Osteoporose ist ein großes Problem der öffentlichen Gesundheit für die zunehmend alternde Bevölkerung der Welt

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Abstrakt:Osteoporose ist weltweit ein bedeutendes Problem für die öffentliche Gesundheit, wobei postmenopausale Osteoporose aufgrund von Östrogenmangel in etwa 3/4 der Fälle auftritt. In dieser Studie wurden 18 alte Merinoschafe ovariektomiert und 10 waren Kontrollen. Drei der ovariektomierten Mutterschafe wurden 5 Monate lang wöchentlich mit 400 mg Methylprednisolon behandelt und drei wurden 2 Monate lang wöchentlich behandelt, gefolgt von einer 3--monatigen Erholungsphase. Nach 2 Monaten wurden fünf Kontrolltiere und sechs ovarektomierte Tiere eingeschläfert. Nach 5 Monaten wurden alle verbleibenden Mutterschafe eingeschläfert. Nierenproben wurden post mortem für die qPCR-Analyse von NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1Illc, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA und NCX1 entnommen. Ovariektomierte Schafe hatten im Vergleich zu anderen Gruppen eine signifikant höhere VDR-Expression. Ovariektomierte Schafe, die 2 Monate lang mit Glukokortikoiden behandelt wurden, gefolgt von Euthanasie nach 5 Monaten, zeigten signifikante Unterschiede in der TRPV5-, CYP24A1- und Klotho-Genexpression im Vergleich zu anderen Gruppen. Die Unterschiede in der Klotho-Expression waren am deutlichsten nach Anpassung für wiederholte Messungen (p=0,1). Klotho ist als „Anti-Aging“-Hormon bekannt und am Kalzium- und Phosphorstoffwechsel beteiligt. Klotho kann an der Wiederherstellung der Knochenmineraldichte bei ovarektomierten Schafen beteiligt sein, die 2 Monate lang mit Glukokortikoiden behandelt wurden, gefolgt von Euthanasie nach 5 Monaten. Weitere Forschung zur Rolle von Klotho wird empfohlen.

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Schlüsselwörter:Osteoporose; Schaf; Vitamin-D; Phosphatieren; qPCR; Kalziumstoffwechsel; Phosphorstoffwechsel; Klotho

1. Einleitung

Osteoporose ist ein großes Gesundheitsproblem für die zunehmend alternde Weltbevölkerung, das die Vereinigten Staaten von Amerika im Jahr 205 fast 17 Milliarden US-Dollar kostete und bis 2025 voraussichtlich auf 25 Milliarden US-Dollar anwachsen wird [1,2]. Ungefähr 70-75 Prozent der Osteoporose-Belastung ist auf postmenopausale Osteoporose bei Frauen zurückzuführen [1], primäre Osteoporose, bei der Östrogenmangel zu verminderter Knochenbildung und erhöhter Knochenresorption führt, was zu verringerter Knochenmasse und Knochenbrüchigkeit führt [3] . Osteoporose kann auch sekundär zu bestimmten Ursachen, wie z. B. einer Behandlung mit Glukokortikoiden, auftreten. Das Schaf ist ein etabliertes Großtiermodell für verschiedene menschliche Skeletterkrankungen, einschließlich Osteoporose[4]. Einer der Vorteile eines großen Tiermodells wie dem Schaf ist die Fähigkeit, orthopädische Implantate, chirurgische Techniken und Biomaterialien zu testen. [4] Außerdem ist das Schaf relativ kostengünstig, einfach zu handhaben und bietet reichlich Material zum Testen [4,5].

Die häufigsten Osteoporose-Schafmodelle sind die 12 Monate postoperativ ovariektomierten Schafe und die 6--Monate ovariektomierten Schafe mit einer Calcium- und Vitamin-D-Mangeldiät, denen Glucocorticoide verabreicht wurden[4]. Durch die Verwendung einer Kombination bekannter Osteoporose-induzierender Faktoren, einschließlich Ovariektomie, Glukokortikoidbehandlung und einer kalziumarmen Ernährung, konnten wir in nur 5 Monaten ein Schafmodell für Osteoporose etablieren [6,7], wodurch Unterbringung, Arbeit, und Futterkosten, die mit der Modellentwicklung verbunden sind. In diesem Modell wurde festgestellt, dass die Ovarektomie die Serumkonzentrationen von C-terminalen Telopeptiden von Typ-I-Kollagen (CTX-I, ein Knochenresorptionsmarker) und Osteocalcin (Knochenumsatzmarker) im Vergleich zu Kontrollschafen erhöht. Schafe, die 2 Monate lang eine Glucocorticoid-Behandlung erhielten, hatten höhere Serum-CTX-I-Konzentrationen und niedrigere Serum-Osteocalcin-Konzentrationen. Zusätzlich waren die femorale und lumbale Wirbelsäulenknochendichte und die gesamte und trabekuläre volumetrische Knochenmineraldichte der proximalen Tibia niedriger in den experimentell behandelten Gruppen im Vergleich zu den Kontrollgruppen, insbesondere bei ovarektomierten, mit Glucocorticoid behandelten Mutterschafen [6]. Bei ovariektomierten und Glucocorticoid-behandelten Schafen wurde auch ein veränderter Aminosäure- und Lipidstoffwechsel festgestellt [7].cistanche wirkungÄhnliche Veränderungen wurden auch in anderen Schaf-Osteoporose-Modellen gefunden [8].

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Auf Vitamin D ansprechende Gene und das Phosphatierungssystem wurden bisher nicht in ovariektomierten Schafmodellen untersucht. Vitamin D, dessen aktive Form 1,25--Dihydroxyvitamin D ist, führt letztendlich zu erhöhten Konzentrationen von ionisiertem Calcium und Phosphor im Plasma, indem es an das Vitamin-D-Rezeptor(VDR)-Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer bindet und die Expression zahlreicher Vitamine verändert D-responsive Gene, wie Calcium-bindende Proteine ​​(Calbindin D9 und 28k (CalD9k, CalD28k)) und Calciumkanäle (transiente Rezeptorpotential-Kationenkanal-Unterfamilie V, Mitglied 5 und 6 (TRPV5, TRPV6), Plasmamembran-Calcium-ATPase (PMCA) , Natrium-Calcium-Austauscher 1 (NCX1)[9]. Die Produktion von 1,25-Dihydroxyvitamin D ist ein streng regulierter Schritt, wobei die renale lo-Hydroxylase (CYP27B1) die Umwandlung von 25-Hydroxyvitamin D katalysiert zu 1,25-Dihydroxyvitamin D, und das Enzym 24-Hydroxylase (CYP24A1) baut sowohl 25-Hydroxyvitamin D als auch 1,25-Dihydroxyvitamin D in inaktive Nebenprodukte ab.cistanche UKDas Phosphatierungssystem steuert auch die Phosphor- und Calciumkonzentrationen im Plasma[10]. Der Dreh- und Angelpunkt in diesem System ist der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 23, der von Osteozyten im Knochen produziert wird und hauptsächlich die Plasma-Phosphor-Konzentrationen steuert, indem er an den Co-Faktor Klotho bindet, um die Expression von Natrium-Phosphat-Co-Transportern (NPT1, NPT2a, NPT2c) zu verringern. [11]. Aufgrund der miteinander verbundenen Wirkungen von Parathormon und 1,25-Dihydroxy-Vitamin D war die Bestimmung der Wirkung von FGF23 auf den Calciumstoffwechsel eine Herausforderung, aber es gibt Hinweise darauf, dass es die intestinale und renale Resorption von Calcium regulieren kann Kalziumreabsorption[12,13].

Glukokortikoide haben zahlreiche Wirkungen auf den Calcium- und Phosphorstoffwechsel, einschließlich Hemmung der intestinalen Calciumresorption, verringerter renaler tubulärer Calciumresorption und verringerter renaler Phosphorresorption [14-16]. Darüber hinaus hat wenig Forschung die Wirkung von Östrogenmangel auf Vitamin-D-responsive Gene und das Phosphatierungssystem untersucht [17,18].

Dieses ovarektomierte, kalziumarme, mit Glucocorticoid behandelte Schafmodell für Osteoporose bot eine Gelegenheit, vorläufige Informationen über die Wirkungen dieser Behandlungen auf die Expression von auf Phosphatierung und Vitamin D ansprechenden Genen in der Schafsniere zu gewinnen. Die Ziele dieser Studie waren zweifach: (1) festzustellen, ob Ovariektomie oder Ovariektomie und Glukokortikoidbehandlung die Expression von Vitamin D und Phosphatierungs-verwandten Genen in der Niere verändert; (2) Bestimmung der Beziehungen zwischen renalem Vitamin D und Phosphatierungs-verwandten Genen, Serum-Vitamin D und Serum-Knochenumsatzmarker (CTX-I und Osteocalcin).

2. Materialien und Methoden

Ausführliche Methoden zur Entwicklung des ovariektomierten und mit Glucocorticoid behandelten Schafmodells für Osteoporose wurden bereits veröffentlicht [6]. Kurz gesagt, alte Merinoschafe (7-9 Jahre alt, n=28) wurden nach dem Zufallsprinzip in Gruppen eingeteilt: Kontrolle (n=10) ovariektomiert (OVX) (n=12), ovariektomiert und Glukokortikoidbehandlung (40 mg Methylprednisolon durch subkutane Injektion) monatlich für 2 Monate, gefolgt von keiner Behandlung für 3 Monate (n=3) und Glukokortikoidbehandlung (400 mg Methylprednisolon) monatlich für 5 Monate (n=3) .Zitrus-BioflavonoideDie Schafe wurden in einer Scheune gehalten und entweder mit einer Kontrolldiät (115 g/kg Calcium; 2,2 g/Schaf pro Tag) oder einer kalziumarmen (5 g/kg Calcium; 1 g/Schaf pro Tag) Pellet-Konzentrat-Futter aus Schafen gefüttert [19]. Der Erhaltungsbedarf für ein nicht tragendes Mutterschaf beträgt 1,2 g/Schaf pro Tag[19].

Blutproben wurden über Jugularvenenpunktion 2 Monate und 5 Monate nach der Operation entnommen. Osteocalcin wurde mit dem Micro Vue Osteocalcin-Immunoassay-Kit und CTX-I mit dem IDS Serum CrossLaps ELISA-Kit gemessen, wie zuvor berichtet [6]Die Gesamtkalzium- und -phosphorkonzentrationen im Serum wurden mit Spektrophotometrie auf einem AU680 Clinical Chemistry Analyzer (Beckman Coulter, Brea , CA, USA). Die 25--Hydroxyvitamin-D-Serumkonzentration wurde unter Verwendung eines Isotopenverdünnungs-Flüssigkeitschromatogramms und einer Massenspektrometrie im Endolab, Canterbury Health Laboratories, Christchurch, Neuseeland, gemessen.

Nach Monaten wurden 5 Mutterschafe aus der Kontrollgruppe und 6 aus der OVX-Gruppe eingeschläfert und obduziert. Nach 5 Monaten wurden die restlichen Mutterschafe ebenfalls eingeschläfert (Kontrollgruppe n =5, OVX-Gruppe n=6, OVX plus 2m Glukokortikoide n=3 und OVX plus 5m Glukokortikoide n=5 ) und obduziert. Nierenproben wurden innerhalb von 30 Minuten nach dem Tod entnommen und in zwei Teile geteilt, wobei eine Probe in 10 % neutral gepuffertes Formalin gelegt und für die Histologie verarbeitet wurde, und die andere Probe in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verarbeitung von Hämatoxylin bei -80 Grad gelagert wurde Eosin-gefärbte Nierenschnitte wurden vom Hauptautor untersucht und bestätigten das Fehlen signifikanter Läsionen.

Alle experimentellen Verfahren wurden von der Massey University Animal Ethics Committee (Genehmigungsnummer 14/103) genehmigt und gemäß dem Ethikkodex für die Verwendung lebender Tiere zu Forschungszwecken an der Massey University, Palmerston North, Neuseeland, durchgeführt.

RNA-Extraktion und qPCR wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [20,21]. Kurz gesagt wurde Tri-Reagenz (Gigma-Aldrich Inc, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) verwendet, um RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren. Genomische DNA wurde mit Ambion Turbo DNA free (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers entfernt. Die RNA-Konzentration wurde mit einem Qubit 2.0-Fluorometer und einem Qubit-RNA-Breitband-Assay-Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) bestimmt, und die RNA-Qualität wurde durch Bestimmung des 260/280-Verhältnisses und Laufen beurteilt auf einem Agarosegel. Das Transcriptor Erststrang-cDNA-Synthesekit (Roche) wurde verwendet, um cDNA zu synthetisieren. Jede 20-μl-Reaktionsmischung enthielt 600 ng RNA, 2,5 μM Oligo (dT), 8 mM RT-Reaktionspuffer, 1 mM dNTP, 10 U reverse Transkriptase, 20 U RNase-Inhibitor und Rnase-Dnase-freies Wasser. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 55 Grad, 5 Minuten lang bei 85 Grad durchgeführt und dann unter Verwendung eines Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) auf 4 Grad gekühlt. Echtzeit-qPCR wurde unter Verwendung des Echtzeit-PCR-Geräts StepOne Plus (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA) durchgeführt. Jeder PCR-Mix enthielt 5 µl Power SYBR Green PCR-Mastermix (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), Forward- und Reverse-Primer in den in Tabelle S1 aufgeführten Konzentrationen, 10 ng cDNA und wurde dann auf 10 µl aufgefüllt mit RNase, DNase-freiem Wasser. Das PCR-Protokoll bestand aus 95 Grad für 20 s, 40 Zyklen bei 95 Grad für und 60 Grad für und schließlich einer Schmelzkurve von 60 Grad bis 95 Grad mit einer Heizrate von 0,3 Grad/15 s. Wasser und Reaktionsgemisch ohne Reverse Transkriptase wurden als Negativkontrollen in jeden PCR-Lauf eingeschlossen, und alle Proben wurden doppelt gefahren. Die folgenden Gene wurden bewertet: NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1IIC, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA und NCX1. Es wurde zuvor festgestellt, dass PKG1 und SDHA in Schafsnieren stabil exprimiert werden [20], und die Proben wurden relativ zur Expression dieser Gene und der Geneffizienz unter Verwendung der 2-AACt-Methode [22] normalisiert.

Die statistische Analyse wurde mit R Studio 1.3.1093[23] mit der R-Version durchgeführt

4.0.3 und das Tidyverse, nlme 3.1-150 und Gary

2.1.2 Pakete. Lineare Modelle wurden auf die log10-transformierten Genefold-Expressionsdaten angewendet. Im ersten Modell war die Genexpression die Ergebnisvariable, während die Gruppe (Kontrolle oder OVX, aber ohne Glucocorticoid-behandelte Schafe) und die Zeit (euthanasiert bei 2 m oder 5 m) abhängige Variablen waren, wobei ein Interaktionsterm (Gruppe: Zeit) eingeschlossen war. Im zweiten Modell war die Genexpression die Ergebnisvariable, während die Gruppe (Kontrolle, OVX, OVX mit Glukokortikoidbehandlung für 2 m und OVX mit Glukokortikoidbehandlung für 5 m) die abhängige Variable war.Cynomorium-VorteileDa mehrere Ergebnisvariablen (Gene) auf Unterschiede zwischen den Gruppen getestet wurden, wurden p-Werte für multiples Testen unter Verwendung des sequentiellen Holm-Verfahrens angepasst [24]. Serum-Calcium-, Phosphor- und 25--Hydroxyvitamin-D-Konzentrationen wurden in den Genexpressionsmodellen getestet, waren jedoch nicht signifikant und wurden aufgrund des Fehlens signifikanter Unterschiede zwischen den Gruppen entfernt. Zusätzlich wurde eine Hauptkomponentenanalyse verwendet, um zu beurteilen, ob sich die log10-transformierten Gene-Fold-Expressionsdaten je nach Gruppe, Zeitpunkt der Euthanasie oder Serum-25--Hydroxyvitamin-D-Konzentration unterschieden. Spearmans paarweise Korrelation und Scatterplots wurden verwendet, um die Korrelation zwischen log10-transformierten Genfaltenexpressionsdaten und Serumanalyten zu untersuchen.

3. Ergebnisse

3.1. Auswirkung der Ovariektomie, der Zeit seit der Ovariektomie und der Behandlung mit Glukokortikoiden auf die Calcium-, Phosphor- und 25--Hydroxyvitamin-D-Konzentrationen im Serum

Die vollständigen Ergebnisse für die Serumkonzentrationen von Calcium, Phosphor und 25-Hydroxyvitamin D in jeder Gruppe sind in Abbildung 1 dargestellt Gruppe mit ovariektomierter und kalziumarmer Ernährung und die Gruppe ohne ovariektomierte adäquate kalziumhaltige Ernährung sowie die Zeit seit der Ovariektomie von 2 Monaten und 5 Monaten und monatelang mit Glucocorticoiden behandelt, gefolgt von Euthanasie nach 5 Monaten, hatten signifikant niedrigere Serumkalziumkonzentrationen (p =0.0462, adj R20.13) im Vergleich zu 5 Monaten ovariektomierten Patienten mit einer kalziumarmen Diät und 5 Monaten ovarektomierten Patienten eine kalziumarme Ernährung und mit Glucocorticoid behandelte Schafe. Die Untersuchung der Daten legt jedoch nahe, dass dies auf ein hypokalzämisches Tier zurückzuführen sein könnte (1,52 mmol/l, Referenzbereich 2,0-2,7 mmol/l); Entfernung von dieses Tier nahm jede Bedeutung.WüstenhyazintheAlle anderen Schafe hatten Serumkalziumkonzentrationen innerhalb des Referenzbereichs. Es wurden keine Unterschiede in den Serum-Phosphor- oder 25--Hydroxyvitamin-D-Konzentrationen bei 5 Monate alten ovarektomierten und mit Glucocorticoid behandelten Schafen beobachtet.

3.2. Auswirkung der Ovariektomie und der Zeit seit der Ovariektomie auf die Genexpression von Vitamin D und Phosphatonin in der Niere

Die Genexpression von Vitamin D und phosphatierungsbezogenen Genen war nicht mit der Ovariektomie oder der Zeit seit der Ovariektomie verbunden (Abbildung 2). Die Ausnahme war der Vitamin-D-Rezeptor (VDR), wobei die OVX-Gruppe eine signifikant höhere VDR-Expression aufwies (p=0.05, adj R2 0.16); diese Signifikanz verschwand jedoch nach Anpassung für wiederholte Messungen.

3.3. Wirkung von Ovariektomie und Glucocorticoid-Behandlung auf Vitamin D und Phosphatonin-bezogene Genexpression in der Niere 5 Monate nach der Operation

Die vollständigen Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt. Die Expression von PTH1R war bei OVX-Schafen, die 5 Monate lang mit Glucocorticoiden behandelt wurden, signifikant größer als bei den anderen Gruppen (p=0.04, adj R40.18), während TRPV5 (p{ {8}}.01, adj R20.31) und CYP24A1(p=0.005, adj R40.40)-Expression waren bei OVX-Schafen, die 2 Monate lang mit Glukokortikoiden behandelt wurden, im Vergleich zu den anderen Gruppen signifikant größer.

Die Expression von Klotho war zwischen allen Gruppen signifikant unterschiedlich (p =0.01, adj R20.48), mit der niedrigsten Expression bei Kontrollschafen. OVX-Schafe, die 2 Monate lang mit Glukokortikoiden behandelt wurden, hatten die höchste Expression (p =0,002), gefolgt von OVX-Schafen (p=0,008) und dann OVX-Schafe, die 5 Monate lang mit Glukokortikoiden behandelt wurden (p{ {10}}.03). Allerdings unterschied sich die Genexpression bei Berücksichtigung wiederholter Messungen nicht signifikant zwischen diesen Gruppen, wobei Klotho den größten Unterschied bei OVX-Schafen zeigte, die 5 Monate lang mit Glukokortikoiden behandelt wurden (p=0,1).

Ebenso war die Expression des VDR zwischen allen Gruppen signifikant unterschiedlich (p=0.03, adj R20.38). Die größte Expression des VDR war bei OVX-Schafen, die monatelang mit Glukokortikoiden behandelt wurden (p=0,009), gefolgt von OVX-Schafen (p=0,01), dann OVX-Schafen, die 5 Monate lang mit Glukokortikoiden behandelt wurden (p=0.05), und die niedrigste Expression war bei Kontrollschafen vorhanden.

3.4. PCA der gesamten Genexpression zwischen Gruppen

Die PCA-Analyse von OVX, Kontrolle und Euthanasie nach 2 und 5 Monaten konnte die verschiedenen Gruppen nicht trennen (Abbildung S1). PCL und PC2 erklärten 69,6 Prozent der Variation. In ähnlicher Weise gelang es auch der PCA-Analyse von Gruppen, die nach 5 Monaten eingeschläfert wurden, nicht, die verschiedenen Gruppen zu trennen. PCL und PC2 erklärten 53,2 % der Variation (Abbildung S2). Die PCA-Analyse zeigte, dass die Gesamtgenexpression nicht durch Serumkalzium und -phosphor von 25--Hydroxyvitamin-D-Konzentrationen erklärt werden konnte (Abbildung S3).

3.5.Paarweise Korrelation zwischen allen Analyten und Genexpression

Unabhängig vom Status der Ovariektomie, dem Kalziumgehalt der Nahrung, der Zeit seit der Ovariektomie (2 oder 5 Monate) oder dem Glukokortikoid-Behandlungsstatus war die NPT1-Genexpression signifikant und positiv korreliert (S<001) with="" pth1r,="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" trpv5,="" cald9k,="" and="" cald28k="" gene="" expression.="" pth1r="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><001) with="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" npt2a="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" fgfr1wic.="" klotho="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" cyp24a1="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" trpv5="" and="" cald28k.="" trpv6="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cal9dk="" and="" pmca,="" while="" cal9dk="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cald28k="" and="" pmca.="" none="" of="" the="" serum="" analytes="" measured="" (osteocalcin,="" ctx,="" 25ohd,="" ca,="" and="" p)="" were="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" any="" genes.="" the="" full="" pairwise="" correlations="" are="" shown="" in="" figure="">

4. Diskussion

Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die Behandlung ovariektomierter Schafe mit Glukokortikoiden den größten Einfluss auf die Genexpression hatte, während die Ovariektomie selbst und die Zeit seit der Ovariektomie (2 und 5 Monate) wenig Einfluss auf die Genexpression hatten. In einer univariaten Analyse wurden signifikante Unterschiede in der TRPV5-, CYP24A1- und Klotho-Genexpression bei ovariektomierten Schafen, die 2 Monate lang mit Glukokortikoiden behandelt wurden, gefolgt von Euthanasie nach 5 Monaten, und bei PTH1R bei ovariektomierten Schafen, die 5 Monate lang mit Glukokortikoiden behandelt wurden, gesehen. Die Unterschiede waren am ausgeprägtesten in der Klotho-Expression nach Anpassung für wiederholte Messungen.

Die quantitative periphere Computertomographie der proximalen Tibia dieser Schafe zeigte, dass die Ovariektomie die gesamte volumetrische Knochenmineraldichte (vBMD) um 8 Prozent verringerte, die Ovariektomie mit 5-monatiger Glukokortikoidbehandlung um 27 Prozent und die Ovariektomie mit Glukokortikoiden über 2 Monate und Euthanasie nach 5 Monaten um 13 Prozent [6]. Interessanterweise waren die trabekuläre BMD, die trabekuläre Fläche und der trabekuläre Knochenmineralgehalt ähnlich oder höher als bei den Kontrollen bei ovariektomierten Schafen, die 2 Monate lang mit Glukokortikoiden behandelt und nach 5 Monaten eingeschläfert wurden, was auf eine Wiederherstellung der Knochenmasse hindeutet [6]. Glucocorticoide haben mehrere gut dokumentierte Wirkungen auf den Knochen, die zur Entwicklung einer Glucocorticoid-induzierten Osteoporose führen. Diese Wirkungen umfassen die Hemmung der Bildung von Osteoblasten-Vorläuferzellen und Osteoblasten, die Erhöhung der Osteoblasten-Apoptose und die Verringerung der Osteoidproduktion, die alle die Knochenbildung verringern [25,26]. Gleichzeitig erhöhen Glukokortikoide die Knochenresorption, indem sie die OPG-Expression verringern, die RANKL-Expression erhöhen, die Osteoklastenbildung erhöhen, die Osteoklastenapoptose verringern und die Sekretion von Cathepsinen und Matrix-Metalloproteinasen durch Osteoklasten erhöhen [25,26].

Klotho ist ein integraler Bestandteil des Phosphatierungssystems, wodurch es an den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 23 (FGF23) in der Niere bindet. Der Klotho-FGF23-Komplex bindet dann an den FGFR1IIC-Rezeptor, der mehrere zelluläre Wege initiiert und letztendlich zur Hochregulierung der renalen 24--Hydroxylase(CYP24A1)-Expression und zur Herunterregulierung der renalen La-Hydroxylase (CYP27B1) und der renalen Tubuli führt Na/P II-Cotransporter (NPT2a und 2c) [10]. Die erhöhte Expression von Klotho bei Schafen, die 2 Monate lang Glukokortikoide erhielten und dann nach 5 Monaten eingeschläfert wurden (wobei die Unterschiede am ausgeprägtesten waren, nachdem wiederholte Messungen bereinigt wurden), kann die erhöhte CYP241-Expression erklären, die auch bei dieser Gruppe von Schafen beobachtet wurde, obwohl es keine signifikanten Unterschiede gab Serum-25OHD-Konzentrationen.

Klotho ist als das Anti-Aging-Protein bekannt und Klotho-defiziente Mäuse haben eine geringe Knochenbildung und Knochenresorption, was zu einer Osteopenie mit geringem Knochenumsatz führt [27,28]. Darüber hinaus sind spezifische Klotho-Genpolymorphismen mit einer verringerten Knochenmineraldichte beim Menschen verbunden [29,30]. Lösliches Klotho reguliert das Early Growth Response Protein 1 (EGR-1) hoch und induziert die Expression von Knochendifferenzierungsmarkern in Osteoblasten-Zellkulturen [31]Zusätzlich können Glucocorticoide den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 232 unterdrücken]. Vielleicht spiegelt die stärkere Klotho-Expression bei Schafen, die 2 Monate lang Glukokortikoide erhielten und dann nach 5 Monaten eingeschläfert wurden, den Erholungsprozess für dieses Schaf nach der Glukokortikoidbehandlung wider und ist angesichts seiner Rolle bei der Knochenbildung und -resorption möglicherweise ein Schlüsselfaktor für die Knochenerholung und daher möglicherweise ein Behandlungsziel für Osteoporose beim Menschen.

Allerdings wiesen OVX-Schafe im Vergleich zu Kontrollschafen auch erhöhte Klotho-Expressionen auf. In ähnlicher Weise zeigte eine Studie an Mäusen mit Aromatasemangel, dass ein Östrogenmangel die Klotho-Proteinspiegel erhöhte und eine Östradiolbehandlung die Klotho-Expression bei diesen Mäusen verringerte [17]. Bei Mäusen reguliert Östrogen NPT2a in einem Prozess herunter, der von Klotho/FGF23 und PTH unabhängig ist[18]. Dieser Effekt wurde jedoch in dieser vorliegenden Studie bei den ovarektomierten Schafen nicht beobachtet. Ansonsten gibt es wenig Literatur zur Wirkung von Östrogenmangel auf Klotho. Weitere Forschungen sollten die Auswirkungen von Ovariektomie und Glukokortikoiden auf die Klotho-Expression angesichts ihrer Rolle beim Altern und bei chronischen Nierenerkrankungen untersuchen.

TRPV5 ist ein epithelialer Calciumkanal, der hauptsächlich in den distalen gewundenen Tubuli und Verbindungstubuli der Niere exprimiert wird [20,33]. Der TRPV5-Kanal ist konstitutiv offen, erfährt jedoch eine kalziumabhängige Inaktivierung in Verbindung mit Calmodulin, einem kalziumempfindlichen Protein [34]. Die TRPV5-Expression kann durch PTH und 1,25(OH)D3 gesteigert werden [35]. Ein Schaf, das 2 Monate lang Glukokortikoide erhielt und dann nach 5 Monaten eingeschläfert wurde, war hypokalzämisch, und die Serumkalziumkonzentrationen waren bei Schafen in dieser Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen signifikant niedriger. Es ist daher wahrscheinlich, dass die erhöhte TRPV5-Expression ein Ergebnis der verringerten Calciumkonzentration im Serum bei diesen Tieren ist. Es wurde gezeigt, dass Glukokortikoide die intestinale Kalziumabsorption verringern, indem sie die Expression von TRPV6 und CalD9k [36,37] verringern und die Ausscheidung von Kalzium über den Urin erhöhen [14], aber eine klinisch signifikante Hypokalzämie bei gesunden Personen ist ungewöhnlich. In ähnlicher Weise zeigten die Schafe mit niedriger Serumkalziumkonzentration keine klinischen Anzeichen einer hypokalzämischen Tetanie. Alternativ könnte die erhöhte Expression von TRPV5 bei Schafen, die 2 Monate lang Glucocorticoide erhielten und dann nach 5 Monaten eingeschläfert wurden, den Erholungsprozess widerspiegeln, wobei zum Ersatz der wiederhergestellten trabekulären BMD, der Fläche und des Knochenmineralgehalts eine erhöhte Resorption von Calcium aus der Niere erforderlich ist.

Bei Schafen, die 5 Monate lang mit Glukokortikoiden behandelt wurden, war die PTH1R-Expression im Vergleich zu den anderen Gruppen erhöht. Außerdem gab es im Vergleich zu anderen Gruppen nur geringe Unterschiede in der Expression zwischen den Schafen in der Gruppe. Während bei Schafen, die 5 Monate lang mit Glukokortikoiden behandelt wurden, keine Unterschiede in den Serumkalziumkonzentrationen festgestellt wurden, könnte dies möglicherweise mit der erhöhten Wirkung von PTH und seinem Rezeptor in Verbindung gebracht werden. Die Auswirkungen von Glucocorticoiden auf die Sekretion und Wirkung von PTH sind unklar. Einige Studien am Menschen haben gezeigt, dass mit Glucocorticoid behandelte Patienten erhöhte Serum-PTH-Konzentrationen aufweisen, zusammen mit einer verringerten Calciumabsorption, einer erhöhten Calciumausscheidung im Urin und einer verringerten Knochenmasse [38,39]. Die meisten Studien haben jedoch keine Veränderungen der Serum-PTH-Konzentration bei Menschen unter Glucocorticoid-Behandlung gefunden [38,40,41]. Eine Studie hat gezeigt, dass die Auswirkung von Glucocorticoiden möglicherweise auf eine Veränderung der PTH-Sekretion zurückzuführen ist, mit der erhöhten pulsatilen Sekretion von PTH bei mit Glucocorticoid behandelten Personen [4]. Andere haben auch eine erhöhte PTH1R-Expression in mesenchymalen Stammzellen und Osteoblasten-ähnlichen Zellen als Reaktion auf die Behandlung mit Dexamethason gezeigt [43,44]. Daher ist der Anstieg der renalen PTH1R-Expression bei Schafen, die 5 Monate lang mit Glukokortikoiden behandelt wurden, wahrscheinlich auf die 5-monatige Glukokortikoidbehandlung zurückzuführen.

Während die Ovariektomie in Kombination mit einer leicht kalziumarmen Diät zu minimalen Veränderungen der Genexpression führte, schien sie die Expression des VDR zu verändern, wobei ovariektomierte Schafe mit einer leicht kalziumarmen Diät eine größere VDR-Expression im Vergleich zu Kontrollschafen aufwiesen. Dies steht im Gegensatz zu einer Studie an ovariektomierten Ratten, bei denen diejenigen, die mit einer Diät mit normalen Kalziumspiegeln gefüttert wurden, eine erhöhte renale VDR-Expression zeigten, während diejenigen, die mit einer niedrigen Calciumdiät gefüttert wurden, eine verringerte VDR-Expression aufwiesen [45]. Es ist in dieser vorliegenden Schafstudie schwierig, die Wirkung der Ovariektomie auf die renale Expression des VDR von der Wirkung der kalziumarmen Diät zu trennen. Es gab jedoch keine signifikanten Unterschiede in den Serumkalziumkonzentrationen zwischen den Gruppen (mit Ausnahme der Glucocorticoid-Gruppe), was darauf hindeutet, dass die Diät mit leicht niedrigem Kalziumgehalt eine minimale Wirkung hatte und möglicherweise die Wirkungen auf den VDR auf die Ovariektomie zurückzuführen sind. Es bedarf jedoch weiterer Forschung, um diese Zusammenhänge zu untersuchen.

Zwei frühere Studien haben die getrennten Beziehungen zwischen auf Vitamin D ansprechenden Genen und mit Phosphatierung zusammenhängenden Genen in Schafsnieren untersucht [20,21]. Beziehungen zwischen dem Vitamin-D- und dem Phosphatierungsweg wurden jedoch nicht untersucht. Interessanterweise gelten die signifikantesten Korrelationen zwischen Genen, über die in diesen beiden Artikeln berichtet wird, auch für die Genbeziehungen in dieser vorliegenden Schafstudie, was auf eine Konsistenz der Ergebnisse zwischen den Studien und den Beziehungen zwischen diesen Genen hindeutet.Cistanche-Salsa-ExtraktVon den interessanten Beziehungen, die zuvor nicht berichtet wurden, war die Expression von PTH1R, wie man angesichts seiner zentralen Rolle im Kalziumstoffwechsel erwarten könnte, stark mit CalD28k, CalD9k, TRPV5, CYP27B1, CYP24A1, VDR, Klotho und NPT2c korreliert. Die Expression von Klotho war stark mit der Genexpression von TRPV5 korreliert, was mit anderer Literatur übereinstimmt, die zeigt, dass Klotho TRPV5 hochreguliert und die renale Kalziumreabsorption fördert [46,47].

Leider konnten die verschiedenen Gruppen nicht basierend auf der auf Vitamin D ansprechenden und phosphatierenden Genexpression mittels PCA-Analyse getrennt werden. Dies ist wahrscheinlich auf die Haupteinschränkung dieser Studie zurückzuführen – die kleine Stichprobengröße. Mit nur 3-6 Tieren in jeder der Gruppen hat dies wahrscheinlich die Fähigkeit eingeschränkt, Unterschiede in der Genexpression zwischen Gruppen zu erkennen.

5. Schlussfolgerungen

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die deutlichsten Unterschiede in der Genexpression in der renalen Klotho-Expression bei ovarektomierten Schafen auftraten, die 2 Monate lang mit Glucocorticoiden behandelt wurden, gefolgt von einer Erholungsphase von 5 Monaten. Angesichts der Tatsache, dass Klotho das „Anti-Aging“-Hormon ist und eine entscheidende Rolle im Calcium- und Phosphatstoffwechsel spielt, ist es möglich, dass dieses Hormon entscheidend an der Wiederherstellung der trabekulären Knochenmineraldichte und -fläche bei behandelten Schafen beteiligt ist und es daher möglicherweise sein könnte ein Behandlungsziel für Osteoporose beim Menschen. Es sind jedoch weitere Untersuchungen zu den Auswirkungen von Glukokortikoiden und Ovarektomie auf Klotho erforderlich.

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Animals 2022, 12, 67. https://doi.org/10.3390/ani12010067 https://www.mdpi.com/journal/animals