NGF moduliert den Cholesterinstoffwechsel und stimuliert die ApoE-Sekretion in Gliazellen und verleiht so Neuroprotektion gegen oxidativen Stress Teil 2

2.6. NGF-vermittelte Sekretion von ApoE durch U373 schützt neuronale Zellen vor oxidativem Angriff

Immer mehr Beweise belegen, dass ApoE die neuronale Widerstandsfähigkeit gegenüber oxidativen Angriffen erhöht und so Apoptose und Neurodegeneration verhindert [17,18,37]. In diesem Zusammenhang untersuchten wir, ob die NGF-induzierte ApoE-Sekretion durch U373-Zellen N1E-115-Neuronen vor oxidativem Stress schützen kann. Vollständig differenzierte N1E-115 wurden mit Rotenon vorbehandelt, das durch Hemmung des Mitochondrienkomplexes I oxidativen Stress induziert.

Apoptose ist ein Prozess der Selbstzerstörung und eine wichtige Möglichkeit für Zellen, die Homöostase des Körpers durch programmierte Selbstzerstörung unter bestimmten Umständen aufrechtzuerhalten. Apoptose spielt in verschiedenen Lebensphasen unterschiedliche Rollen.

Neuere Studien haben gezeigt, dass ein gewisser Zusammenhang zwischen Apoptose und Gedächtnis besteht. Wir wissen bereits, dass Gedächtnis ein komplexer neuronaler Prozess im Gehirn ist, der Verbindungen und Koordination zwischen mehreren Gehirnregionen beinhaltet. Apoptose könnte bei diesem neuronalen Prozess eine Rolle spielen.

Einerseits kann Apoptose die Netzwerkstruktur von Neuronen stabilisieren, indem unnötige Neuronen und Synapsen entfernt werden, wodurch die Verbindungen von Neuronen verfeinert werden und dadurch die Qualität und Effizienz des Gedächtnisses verbessert wird. Andererseits kann eine übermäßige Apoptose auch zu einer Verringerung der Anzahl von Gehirnzellen führen, was sich negativ auf die Speicherung und Erfassung von Erinnerungen auswirken kann.

Daher können wir unter Beibehaltung eines angemessenen Apoptoseniveaus unser Gedächtnis durch eine Reihe von Verhaltensweisen und Fähigkeiten verbessern, wie z. B. Lesen, Lernen, Sport treiben und unsere Denkweise anpassen. Diese Verhaltensweisen und Fähigkeiten können das Wachstum und die Verbindung von Gehirnzellen fördern und die Qualität und Effizienz des Gedächtnisses verbessern, indem sie die Verbindungen und die Koordination zwischen Gehirnneuronen stimulieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Beziehung zwischen Apoptose und Gedächtnis komplex ist. Nur wenn wir die richtige Apoptose aufrechterhalten, können wir unser Gehirn stimulieren und unser Gedächtnis durch eine Reihe von Verhaltensweisen und Fähigkeiten verbessern. Unter diesem Gesichtspunkt müssen wir unser Gedächtnis verbessern. Cistanche deserticola kann uns erheblich dabei helfen, unser Gedächtnis zu verbessern, da Cistanche deserticola auch das Gleichgewicht von Neurotransmittern regulieren kann, beispielsweise durch die Erhöhung des Acetylcholinspiegels und der Wachstumsfaktoren. Diese Stoffe sind wichtig für das Gedächtnis. Es ist sehr wichtig für das Lernen und Lernen. Darüber hinaus kann Fleisch aus Fleisch auch die Blutflüssigkeit verbessern und den Sauerstofftransport fördern, wodurch sichergestellt werden kann, dass das Gehirn ausreichend Nährstoffe und Energie erhält, wodurch die Vitalität und Ausdauer des Gehirns verbessert werden.

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Nach 16 Stunden Rotenon-Exposition wurden N1E-115-Neuronen in frischem Medium (Ctrl), konditioniertem Medium aus U373-Zellen (U373-Ctrl) und konditioniertem Medium aus U373, vorbehandelt mit NGF, 48 Stunden lang kultiviert (U373-NGF) oder konditioniertes Medium aus ApoE-stummgeschaltetem U373, vorbehandelt mit NGF für 48 Stunden (U373-NGF ApoE siRNA). Die Vorbehandlung mit Rotenon verringerte die Anzahl der im Kontrollmedium kultivierten N1E-115 stark, was darauf hindeutet, dass die Verabreichung dieses Pestizids das Überleben von N1E-115 stark beeinträchtigt.

Die Rotenon-Zytotoxizität führte auch zu einer intensiven Neuritenretraktion, die anhand der Länge der Neuriten beobachtet wurde. Die durch die Rotenon-Behandlung hervorgerufene Neuritenschädigung zeigte sich besonders deutlich bei der Untersuchung neuritentragender Zellen, da die Anzahl der N1E-115 mit Neuriten auf 50 % sank. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn N1E-115-Zellen in U373-Ctrl-konditioniertem Medium kultiviert wurden, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von Überstand aus unstimulierten Astrozyten nicht ausreicht, um neuronale Zellen vor Rotenon-vermittelter Toxizität zu schützen. Im Übrigen verhinderte die Anwendung von konditioniertem Medium aus NGF-behandeltem U373 wirksam den neuronalen Tod sowie die durch Rotenon-Verabreichung verursachte Verringerung der Neuriten tragenden Zellen und der Neuritenlänge (Abbildung 5).

Noch wichtiger ist, dass das konditionierte Medium, das aus ApoE-stummgeschalteten U373-Zellen stammt, die vorteilhaften Wirkungen, die durch das konditionierte U373-NGF-Medium hervorgerufen wurden, vollständig verloren hat, was darauf hindeutet, dass die Neuroprotektion durch die NGF-vermittelte ApoE-Freisetzung im Kulturmedium gesteuert wird. Bemerkenswert ist, dass konditioniertes Medium aus NGF-behandeltem U373, das mit durcheinandergemischter siRNA transfiziert wurde, die Schutzwirkung des konditionierten U373-NGF-Mediums vollständig beibehielt, was zeigt, dass der im konditionierten Medium aus ApoE-stummgeschalteten Zellen beobachtete Verlust der Neuroprotektion effektiv von ApoE abhängt Herunterregulierung (Abbildung S3C).

Abbildung 5. Auswirkungen von U373-konditioniertem Medium auf oxidativen Stress in Neuronen. Repräsentative Bilder im Hellfeld und quantitative Bewertung der neuronalen Morphologie von N1E-115. Die Zellen wurden zuvor 16 Stunden lang mit Rotenon (0,1 µM) behandelt (+) oder nicht (−) und dann in frischem DMEM (Strg) in einem konditionierten Medium kultiviert, das von der Kontrolle U373 (U{{ 9}}Strg), NGF-vorbehandeltes U373 (U373-NGF) und NGF-vorbehandeltes U373, stummgeschaltet für ApoE (U373-NGF ApoE siRNA) für 48 Stunden. n=5 verschiedene Experimente. Die Daten stellen Mittelwerte ± SD dar. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Tukey-Post-hoc-Test bewertet. ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Um die mit dem konditionierten Medium erzielten Ergebnisse zu verstärken, führten wir U373/N1E115-Kokulturen durch. Zu Beginn wurden U373-Zellen 48 Stunden lang mit NGF vorbehandelt oder nicht. Darüber hinaus wurden differenzierte N1E-115-Zellen 16 Stunden lang mit Rotenon vorbehandelt oder nicht. Anschließend wurde das U373-Medium durch frisches Medium mit 0,5 % FBS ersetzt und mit N1E-115 beimpfte Deckgläser wurden auf die U373-Schicht übertragen, um Co-Kulturen vorzubereiten (Abbildung 6A).

Durch die Rotenon-Behandlung hervorgerufener oxidativer Schaden wirkte sich erheblich auf die Zell-Viabilineurit-tragenden Ringzellen und die Neuritenlänge der Kontroll-N1E-115 und N1E-115 aus, die gemeinsam mit U373-Strg-Astrozyten kultiviert wurden (Abbildung 6B). In Übereinstimmung mit Experimenten mit konditioniertem Medium waren N1E-115-Zellen, die gemeinsam mit U373-NGF-Zellen kultiviert wurden, vor oxidativem Schaden geschützt, wohingegen die ApoE-Stummschaltung in U373 den durch NGF aufrechterhaltenen Neuroprotektionsschutz aufhob.

Abbildung 6. Die ApoE-Sekretion durch NGF-behandelte U373-Zellen sorgt für Neuroprotektion vor oxidativem Stress. (A) Repräsentatives Schema von Astrozyten-Neuron-Kokulturen, die wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben eingerichtet wurden. Neuritentragende Zellen, Neuritenlänge und Zellzahl wurden Stunden nach Etablierung der Co-Kultur beurteilt. (B) Repräsentative Bilder im Hellfeld und quantitative Bewertung der neuronalen Morphologie von N1E-115-Zellen, zuvor 16 Stunden lang mit Rotenon (0.1 µM) behandelt (+) oder nicht (−).

N1E-115 wurden dann in frischem DMEM (Strg) gehalten oder mit Kontroll-U373 (U373-Strg), NGF-vorbehandeltem U373 (U373-NGF) und co-kultiviert Mit NGF vorbehandeltes U373 wurde 48 Stunden lang für ApoE (U373-NGF ApoE siRNA) stummgeschaltet. n=5 verschiedene Experimente. Die Daten stellen Mittelwerte ± SD dar. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Tukey-Post-hoc-Test durchgeführt. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

3. Diskussion

Ungleichgewichte in den Neurotrophin-Signalwegen sowie Veränderungen im Cholesterinstoffwechsel im Gehirn stehen in engem Zusammenhang mit neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen wie dem Rett-Syndrom, der Huntington-Krankheit, der Alzheimer-Krankheit (AD) und der Parkinson-Krankheit (PD) [2,38,39] . In diesem Zusammenhang ist die Grundlagenforschung zur biologischen Aktivität von Neurotrophinen von entscheidender Bedeutung für die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die den Cholesterinstoffwechsel mit der Physiopathologie des Gehirns verbinden. In den letzten Jahren wurde in einer interessanten Studie über eine Rolle von BDNF bei der Regulierung des Cholesterinstoffwechsels in Astrozyten berichtet [38].

Trotz dieser Annahme liegen keine Informationen über die mutmaßliche Beteiligung von NGF an der Regulierung des Astrozytencholesterins vor. Daher konzentrierten wir uns in dieser Arbeit auf die voraussichtliche Rolle von NGF bei der Regulierung des Cholesterinstoffwechsels, mit besonderem Bezug auf den Einfluss der ApoE-Sekretion auf die neuronale Differenzierung und das Überleben. U373, die Astrozytom-Zelllinie, die als experimentelles Modell für menschliche Astrozyten verwendet wird, behält das Potenzial, vollständig auf NGF zu reagieren, da sie beträchtliche Mengen sowohl an TrkA als auch an p75NTR exprimiert.

Die Hauptergebnisse zeigten, dass NGF die Spiegel der Hauptproteine ​​hochreguliert, die an der Cholesterinbiosynthese (HMGCR), dem intrazellulären Transport (NPC1) und der Sekretion (ABCA1) beteiligt sind. Diese Ereignisse gehen mit einem gleichzeitigen Anstieg von ApoE und Cholesterinlein im Kulturmedium einher, was darauf hindeutet, dass NGF die Cholesterinbiosynthese und -extrusion aus Gliazellen erhöht. Es wurde berichtet, dass NGF die ApoE-Proteinexpression durch Erhöhung seiner Transkription induziert [40]. Wir konnten jedoch keine signifikante Veränderung der intrazellulären ApoE-Expression beobachten. Diese offensichtliche Inkonsistenz kann dadurch erklärt werden, dass der Aufbau von ApoE aufgrund seines erhöhten Ausflusses aus NGF-behandelten UIn nicht erkannt werden kann
In einem Versuch, die molekularen Mechanismen besser zu analysieren, behandelten wir U373 mit LM11A-31 und stellten fest, dass der p75NTR-Modulator nur in der Lage war, den durch NGF vermittelten Anstieg der HMGCR-Expression nachzuahmen. Die Beteiligung von p75NTR an der Modulation der HMGCR-Spiegel steht im Einklang mit früheren Daten aus anderen Zelltypen und zeigt, dass dieser Rezeptor die Transkription cholesterogener Enzyme steuert [41]. Allerdings induzierte LM11A-31 weder bei den anderen in dieser Studie analysierten Proteinen, einschließlich ABCA1, noch bei den Cholesterin- und ApoE-Spiegeln im Kulturmedium Veränderungen, was darauf hindeutet, dass die selektive Modulation von p75NTR nicht ausreicht, um Cholesterin zu fördern Extrusion durch ApoE-reiche Partikel, beobachtet in NGF-behandelten Zellen. Diese Ergebnisse führen uns zu der Hypothese, dass NGF den Cholesterinstoffwechsel in Gliazellen durch die Beteiligung sowohl der p75NTR- als auch der TrkA-Rezeptoren steuert.

Es ist bekannt, dass die Neurotrophinbindung an Trk-Rezeptoren ERK1/2 aktiviert und so mehrere Wege reguliert, die an der Zelldifferenzierung, -proliferation und -überleben beteiligt sind [2,38]. Interessanterweise wurde beobachtet, dass die ERK1/2-Aktivierung auch die ABCA1- und ApoE-Expression in verschiedenen Zelltypen reguliert [38,42,43]. Diese Ergebnisse legen zusammen mit dem Beweis, dass die BDNF/TrkB/ERK-Achse die ApoE-Extrusion und die ABCA1-Expression in Gliazellen fördert [38], nahe, dass ein Signaltransduktionsweg, an dem die TrkA/ERK-Achse beteiligt ist, einen Teil der von NGF ausgeübten Wirkungen erklären könnte in unserer Studie.

Während beim Neuritenwachstum keine Veränderungen beobachtet wurden, deuteten der Einsatz von U373--konditioniertem Medium und die Etablierung von Co-Kulturexperimenten darauf hin, dass die durch NGF vermittelte erhöhte ApoE-Sekretion aus Gliazellen entscheidend für die Verhinderung der durch Oxidation hervorgerufenen schädlichen Folgen ist Stress in neuronalen Zellen. Um Zytotoxizität zu induzieren, verwendeten wir Rotenon, ein Pestizid, das häufig in der präklinischen Forschung verwendet wird, um aus Mitochondrien stammende reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und anschließende Apoptose zu induzieren [44].

Unsere Ergebnisse zeigen, dass NGF die ApoE-Sekretion durch Gliazellen stimuliert, was notwendig ist, um die neuroprotektiven Wirkungen gegen die Verabreichung von Rotenon in differenzierten N1E-115-Zellen zu gewährleisten. Die Rolle von ApoE bei der Prävention von oxidativem Stress ist gut dokumentiert. Beispielsweise verschlimmert der ApoE-Abbau in Mausmodellen die oxidative Schädigung im Hirngewebe [45,46]. Dementsprechend schützt die Verabreichung von exogenem ApoE vor irreversiblen oxidativen Schäden durch die Behandlung mit Wasserstoffperoxid, indem es der sekundären Glutamat-Toxizität entgegenwirkt [18]. Darüber hinaus sind ApoE-haltige Lipoproteine ​​wirksam bei der Abschwächung der Apoptose, die durch den Entzug der trophischen Unterstützung in Ganglionneuronen der Netzhaut induziert wird [47].

In unserer Studie deutet der Einsatz von Rotenon darauf hin, dass ApoE-vermittelte Neuroprotektion, die durch NGF-stimulierte Gliazellen gefördert wird, im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit relevant sein könnte. Bemerkenswerterweise reproduziert Rotenon eine dopaminerge neuronale Degeneration, die der bei Parkinson beobachteten ähnelt, sowohl in Tiermodellen als auch in Zellkulturen, einschließlich N1E-115--abgeleiteter Neuronen [48–50]. Zusammenfassend stützen unsere Ergebnisse frühere Beweise, die zeigen, dass ApoE bei der Verabreichung von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA), einem weiteren Neurotoxin, das einen PD-ähnlichen Phänotyp induzieren kann, eine Neuroprotektion hervorruft [51]. Insgesamt zeigt unsere Studie, dass NGF ein entscheidender Modulator des Cholesterinstoffwechsels und der ApoE-Extrusion aus Gliazellen ist. Am wichtigsten ist, dass die durch dieses Neurotrophin geförderte Verstärkung der ApoE-Sekretion erforderlich ist, um den Neuroschutz gegen Rotenon-Zytotoxizität sicherzustellen.

BDNF ist das am häufigsten vorkommende Neurotrophin im erwachsenen Gehirn. Trotz dieser Beweise wurde gezeigt, dass NGF nicht nur während der Entwicklung, sondern auch im Zentralnervensystem eines Erwachsenen eine entscheidende Rolle spielen könnte. Beispielsweise beeinflusst NGF die Aktivität des Hippocampus und infolgedessen das räumliche Gedächtnis und Lernen [52]. Andere Ergebnisse deuten darauf hin, dass NGF eine neuroprotektive Wirkung auf nigrostriatale dopaminerge Neuronen hat und dass diese Aktivität die Grundlage für neuartige NGF-basierte Therapieansätze für Parkinson bilden könnte [53].

Dieser Annahme zufolge wurde gezeigt, dass die Produktion von NGF in Astrozyten im Erwachsenenalter stark reguliert wird und modulierende Wirkungen auf Neuroinflammation, Hirnverletzung und Neurodegeneration ausübt [54–56]. In diesem Zusammenhang wäre es interessant, in zukünftigen Studien zu bewerten, ob diese Effekte zumindest teilweise durch die durch NGF geförderte Modulation des Glia-Cholesterins vermittelt werden könnten. Die vorliegende Arbeit weist einige Einschränkungen auf, die in den nächsten experimentellen Untersuchungen überwunden werden sollten; Beispielsweise wäre es wichtig, die molekularen Mechanismen, die die NGF-Behandlung und den Cholesterinstoffwechsel in Gliazellen miteinander verbinden, besser zu analysieren.

Ein umfassendes Verständnis ist nützlich, um spezifische molekulare Ziele zu identifizieren, die einer pharmakologischen Manipulation zugänglich sind und in neurodegenerativen Zusammenhängen eingesetzt werden könnten. Obwohl U373- und N1E-115-Zellen häufig als handhabbare Zelllinien zur Reproduktion astrozytischer bzw. neuronaler Merkmale verwendet werden [27–29,57], sollten diese Ergebnisse in primären Zellkulturen weiter bestätigt werden. Obwohl weitere Anstrengungen unternommen werden sollten, um die Beteiligung der Neurotrophin-Signalübertragung an der Cholesterinhomöostase im Gehirn zu stärken, zeigt diese Arbeit zum ersten Mal, dass NGF möglicherweise indirekt eine Neuroprotektion durch Beeinflussung des Glia-Cholesterinstoffwechsels ausübt.

4. Material und Methoden

4.1. Zellkultur

N1E-115-Neuroblastomzellen und U373-Zellen wurden bei 5 % CO2 in DMEM mit hohem Glukosegehalt (Merck Life Science, Mailand, Italien) und 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) (Merck Life Science) kultiviert , Mailand, Italien) und mit Penicillin/Streptomycin-Lösung versetzt.

Um die neuronale Differenzierung zu induzieren, wurden N1E-115-Zellen bei 30 % Konfluenz ausgesät und 96 Stunden lang auf DMEM mit 0,5 % FBS umgestellt.

Um die neuronale Differenzierung zu induzieren, wurden N1E-115-Zellen bei 30 % Konfluenz ausgesät und 96 Stunden lang auf DMEM mit 0,5 % FBS umgestellt.

Astrozyten-Neuron-Kokulturen wurden gemäß dem von Ioannou und Kollegen beschriebenen Protokoll mit Modifikationen angelegt (59). Zur Sicherstellung der Haftung wurden Paraffin-Abstandshalter auf die Deckgläser gepresst; Wir haben Abstandshalter auf neuronalen Deckgläsern verwendet, um mechanische Schäden wirksam zu verhindern, wenn die Zellen einander zugewandt platziert wurden. Anschließend wurden die Deckgläser in Ethanol sterilisiert und mit Poly-D-Lysin (Merck Life Science, Mailand, Italien) beschichtet. N1E-115 wurden in der gewünschten Dichte auf die beschichteten Deckgläser gesät, und sobald sie für die Co-Kultur bereit waren, wurden die Deckgläser mit N1E{8}}-Neuronen mit einer sterilen Pinzette angehoben und mit der Vorderseite nach unten in { {10}}mit U373-Astrozyten besiedelte Vertiefungen.

Vorbehandlungen an N1E-115-Zellen wurden durch 16-stündige Verabreichung von 0,1 µM Rotenon (Sigma-Aldrich, Mailand, Italien, R8875) durchgeführt. Kontrollzellen erhielten DMSO (Verdünnung 1:1000 in Zellkulturmedium) als Vehikel. U373-Zellen wurden in allen Experimenten 48 Stunden lang mit NGF (Alomone Labs, Jerusalem, Israel, N-245) in einer Dosis von 100 ng/ml behandelt.

4.2. Lysatvorbereitung und Western-Blot-Analyse

U373-Zellen wurden in Probenpuffer (0,1 Tris-HClisHCl mit 10 % SDS, Proteaseinhibitor-Cocktail, pH 6,8) mit Ultraschall behandelt (Arbeitszyklus 2 0 %, Ausgang 3), um ein Gesamtlysat zu erhalten, wie zuvor beschrieben [ 60,61]. Laemmli-Puffer wurde hinzugefügt und die Proben wurden 5 Minuten lang bei 95 °C denaturiert. Proteinextrakte (20 Mikrogramm Proteine) wurden auf SDS-PAGE aufgetrennt und der Transfer auf eine Nitrozellulosemembran erfolgte mithilfe eines Trans-Blot-Turbotransfersystems (Biorad Laboratories, Mailand, Italien), wie bereits berichtet [62].

Anschließend wurde die Membran 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 5 % fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (25 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 27 mM KCl, 0,05 % Tween{ {10}}, pH 6,8) und über Nacht bei 4 ◦C mit den folgenden Primärantikörpern untersucht: Anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-271708, Verdünnung 1:500), Anti- TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-118, Verdünnung 1:500), Anti-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-8984 , Verdünnung 1:1000), Anti-SREBP-2 (Abcam, Cambridge, UK, ab30682, Verdünnung 1:1000), Anti-HMGCR (Abcam, Cambridge, UK, ab242315, Verdünnung 1:1000), Anti-LDLr (Abcam, Cambridge, UK, ab30532, Verdünnung 1:500), Anti-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, USA, NB400-148, Verdünnung 1:3000 ), antiABCA1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-58219, Verdünnung 1:400), anti-ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-53570, Verdünnung 1 :400), Anti-Vinculin (SigmaAldrich, Mailand, Italien, V9264, Verdünnung 1:10.000) und Anti-- -Actin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-47778, Verdünnung 1 :10.000).

Die Membranen wurden nacheinander 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit HRP-konjugierten sekundären Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-Antikörpern (Bio-Rad Laboratories, Mailand, Italien) inkubiert. Proteingebundene Antikörper wurden durch klares ECL-Western-Blotting (Bio-Rad Laboratories, Mailand, Italien, Nr. 1705061) sichtbar gemacht und die Chemilumineszenz wurde über das ChemiDoc MP-System (Bio-Rad Laboratories, Mailand, Italien) registriert. Anschließend wurde eine aus Western Blots abgeleitete densitometrische Analyse unter Verwendung der Windows-Software ImageJ Version 1.52t (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) durchgeführt. Vinculin oder -Actin wurden als Haushaltsproteine ​​verwendet, die als interne Kontrollen für die Proteinbeladung dienten. Densitometrische Berechnungen wurden als willkürliche Einheiten erhalten, die aus dem Verhältnis zwischen der Intensität der Proteinbande und dem jeweiligen Haushaltsprotein abgeleitet wurden.

4.3. Ölrote O-Färbung

U373-Zellen wurden auf mit Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich, P6282-5MG) beschichteten Deckgläsern in 6-Well-Platten ausgesät, und die Ölrot-O-Färbung wurde wie zuvor berichtet durchgeführt (60). Kurz gesagt, die Zellen wurden 10 Minuten lang in Paraformaldehyd (4% ige Lösung) fixiert und dreimal vorsichtig mit PBS gespült. Fixierte Zellen wurden 5 Minuten lang mit 60 % Isopropanol inkubiert und dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 ml Oil Red O-Arbeitslösung (Sigma-Aldrich, O1391-250ML) sondiert, indem die 6-Well-Platte auf einen Orbitalrotatorschüttler gestellt wurde. Nach der Inkubation mit der Färbelösung wurden die Vertiefungen dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, um überschüssiges Färbemittel zu entfernen.

Die Deckgläser wurden schließlich mit Fluoroshield-Eindeckmedium (Sigma-Aldrich, F6182) montiert und die Autofluoreszenz von Oil Red O mittels konfokaler Mikroskopie (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Deutschland) sichtbar gemacht. Die Bilder wurden mit Leica TCS SP8 mit 63-facher Vergrößerung und Leica LAS X Software (Mailand, Italien) aufgenommen. Die Quantifizierung der Ölrot-O-Färbung wurde mit der ImageJ-Software für Windows durchgeführt und als mittlere Fluoreszenzintensität pro Zellfläche berechnet.
4.4. Philippinische Färbung

Die Filipin-Färbung wurde mit dem Filipin-Komplex (Sigma-Aldrich, F9765) durchgeführt. Die philippinische Stammlösung (10 mg/ml in PBS) wurde immer unmittelbar vor der Verwendung hergestellt. Die Zellen wurden 10 Minuten lang in Paraformaldehyd (4% ige Lösung) fixiert und mit PBS gewaschen. U373 wurde dann 1 Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit 1 ml Filipin-Arbeitslösung (0,05 mg/ml in PBS) gefärbt. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und die Deckgläser mit Fluoroshield-Eindeckmedium befestigt und sofort durch konfokale Mikroskopie unter Verwendung eines UV-Filtersatzes (340–380 nm Anregung) analysiert. Die Bilder wurden mit 40-facher Vergrößerung aufgenommen. Die philippinische Quantifizierung wurde mithilfe der ImageJ-Software für Windows als mittlere Fluoreszenzintensität pro Zellfläche berechnet.

4.5. Cholesterinquantifizierung

Die Cholesterinquantifizierung wurde mithilfe eines kolorimetrischen Assays (Cholesterol Quantitation Kit, MAK043, Sigma-Aldrich, Mailand, Italien) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

4.6. ELISA
Die ApoE-Spiegel im Kulturmedium wurden mithilfe des Human Apolipoprotein E ELISA Kit (Abcam, Cambridge, UK, ab108813) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.

4.7. Immunfluoreszenz

Die Immunfluoreszenz von U373-Zellen wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (60). U373 wurden in Paraformaldehyd (4 % in PBS) fixiert und über Nacht mit Primärantikörpern untersucht: Anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-271708, Verdünnung 1:100) und Anti-TrkA ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-118, Verdünnung 1:100). Anschließend wurden die Zellen 1 Stunde lang mit dem Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA, A28180) und mit dem Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) inkubiert , A27034). Zur Visualisierung der Kerne wurde eine DAPI-Färbung durchgeführt, und die Deckgläser wurden schließlich mit einem Fluoroshield-Eindeckmedium fixiert. Die Proben wurden wie oben beschrieben mittels konfokaler Mikroskopie analysiert.

4.8. ApoE-Stummschaltung

Die ApoE-mRNA-Stummschaltung wurde an U373-Zellen unter Verwendung von ApoE-siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-29708) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Transfektion wurde in einer 6-Well-Gewebekulturplatte durchgeführt, in der 100000 Zellen pro Well in antibiotikafreies DMEM-Wachstumsmedium, ergänzt mit 10 % FBS, für 24 Stunden ausgesät wurden. Für jede Vertiefung wurde siRNA-Transfektionsmedium (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-36868) ​​zur siRNA-Transfektionsreaktionslösung gegeben, die unter Verwendung von siRNA-Duplex und siRNA-Transfektionsreagenz (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc29528). Anschließend wurden die Zellen einmal mit siRNA-Transfektionsmedium gewaschen und mit der zuvor hergestellten Transfektionsmischung bedeckt. Anschließend wurde die Kulturplatte 7 Stunden lang bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator inkubiert.

Dem Transfektionsgemisch in jeder Vertiefung wurde DMEM-Wachstumsmedium mit 20 % FBS und Antibiotika (2-fache der normalen Konzentration) im Verhältnis 1:1 zugesetzt. Die Zellen wurden 18 Stunden lang inkubiert, dann wurde das Medium entleert und durch frisches normales Wachstumsmedium ersetzt; 24 Stunden nach diesem letzten Schritt waren die Zellen bereit für weitere Experimente. Die Effizienz der ApoE-Stummschaltung wurde durch RT-qPCR in U373-Zellen und durch ELISA im Zellüberstand bewertet; ApoE-siRNA verhinderte wirksam die ApoE-Induktion durch NGF im Vergleich zu Scramble-siRNA (ApoE-mRNA: 83 % Rückgang; ApoE-ELISA: 78 % Rückgang). Bemerkenswerterweise war die ApoE-Expression nach der siRNA-Stummschaltung niedriger als die basalen Expressionsniveaus, die in der Kontroll-U373 beobachtet wurden (ApoE-mRNA: 72 % Abnahme; ApoE-ELISA: 58 % Abnahme) (Abbildung S 3A, B).

4.9. RNA-Extraktion und Echtzeit-PCR

Die mRNA-Analyse wurde wie zuvor berichtet durchgeführt [22,63]. Kurz gesagt, die Gesamt-RNA aus U373-Zellen wurde mit TRI-Reagenz (Merck Life Science, Mailand, Italien) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Es wurde eine DNAse-Behandlung (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Mailand, Italien) durchgeführt und anschließend die RNA mit einem RNA-Reinigungskit (Zymo, Italien) gereinigt. RNA wurde sukzessive mit einem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Cell Kit (Applied Bio-System, Foster City, CA, USA) revers in cDNA transkribiert und für die qPCR-Analyse verwendet.

Die in der qRT-PCR für ApoE verwendeten Primer waren: vorwärts 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 und rückwärts 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0. Die in der qRT-PCR für Gapdh (ausgewählt als Referenzgen) verwendeten Primer waren: vorwärts 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 und rückwärts 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. Die Produktion des richtigen Amplikons wurde durch die Auswertung der Schmelzkurve beurteilt. Jede biologische Probe wurde dreifach mit SYBR Green IQ-Reagenz (Bio-Rad Laboratories, Mailand, Italien) und unter Verwendung des CFX Connect-Detektionssystems (Bio-Rad Laboratories, Mailand, Italien) untersucht.

4.10. Quantitative Bewertung der neuronalen Morphologie

Die neuronale Morphologie in N1E-115-Zellen wurde durch die Aufnahme von Bildern mit einem Umkehrmikroskop geschätzt. Die morphometrische Analyse wurde mit der ImageJ-Software für Windows durchgeführt und die Anzahl der Gesamtzellen (ausgedrückt als prozentuale Variation der Kontrolle), die durchschnittliche Neuritenlänge (ausgedrückt als Prozentsatz der Kontrolle) und neuritentragende Zellen wurden geschätzt. Für neuritentragende Zellen wurde der Prozentsatz berechnet, indem die Anzahl der differenzierten Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen pro Feld dividiert wurde. N1E-115 waren differenzierte Devas, wenn sie mindestens einen Neurit a hatten, dessen Länge gleich oder größer als der Durchmesser des Somas war. Die morphologische Auswertung erfolgte bei mindestens fünf unabhängigen Experimenten, bei denen mindestens drei Bilder analysiert wurden.

4.11. Statistische Analyse

Alle in dieser Studie präsentierten Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SD (Standardabweichung) ausgedrückt. Die Normalverteilung der Daten wurde mithilfe des Shapiro-Wilk-Tests überprüft. Beim Vergleich zweier Versuchsgruppen wurden ungepaarte Tests angewendet. Bei drei oder mehr Gruppen wurden jedoch ungepaarte Tests angewendet verglichen wurden, wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test verwendet. Bei den Experimenten mit Rotenon, bei denen zwei Variablen vorhanden waren, wurde eine zweifaktorielle ANOVA gefolgt von einem Bonferroni-Posttest verwendet. Werte von p < 0.05 wurden als statistisch unterschiedlich angesehen. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA) für Windows durchgeführt.

Autorenbeiträge:

Konzeptualisierung, MS; Methodik, MS und MC; Validierung, MS und MC; formale Analyse, MS, MC, DP und MP; Untersuchung, MC, NM, LL, MP und DP; Ressourcen, MS und VP; Datenkuration, MS und MC; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, MS und MC; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, MP, LL, DP, NM und VP; Visualisierung, MS, MC und MP; Supervision, MS; Projektverwaltung, MS; Finanzierungseinwerbung, MS Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.

Finanzierung:

Diese Forschung wurde durch den Fonds für Abteilungsforschung 2021 (Universität Molise) für MS und durch die Ausschreibung der Jerome Lejeune Foundation für Zuschüsse, Sitzung 2021a, Nr. 2043 für MS, finanziert

Erklärung des Institutional Review Board:

Unzutreffend.

Einverständniserklärung:

Unzutreffend.

Erklärung zur Datenverfügbarkeit:

Unzutreffend.

Danksagungen:

Wir danken Claudia Tonini für die Hilfe beim Cholesterintest

Interessenskonflikte:

Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Verweise

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