Neue Bildgebungswerkzeuge zur Messung der Nephronzahl in vivo: Möglichkeiten für die Entwicklungsnephrologie

Für mehr Information. Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt

Das SäugetierNiereist ein komplexes Organ, das die konzertierte Funktion von bis zu Millionen von Nephronen erfordert. Die Anzahl der Nephrone ist nach der Nephrogenese während der Entwicklung konstant, und der Nephronverlust über eine Lebensspanne kann zu einer Anfälligkeit für akute oder führenchronisches Nierenleiden. Neue Technologien werden entwickelt, um einzelne Nephrone in der Niere in vivo zu zählen. Dieser Übersichtsartikel umreißt diese Technologien und hebt ihre Relevanz für Studien zur menschlichen Nierenentwicklung und -erkrankung hervor.

Klicken Sie hier, um mehr über die Verwendung von Herbacistanches zu erfahren

Einführung

Die Säugetierniere ist ein komplexes Organ, das sich entwickelt hat, um ein breites Spektrum physiologischer Prozesse zu steuern. Diese Prozesse umfassen Blutvolumen, Blutdruck, osmotischen Druck, Abfallbeseitigung und Metaboliten-Homöostase. Eine normale Nierenentwicklung erfordert die wechselseitige Bildung der Ureterknospe und des metanephrischen Mesenchyms. Darauf folgt ein iterativer Verzweigungsprozess und eine Signalkaskade, um einen erneuerbaren Pool von Vorläuferzellen aufrechtzuerhalten, die die differenzierten Zellen produzieren, die die verschiedenen Funktionen der Nieren erfüllen.

Die Dauer und das Ende der Nephrogenese variieren zwischen den Arten. Bei Menschen und nichtmenschlichen Primaten treten Geburt und Ende der menschlichen Nephrogenese zu ähnlichen Zeitpunkten auf; Die Nephrogenese endet beim Menschen etwa in der 35. Schwangerschaftswoche. Arten, die Würfe von Nachkommen gebären, haben oft eine variable Periode der natürlichen postnatalen Nephrogenese. Variiert die Nephronzahl je nach Art, Stamm,Sex, und Umwelt- und genetische Faktoren? Die Anzahl der menschlichen Nephrone ist sehr unterschiedlich (200, 000 bis 2,7 Millionen), basierend auf Studien bei der Autopsie. Eine breite Spanne von Nephronzahlen wurde auch bei einer Autopsie von Neugeborenen beim Menschen beobachtet, was darauf hindeutet, dass diese Spanne während der Nephrogenese festgestellt wird.

Die Anzahl der Nephrone kann die Anfälligkeit für zahlreiche Nierenerkrankungen bestimmen, und der Verlust der Nephrone kann die Entwicklung einer chronischen Nierenerkrankung (CKD) beschleunigen. Es ist daher wichtig, die Ursachen für die niedrige Nephronzahl und den Verlust zu berücksichtigen und zu verstehen, warum beim Menschen ein so großer Bereich der Nephronzahl verbleibt. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass genetische und epigenetische Faktoren, die durch die Gesundheit und Ernährung der Mutter bestimmt werden, entscheidende Determinanten der Nephrogenese sind. Die fetale Entwicklung wird durch die von der Mutter verfügbare Energie eingeschränkt, die durch die Plazentafunktion reguliert wird. Der evolutionäre Selektionsdruck, der durch die reproduktive Fitness bestimmt wird, hat dem Gehirnwachstum Vorrang vor der fötalen und frühen postnatalen Nierenentwicklung eingeräumt, wobei über 50 Prozent des Ruheumsatzes im ersten Lebensjahr dem Gehirn zugewiesen werden. So führen mütterliche Unterernährung, Umweltstress oder Infektionen zu intrauteriner Wachstumseinschränkung oder vorzeitiger Abgabe und Herunterregulierung der DNA-Methylierung in Nephron-Vorläuferzellen. Die molekularen Mechanismen, die für die Entwicklung einer gesunden Niere notwendig sind, wurden hauptsächlich in Nagetiermodellen untersucht. Bis vor kurzem gab es jedoch nur wenige direkte Vergleiche zwischen der Nierenentwicklung bei Nagetieren und beim Menschen.

Der Nephronverlust wird typischerweise durch Hypertrophie und Hyperfiltration der verbleibenden Nephrone überwunden, was durch die Aufrechterhaltung der GFR der gesamten Niere belegt wird. Hypertrophie ist eine kurzfristige Anpassung, um die metabolische Homöostase während der reproduktiven Jahre aufrechtzuerhalten. Es gibt jedoch physikalische Einschränkungen für die adaptive Hypertrophie, begrenzt durch die für den Transport erforderliche röhrenförmige Oberfläche und den Strömungswiderstand, der sich aus der zunehmenden röhrenförmigen Länge ergibt. Diese Einschränkung wird bei den größten Säugetieren (Walen) überwunden, indem 100 Millionen Nephrone in kleine unipapilläre Einheiten verpackt werden, die kurze Tubuli enthalten. Jenseits der reproduktiven Jahre fördert eine zunehmende oxidative Zellschädigung, die aus sich anhäufenden Stressoren (Ischämie, Hypoxie, Infektion) resultiert, einen anhaltenden Nephronverlust, der die Seneszenz überlagert, was sich in einer 50-prozentigen Verringerung der Nephronzahl in der normalen alternden Bevölkerung widerspiegelt.

Trotz unseres wachsenden Verständnisses der Nierenentwicklung und der Rolle des Gestationsumfelds bei der Feststellung der Nierengesundheit fehlt uns immer noch eine integrierte Sicht auf einzelne Nephrone im Kontext des intakten, funktionierenden Organs. Gegenwärtige nicht voreingenommene Methoden zur Schätzung der glomerulären Anzahl erfordern die Zerstörung der Niere, was ihr Potenzial für Längsschnittanalysen und die Verwendung in vivo einschränkt. Die Entwicklung nichtinvasiver Bildgebungsverfahren zur Verfolgung der Anzahl funktionierender Nephrone während des gesamten Lebenszyklus würde Schlüsselinformationen liefern, um das Fortschreiten chronischer Nierenerkrankungen vorherzusagen und die Wirksamkeit neuer Interventionen zu messen.

Es werden neue radiologische Werkzeuge entwickelt, um diese Herausforderungen anzugehen und ein nicht-invasives Mittel zur Verfolgung und Messung der Nephronmasse in vivo bereitzustellen. Diese Technologie hat das Potenzial, neue Einblicke in die Nierenentwicklung und ihre Rolle bei der Krankheitsprogression im späteren Leben zu liefern. Zu den durch diese Technologie verfügbaren Beobachtungen gehören die Nephronzahl, das glomeruläre Volumen und die Hypertrophie und möglicherweise die Funktion eines einzelnen Nephrons. Dieser Bericht wird den aktuellen Stand dieser neuen Technologie skizzieren und einen Überblick über ihre potenziellen Anwendungen in der vorklinischen Wissenschaft und in klinischen Untersuchungen geben.

Ex-vivo-Ansätze zur Messung der Nephronzahl und der glomerulären Größe

Die am weitesten entwickelten Ansätze zur Messung der Nephronzahl und der glomerulären Größe basieren auf designbasierter Stereologie. Das Gewebe wird für die Mikroskopie präpariert und geschnitten, und die Größen der Strukturen, wie Glomeruli, die auf den Objektträgern beobachtet werden, werden analysiert, um die durchschnittlichen Volumina der Strukturen im ursprünglichen Gewebe abzuleiten. Dies kann in entnommenen Organen oder aus Biopsiegewebe durch systematisches und zufälliges Probenentnehmen des Gewebes durchgeführt werden. Die Dissektor-Fraktionator-Technik hat populationsbasierte Unterschiede in der Anzahl der Nephrone und der Hyperfiltration beim Menschen aufgedeckt25 und wurde ausgiebig zur Untersuchung von Tiermodellen menschlicher Krankheiten eingesetzt.

Um die für die Stereologie erforderlichen Schnitte zu vermeiden, wurden kürzlich neue bildgebende Verfahren entwickelt, um Biopsiedaten zu ergänzen und die Anzahl der Nephrone zu messen. Die Magnetresonanztomographie (MRT) basiert meistens auf dem Nachweis von Wasserprotonen in Gewebe, hauptsächlich aus Wasser, unter Verwendung von Magnetfeldern. Das Objekt oder die Probe wird in ein großes Magnetfeld gebracht. Typische Magnetfeldstärken, die für die klinische MRT verwendet werden, reichen von 1,5 T bis 7 T. Vorklinische MRI-Systeme verwenden häufig viel größere Feldstärken für ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis und einen verbesserten Bildkontrast und eine verbesserte Auflösung. Die MRT bietet eine breite Palette von Bildkontrasttechniken zur Darstellung von Weichgewebe und erfordert keine ionisierende Strahlung. Die MRT bietet auch eine hohe Auflösung sowohl in vorklinischen als auch in klinischen Systemen.

Kationisches Ferritin (CF) wurde als intravenös injiziertes Kontrastmittel eingeführt, um Glomeruli in der gesamten Niere durch MRT zu erkennen und abzubilden. Geladene Nanopartikel, einschließlich Ferritin, wurden jahrzehntelang verwendet, um die Struktur und Funktion der Basalmembran mittels Elektronenmikroskopie (EM) zu untersuchen. CF wurde ursprünglich als Tracer für die Elektronenmikroskopie von Danon entwickelt, der zeigte, dass es an anionische Stellen binden kann . Das Ferritinmolekül wird im EM wegen seines elektronendichten Eisenoxidkerns nachgewiesen. Derselbe Eisenoxidkern ist oft magnetisch, wodurch er durch MR nachweisbar ist. Diese Technik, kationisches Ferritin-verstärktes MRI (CFE-MRI), wurde verwendet, um jeden Glomerulus in gesunden Rattennieren30 ex vivo zu zählen, und wurde verwendet, um die intrarenale Verteilung der glomerulären Volumina zu messen. CFE-MRI wurde auch verwendet, um jeden Glomerulus in der Mausniere zu zählen und zu messen3], und glomeruläre Volumina wurden kartiert, um die räumliche Variation der glomerulären Größe aufzudecken. Diese Ergebnisse wurden von mehreren Gruppen bestätigt. Sowohl Ratten- als auch Mausmessungen unter Verwendung von CFE-MRI wurden durch Dissektor-Fraktionator-Stereologie validiert.

CFE-MRT wurde auch an intakten menschlichen Spendernieren durchgeführt, bei denen CF direkt in die Nierenarterie injiziert und die Niere mit Kochsalzlösung gespült wurde, bevor sie fixiert und abgebildet wurde. CFE-MRT in menschlichen Nieren lieferte eine dreidimensionale Ansicht derNieren glomerulärMorphologie, die eine heterogene glomeruläre Hypertrophie und Regionen mit Nephronverlust zeigt, die wahrscheinlich mit der unbehandelten Hypertonie des Patienten assoziiert sind. Regionen mit Nephronverlust wurden mit der Histologie aus denselben Regionen korreliert, was sowohl vaskuläre als auch glomeruläre Sklerose zeigte.

Diese anfänglichen Studien konzentrierten sich auf Veränderungen der Nephronzahl und der glomerulären Morphologie sowohl bei chronischer als auch bei akuter Nierenerkrankung. Bei Bennett et al.-26 wurde die Verteilung von CF in der Niere aufgrund einer frühen glomerulären Pathologie in einem Rattenmodell mit fokaler und segmentaler Glomerulosklerose vor Auftreten einer Proteinurie umverteilt. Bei Mäusen wurde CFE-MRI angewendet, um glomeruläre Hypertrophie im Oligosyndaktylismus(Os/plus)-Modell der Nephronreduktion zu erkennen und abzubilden31. Vor kurzem haben wir das gezeigtakute Nierenschädigungverursachte in einem neugeborenen Kaninchenmodell einen nachweisbaren Verlust von Glomeruli mit vaskulärer Reorganisation.

Es gibt einige wichtige Überlegungen bei der Validierung der CFE-MRT unter Verwendung anderer Techniken, wie z. B. der in diesen frühen Studien verwendeten Directors-Fractionator-Stereologie. Die CFE-MRT kann nur Glomeruli messen, die perfundiert sind, während histologische Ansätze auch nicht perfundierte Glomeruli erkennen können. Wenn die beiden bei unter- oder nicht durchbluteten Glomeruli direkt verglichen werden, sind die MRT-Messwerte niedriger. Strukturelle und funktionelle Faktoren wie onkotischer Druck, kapillare Perfusionsraten und GBM-Struktur, die die CF-Akkumulation im GBM beeinflussen, sind kaum bekannt, daher ist es möglich, dass die glomeruläre Aufnahme durch Krankheitsprozesse moduliert wird, die die CFE-MRT in gewisser Weise modulieren die nicht beschrieben wurden. Schließlich können GBM-Schäden oder Proteinurie ein Austreten des CF in die Tubuli verursachen, was zu einer diffusen statt punktuellen Markierung der Glomeruli führt, die durch MRT beobachtet wird. In Entwicklungsstudien variieren die GBM-Ladungsstruktur und die glomeruläre Filtration mit dem Gestationsalter. In all diesen Fällen ist es wichtig, die an der CF-Kennzeichnung beteiligten Parameter durch fortgesetzte Untersuchungen zu verstehen. Es ist auch entscheidend, die Toxikologie von CF zu ermitteln, die bei gesunden Tieren minimal erscheint, aber mit jedem neuen Modell untersucht werden muss.

Röntgen-CT wurde kürzlich für die Messung der Nierenmikrostruktur und die Kartierung der Nephronzahlen in der intakten Niere ex vivo demonstriert. Ein Hauptvorteil der CT ist ihre Einfachheit und Geschwindigkeit in der Anwendung sowie die geringen Kosten im Vergleich zur MRT. Ein Nachteil ist die Verwendung von ionisierender Strahlung, die ihre Verwendung in vivo oder in klinischen Anwendungen einschränken kann. Nichtsdestotrotz bietet C eine hochauflösende Bildgebung von markierten Strukturen ex vivo, die dann mit anderen Bildgebungsmodalitäten mit der Weichteilanatomie koregistriert werden können.

Lichtblattmikroskopie nach optischer Reinigung des gesamten Organs wurde verwendet, um die glomeruläre Anzahl und Kapillarbüschelgröße in intakten Mäusenieren zu messen. Dieser attraktive Ansatz hat den Vorteil der Automatisierung und Visualisierung des gesamten Glomerulus mit mikroskopischer Auflösung im gesamten Organ oder in Proben großer Organe.

In-vivo-Ansätze zur direkten Messung der Nephronzahl und der glomerulären Größe

Etablierte und neu entstehende Instrumente zur ex vivo-Messung der Nephronzahl haben es ermöglicht, die Inter- und Intra-Subjekt-Heterogenität der Nephronzahl und des glomerulären Volumens abzuleiten. Diese Werkzeuge beginnen, kritische Lücken in unserem Wissen über die Nierenstruktur und ihre Beziehung zur Funktion in der Niere in vivo zu schließen. Diese Fragen umfassen: 1) Welche Beziehung besteht zwischen der Anzahl und Größe der Glomeruli und der individuellen Nephronfiltration?, 2) Wie ist die räumliche Verteilung der Anzahl der Nephrone und der Größe der Glomeruli und deren Beziehung zur Pathologie? und 3) Gibt es eine Alterungsrate der Glomeruli? Veränderung des Gesundheitszustandes und Nierenerkrankungen? Klinisch ist es möglich, die Nephronzahl in vivo abzuschätzen, indem eine Kombination aus Röntgen/CT und Biopsie verwendet wird. Diese Art von Arbeit beginnt, eine entscheidende Verbindung zwischen der Anzahl der Nephrone und der Nierenfunktion herzustellen. Mehrere Veröffentlichungen haben gezeigt, dass MRI verwendet werden kann, um einzelne Glomeruli in einem lebenden Tier nachzuweisen. Die frühen Arbeiten auf diesem Gebiet unter Verwendung von CFE-MRI waren auf bestimmte Regionen der Niere beschränkt. In einem Bericht wurde ein drahtloser Verstärker entwickelt, um das Signal in der Niere lokal zu verstärken, um eine Koregistrierung einzelner Nephrone während der Filtration und Funktion zu ermöglichen4. In jüngerer Zeit haben zwei Veröffentlichungen über Messungen einzelner Glomeruli in vivo in der gesamten Niere durch CFE-MRI sowohl bei Ratten als auch bei Mäusen berichtet. Dieser Ansatz wurde auch in einem Längsschnittexperiment verwendet, das zeigte, dass CFE-MRT potenziell verwendet werden kann, um Änderungen der Nephronzahl im Laufe der Zeit als Reaktion auf die Therapie zu überwachen oder die Nierenentwicklung zu verfolgen.

Eine primäre Herausforderung bei CFE-MRT in vivo ist die Empfindlichkeit. Deoxyhämoglobin im Blut ist paramagnetisch und kann ein magnetisches Suszeptibilitätsartefakt in den Kapillaren verursachen, das den dynamischen Bereich zum Nachweis von CF-markierten Glomeruli verringert. Um dem entgegenzuwirken, kann Ferritin so modifiziert werden, dass es mehr Eisen enthält, und der Metalloxidkern des CF kann modifiziert werden, um ihn ohne das Suszeptibilitätsartefakt leichter nachweisbar zu machen. Andere Erkennungsstrategien sind jedoch mit Kompromissen in der Produktausbeute oder der Bildgebungsgeschwindigkeit verbunden, sodass die erste Demonstration der CFE-MRT diese Ansätze nicht verwendete. Der Schlüssel zur CFE-MRT ist die Bewegungskontrolle und sicherzustellen, dass die Hochfrequenzspule (RF) über die gesamte Niere ausreichend empfindlich ist.

Ausblick für die Entwicklungsnephrologie: Struktur und Funktion Hier haben wir neu entstehende Werkzeuge zur direkten Messung der Nephronausstattung beschrieben, sowohl ex vivo als auch in vivo. Röntgen-CT ermöglicht eine schnelle Bildaufnahme und Phänotypisierung, ex vivo. Werkzeuge wie Röntgen-CT in Kombination mit Biopsie haben den Vorteil, dass sie schnell in der Klinik eingesetzt werden können, mit dem Nachteil der Invasivität, der Verwendung ionisierender Strahlung und der Möglichkeit einer Probenverzerrung. MRT-basierte Ansätze überwinden die Notwendigkeit ionisierender Strahlung und bieten einen kombinierten Weichteilkontrast und können sowohl ex vivo als auch in vivo verwendet werden. CFE-MRT erfordert die Injektion eines Kontrastmittels, das als sicher gelten muss, bevor es in der Klinik verwendet werden kann. Während die In-vivo-Messung der Nephronzahl noch in den Kinderschuhen steckt, haben neue Bilderfassungssequenzen für die schnelle Bildgebung neben verbesserter Hardware und Bildverarbeitung das Potenzial, diese MRT-Tools für den routinemäßigen Einsatz praktikabel zu machen. Mit zunehmender Reife der Technik werden andere Impulssequenzen eingesetzt, um die Empfindlichkeit gegenüber CF-induzierten Suszeptibilitätsartefakten zu verringern, und die Physik der lokalen magnetischen Umgebung wird besser verstanden, um möglicherweise noch mehr Informationen zu enthüllen. Es gibt auch einzigartige Möglichkeiten, die glomeruläre und tubuläre Morphologie mit anderen Bilderfassungsstrategien zu kombinieren, um einen vollständigen Überblick über die Mikrostruktur, die grobe Anatomie und die Physiologie der Niere in vivo zu erhalten. Diese kombinierten Informationen können verwendet werden, um die Entwicklung des Nephronverlusts im Laufe der Zeit zu untersuchen, ein Hauptmerkmal sowohl akuter als auch chronischer Nierenerkrankungen und fortschreitender Nierenerkrankungen während der Entwicklung.

Die jüngste Verfeinerung der Bildvisualisierung und -segmentierung durch Analysewerkzeuge oder künstliche Intelligenz ermöglicht es, große Informationsmengen aus dreidimensionalen Gewebebildern zu extrahieren. Einige neue Techniken, wie die Suszeptibilitätstensor-Bildgebung, versprechen neue Informationen zu liefern, die als Ersatz für die Gewebemikrostruktur verwendet werden können. In der Niere kann dies kombinierte Karten von Glomeruli, Tubuli, Gefäßsystem und Interstitium aus einer Kombination von co-registrierten Bildern erleichtern. Es kann auch möglich sein, diese Bilder direkt mit der optischen Bildgebung oder mit Informationen zu koregistrieren, die durch andere radiologische Bildgebungsmodalitäten erhalten werden. Es ist in jedem Fall wichtig, diese neuen Tools umfassend zu validieren und schließlich einige Erfassungsprotokolle institutionenübergreifend zu standardisieren, um ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Die Verfügbarkeit und Benutzerfreundlichkeit neuer Tools wird wahrscheinlich neue Ansätze in der Datenwissenschaft vorantreiben, um Informationen aus all diesen Kontrastmechanismen und -modalitäten zu integrieren, um eine neue, quantitative Sicht auf die Niere bei einer großen Anzahl von Probanden zu bieten. In der Entwicklung können diese Tools schließlich in Längsschnittstudien kombiniert werden. Die Einführung und Schaffung von neuem maschinellem Lernen wird für diese Bemühungen von entscheidender Bedeutung sein.

Eine verbleibende Herausforderung besteht darin, Messungen der Anzahl der Nephrone für die In-vivo-Bildgebung beim Menschen zu übersetzen49. Eine klinische Messung der Anzahl der Nephrone oder des glomerulären Volumens würde möglicherweise individualisierte Therapien ermöglichen, die auf die Beobachtungen bei bestimmten Patienten zugeschnitten sind, und könnte einen völlig neuen Blick auf die menschliche Niere eröffnen Entwicklung.