeit von verletzten PC12-Zellen. Verglichen mit der Modellgruppe erhöhte die Behandlung mit Acteosid die Lebensfähigkeit von A 1-42--geschädigten PC12-Zellen dosisabhängig signifikant. PhGs und Echinacosid erhöhten auch signifikant die Lebensfähigkeit von A 1-42--geschädigten PC12-Zellen bei allen getesteten Konzentrationen (Fig. 8A).
Im Vergleich zur Modellgruppe erhöhte Acteosid die Lebensfähigkeit von mit H. behandelten PC12-Zellen signifikant2O2. PhGs erhöhten auch die Lebensfähigkeit von PC12-Zellen, die mit H2O2, während die Wirkung bei Konzentrationen von 5 und 25 &mgr;g/ml nicht signifikant war ( 8B ). Zusätzlich erhöhte Echinacosid die Zelllebensfähigkeit bei 25 ug/ml.
Zusammenfassend übten Acteosid, PhGs und Echinacosid signifikante neuroprotektive Wirkungen auf PC12-Zellen aus, die einer Verletzung mit A 1-42 oder H ausgesetzt waren2O2.
