Oxidativer Stress ist einer der wesentlichen Vorläufer verschiedener Stoffwechselerkrankungen Teil 2

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3. Diskussion

Freie Radikale können Proteine, Lipide oder DNA angreifen, um ein Elektron zu erhalten, was zu verschiedenen Gesundheitsproblemen führen kann. Aus diesem Grund ist es wichtig, das antioxidative System des Körpers und die durch Oxidation gebildeten freien Radikale auszugleichen. Bei einer Verschlechterung dieses Gleichgewichts entsteht oxidativer Stress [29]. Oxidativer Stress ist einer der Hauptfaktoren, der zu verschiedenen chronischen Erkrankungen wie Krebs, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Alzheimer usw. führt. Während es im menschlichen Körper selbst antioxidative Systeme gibt, um die oxidativen Schäden an Geweben und Organen zu bekämpfen, diese Abwehr Systeme können ihre Effizienz aufgrund verschiedener Bedingungen wie übermäßigem Alkoholkonsum, Rauchen, Stress, chronischem Drogenkonsum und Strahlung usw. verlieren [30]. Verschiedene wissenschaftliche Berichte haben darauf hingewiesen, dass sekundäre Pflanzenmetabolite eine bedeutende Rolle bei der Verhinderung von oxidativem Stress und seinen schädlichen Auswirkungen spielen [13,14,31]Obwohl die Bioverfügbarkeit ein wichtiger Parameter ist, der die Bioaktivität dieser Verbindungen beeinflusst, wurde sie nicht berücksichtigt die meisten Studien. Es ist jedoch bekannt, dass die sekundären Metaboliten aufgrund unterschiedlicher pH-Bedingungen, enzymatischer Aktivität und Körpertemperatur im Magen-Darm-System Strukturumwandlungen unterliegen. Darüber hinaus sind die chemischen Eigenschaften der Sekundärmetaboliten wie Molekulargewicht, Polarität und Bindungsgrad an Makromoleküle in der Pflanzenmatrix ebenfalls signifikante Faktoren, die ihre Bioverfügbarkeit beeinflussen [13]. Dementsprechend ist die Absorption der Verbindungen oder ihrer Metaboliten in den Blutstrom nach der Einnahme wesentlich, um ihre systemischen physiologischen Wirkungen auszuüben. In-vitro-Verdauungssimulationsmodelle können Anhaltspunkte für die Bewertung der möglichen Bioverfügbarkeitseigenschaften von Stoffen liefern. Während eine Bestätigung in Versuchen am Menschen notwendig ist, um eine funktionelle Eigenschaft zu beanspruchen, werden In-vitro-Simulationsmodelle häufig als Alternativen zu In-vivo-Studien oder Versuchen am Menschen verwendet, die oft ethisch umstritten, ressourcenintensiv, teuer und zeitaufwändig sind [32].

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Mehrere Forscher haben auch das antioxidative Potenzial von Extrakten untersucht, die aus verschiedenen Organen von Cistus-Arten hergestellt wurden. Gemäß der Literaturrecherche ist dies die erste Studie an Cistus-Arten hinsichtlich der Bioverfügbarkeit von phenolischen Substanzen und deren Einfluss auf die antioxidative Aktivität durch Verwendung eines in-vitro-Verdauungssimulationsmodells. Karaset al. [33] schlugen vor, dass 10 Prozent der polyphenolischen Bestandteile unverdaut in der Pflanzenmatrix verbleiben und 90 Prozent davon in der Magen- oder Darmphase verdaut werden (ca. 48 Prozent bzw. 52 Prozent). Wie bereits erwähnt, wurden alle Phenolmengen in wässrigen Extrakten durch das Simulationsverfahren der menschlichen Verdauung in vitro negativ beeinflusst. So wurden in den bioverfügbaren Proben aller Extrakte deutliche Verluste im Phenolgehalt festgestellt. Darüber hinaus lagen die Gesamt-Proanthocyanidin-Konzentrationen der IN-Proben in allen wässrigen Extrakten unter der Nachweisgrenze. Verschiedene Studien weisen auch auf den negativen Einfluss des Verdauungsverfahrens auf phenolische Verbindungen in den Pflanzenextrakten und damit verbundene Bioaktivitäten hin. Zum Beispiel haben wir den Gesamtphenolgehalt von Salvia virgata Jacq gemeldet. wurde auch durch das Verdauungsverfahren in unserer vorherigen Studie negativ beeinflusst. Außerdem nahmen die Mengen der Hauptmetaboliten des Extrakts, dh Rutin und Rosmarinsäure, tendenziell ab [13]. Im Gegensatz dazu haben mehrere Studien widersprüchliche Ergebnisse berichtet. In der Studie von Celeb et al. [34] beobachteten sie die Zunahme der gesamten Phenolsäure-, Flavonoid- und Phenolmengen in den bioverfügbaren Proben des methanolischen Extrakts aus Hypericum perfoliatum L. Tatsächlich hatten die Hauptmetaboliten, Quercitrin, Chlorogen- und Gallussäure, Bioverfügbarkeitsverhältnisse von über 100 Prozent . Diese Studien zeigten, dass die Auswirkungen des Verdauungsverfahrens je nach Pflanzenmaterial variieren können. Um diese Unterschiede zu verdeutlichen, ist es unerlässlich, den Wirkungsmechanismus des Verdauungssystems auf phenolische Substanzen zu betrachten. (Vorteile von Bioflavonoiden) Serra et al.[35] schlugen vor, dass phenolische Verbindungen hauptsächlich in Glykosiden, Polymeren und Esterformen in der Pflanzenmatrix vorkommen und im Verdauungssystem vor der Absorption hydrolysiert werden. Verschiedene Faktoren können die strukturellen Umwandlungen der phenolischen Verbindungen im Gastrointestinaltrakt beeinflussen. Beispielsweise müssen Verbindungen mit höheren Molekulargewichten wie Proanthocyanidine oder Procyanidine vor der Absorption im Darm hydrolysiert werden. Die Struktur der Pflanzenmatrix ist auch ein herausragender Faktor für die Bioverfügbarkeit von Phenolen; (Cistanche kaufen)Phenolverbindungen können an Makromoleküle in der Pflanzenmatrix, wie Fasern, Proteine ​​und Lipidmoleküle, binden. Somit können nur die aus der Matrix freigesetzten phenolischen Komponenten aus dem Gastrointestinaltrakt resorbierbar werden. Darüber hinaus gehören unterschiedliche pH-Werte und enzymatische Aktivitäten der Darmmikrobiota zu den anderen entscheidenden Faktoren, die die Umwandlung in der chemischen Struktur von Phenolverbindungen beeinflussen [36]. Angesichts dieser Daten können wir die Hypothese aufstellen, dass unterschiedliche Ergebnisse aus ähnlichen experimentellen Studien auf die Komplexität des Verdauungssystems und die Zusammensetzung der Pflanzenmatrix zurückzuführen sein könnten. Wie in Tabelle 3 dargestellt, zeigten die bioverfügbaren Proben von Cistus-Extrakten aufgrund ihres geringeren Phenolgehalts eine schwächere antioxidative Aktivität als die unverdauten und postgastrischen Gegenstücke.

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Darüber hinaus zeigten beide Extrakte von C.saluifolius im Vergleich zu anderen Arten eine bessere antioxidative Aktivität in DPPH-, CUPRAC-, FRAP- und TOAC-Assays. Außerdem zeigten beide Extrakte von C. paroifforus eine höhere DMPD-Radikalfängeraktivität als die Extrakte anderer Spezies. Wie in Tabelle 1 angegeben, sind die gesamten Phenole, Flavonoide,cistanche bienfaitsund Phenolsäuregehalte von C. salviifolius waren höher als in den anderen Proben. Somit kann das höhere antioxidative Potenzial der C. salviifolius-Extrakte mit seinem Phenolgehalt zusammenhängen.

Darüber hinaus können die Verringerung der antioxidativen Potenziale, der inhibitorischen Aktivitäten auf kohlenhydratverwandte Enzyme und der AGEs der bioverfügbaren Proben mit der Abnahme der Marker-Flavonoidglykoside zusammenhängen. Cistus-Extrakte enthielten jedoch auch andere phenolische Substanzen, wie in Abbildung 1 angegeben. Daher ist eine detaillierte chromatographische Analyse der Extrakte erforderlich, um den Einfluss der Verdauung auf die biologische Aktivität zu überwachen.

Das Hemmpotential von Pflanzenextrakten auf Verdauungsenzyme hat in letzter Zeit aufgrund der Sicherheitsbedenken bei synthetischen Inhibitoren mehr Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Daher wurde in mehreren Studien die hemmende Wirkung von Pflanzenextrakten ermittelt, die allgemein mit phenolischen Substanzen wie Flavonoiden, Phenolsäuren, Proanthocyanidinen etc. in Verbindung gebracht wurde. Sun et al. [37] schlugen vor, dass polyphenolische Verbindungen ihre hemmende Wirkung entfalten, indem sie mit Hilfe von hydrophoben Kräften und nicht-kovalenten Bindungen an die oben genannten Enzyme binden. Daher hängt die Hemmung der o-Amylase- und a-Glucosidase-Enzymaktivität durch Polyphenole mit ihren molekularen Strukturen zusammen. Obwohl dieser Wechselwirkungsmechanismus mit verschiedenen Techniken wie Inhibitionskinetik, molekularem Docking, Fluoreszenzlöschung usw. untersucht wurde, wurde noch keine sichere Schlussfolgerung gezogen [38]. Zahlreiche Studien haben jedoch berichtet, dass die Hemmung der Verdauungsenzyme der Pflanzenextrakte in direktem Zusammenhang mit ihrem Phenolgehalt steht. Ähnliche Studien zu den enzymhemmenden Aktivitäten von Cistus-Spezies wurden auch früher berichtet. Sayah et al. [39] untersuchten die -Amylase- und -Glucosidase-hemmenden Aktivitäten der 8{{10}}-prozentigen methanolischen und wässrigen Extrakte aus C. monspeliensis und C. saluifolius. Ihre Ergebnisse stimmten mit der vorliegenden Studie überein und zeigten, dass der wässrige Extrakt von C. salvifolius eine höhere o-Glucosidase (ICso ug/mL: 0,95±0,14) und -Amylase (IC5{ {55}} ug/ml:217,1±0,15) inhibitorische Aktivität als der wässrige C.-monspeliensis-Extrakt (IC50 ug/ml∶ 14,58±1,26) bzw. （IC50 4g/ml:886,10±0,10). Die Hemmraten beider wässriger Extrakte auf diese Enzyme waren höher als die der Referenzverbindung Acarbose (ICso ug/ml: 18,01 ± 2.00). Ähnlich wie in unserer Studie fanden sie eine Korrelation mit den Enzymhemmraten und der Gesamtmenge phenolische und flavonoide Mengen. Sowohl der Gesamtphenol- als auch der Gesamtflavonoidgehalt des wässrigen Extrakts von C. saloijfolius (408,43 ± 1,09 mg GAE bzw. 140,00 ± 1,15 RE) waren höher als der des wässrigen Extrakts von C. monspeliensis (261,76 ± 1,9 mg GAE und 78.00±1,15 RE bzw.). Orhanet al. [40] untersuchten auch die Verdauungsenzym-hemmenden Potenziale von 80-prozentigen wässrigen und ethanolischen Extrakten aus den Blättern von C. laurifolius. Ihren Ergebnissen zufolge zeigten 80 Prozent ethanolischer Extrakt (71,7 Prozent ± 0,6) eine starke Amylase-Hemmaktivität im Vergleich zu wässrigem Extrakt (39,3 Prozent ± 2,2) bei einer Konzentration von 1 mg/ml. Sie schlugen vor, dass phenolische Verbindungen, insbesondere Flavonoide, die Insulinsekretion direkt beeinflussen, indem sie die Apoptose von Betazellen verhindern und die antidiabetische Aktivität unterstützen. Diese Hypothese, die mit unseren Ergebnissen korreliert, markiert, dass die ND-Probe von wässrigen Extrakten von C. salviifolius die höchsten Flavonoid- und Phenol-Gesamtgehalte und die größten -Amylase- und o-Glucosidase-Hemmaktivitäten aufwies. Wie in Tabelle 4 angegeben, zeigte der wässrige Extrakt von C. salviifolius bessere Hemmaktivitäten auf Verdauungsenzyme als die anderen Extrakte. Zusätzlich,Cistanche-CholesterinIN-Proben der wässrigen Extrakte enthielten geringere Mengen an Phenol und Flavonoiden als ND-Proben und zeigten daher in der vorliegenden Arbeit geringere enzymhemmende Aktivitäten. Während der Phenolgehalt der Extrakte durch das Verdauungsverfahren negativ beeinflusst wurde, zeigten sie immer noch eine signifikante Hemmwirkung auf Verdauungsenzyme. In mehreren Studien wurde über Flavonoidglykoside als die Hauptmetaboliten von Pflanzenextrakten mit starkem -Amylase- und -Glucosidase-Inhibitorpotential berichtet[41-43]Während der Inhibitormechanismus von Phenolverbindungen auf die Verdauungsenzyme noch nicht aufgeklärt wurde, ist die Struktur- Bei einigen phenolischen Komponenten wie Flavonoiden, Phenolsäuren, Proanthocyanidinen und Tanninen wurden Studien zur Wirkungsbeziehung durchgeführt. Struktur-Wirkungs-Beziehungsstudien über Flavonoide zeigten, dass die C2=C3-Doppelbindung des C-Rings das Verdauungsenzym-Hemmpotential solcher Verbindungen verstärkt. Da diese Bindung die Elektronendichte erhöht, wird die Stärke der Wechselwirkung zwischen Flavonoid und Enzym erhöht [44]. Außerdem fördern Hydroxylgruppen an C-5 und C-7 das -Amylase-hemmende Potenzial von Flavonoiden. Es wurde auch vorgeschlagen, dass die Hydroxylierung des Flavonoid-Skeletts ihr Hemmpotential für die Enzyme a-Amylase und -Glucosidase positiv beeinflusst[45]. Wie bereits erwähnt, waren alle Marker-Flavonoide in der vorliegenden Studie Flavonol-Glykoside, die diese oben beschriebenen strukturellen Anforderungen trugen. Nach dem In-vitro-Verdauungsverfahren nahmen ihre damit verbundenen Aktivitäten jedoch in bioverfügbaren Proben der wässrigen Extrakte signifikant ab.

Im Allgemeinen hängt das hemmende Potenzial der Pflanzenextrakte auf AGEs von mehreren Faktoren ab, dh ihrem Phenolgehalt, antioxidativen Potenzialen, Metallchelatbildungsfähigkeiten, Proteinwechselwirkungen und AGE-Rezeptorblockierungsaktivitäten [13]. Wie in Tabelle 4 dargestellt, zeigten bioverfügbare Proben der wässrigen Extrakte geringere AGE-Hemmaktivitäten im Vergleich zu ND-Proben, da das in vitro-Verdauungsverfahren den Phenolgehalt der Extrakte nachteilig beeinflusste. Nach den aktuellen Studienergebnissen ist die ND-Probe des wässrigen Extrakts von C. (cistanche und tongkat ali reddit) saluifolius besaß die höchste AGE-Hemmaktivität sowie den Gesamtgehalt an Phenolen und Flavonoiden. Im Vergleich dazu zeigte die IN-Probe des wässrigen Extrakts von C. monspeliensis das schwächste AGE-Inhibitionspotential, was auf den niedrigsten Gesamtgehalt an Flavonoiden und Phenolen zurückzuführen ist. Da Flavonoide in Pflanzenextrakten, Obst, Gemüse und Getränken weit verbreitet sind, haben sich mehrere Studien intensiviert mit dem Hemmpotential von Flavonoiden auf AGE-Bildungen. Dieselben Flavonoide, die in dieser Studie als Marker-Phenole zugewiesen wurden, wurden auch in anderen Studien als Markerverbindungen angegeben [46-48].

Ähnlich wie bei der Hemmung von Verdauungsenzymen wurden die AGE-hemmenden Aktivitäten von Flavonoiden durch die C2=-C3-Doppelbindung und die Hydroxylierung der A- und C-Ringe stimuliert. Die Zuckerbindung an das Flavonoidskelett führt jedoch zu einer verringerten inhibitorischen Aktivität [49]. Andererseits haben Cervantes-Lauren et al.[50] legten nahe, dass Flavon-3- von Glykosiden ein größeres AGE-Inhibitionspotential besitzt als die anderen Flavonoidglykoside. Diese Hypothese kann eine Erklärung für die verringerte AGE-Hemmung in bioverfügbaren Proben sein. Beispielsweise wurden Quercitrin und Hyperosid in bioverfügbaren Proben des wässrigen Extrakts von C. monspeliensis nicht nachgewiesen, was der Grund für die geringere Aktivität von IN-Proben von C. monspeliensis im Vergleich zu den Extrakten anderer Arten ist. Obwohl Quercitrin im wässrigen Extrakt von C. saloifolius nicht nachgewiesen wurde, können signifikant höhere Mengen an Hyperosid und Salidrosid die Ursache für seine hohe AGE-Inhibitionsaktivität sein. Im Allgemeinen wurde eine positive Korrelation zwischen den Markerflavonoidgehalten der Proben und ihren inhibitorischen Potentialen auf AGEs beobachtet.

4. Material und Methoden

4.1.Chemikalien

Alle in den Experimenten verwendeten Referenzen, Enzyme und Chemikalien wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) erworben. In den Experimenten wurden Materialien von Analysequalität verwendet.

4.2. Pflanzenproben

Luftteile von C.creticus und C.saloifolius wurden in der letzten Aprilwoche 2018 auf dem Campus der Yeditepe-Universität (Kayisdagi, Istanbul) gesammelt. Luftteile von C.mon-speliensis und C. paroiflorus wurden in der Nähe von Alacant Kutlu Aktas gesammelt Balaji, Cesme, Izmir in der zweiten Maiwoche 2018. Luftteile von C. laurifolius wurden in der ersten Juniwoche 2018 von der Straße Kemer-Doganhisar, Konya, gesammelt. Prof. Dr. Erdem Yesilada authentifizierte Pflanzenmaterialien. Belegexemplare für C. creticus (YEF18013), C. Lauri folium (YEF18017), C. monspeliensis (YEF18015), C. paroiflorus (YEF18016) und C. salvifolius (YEF18014) wurden im Herbarium der Abteilung für Pharmakognosie der Fakultät aufbewahrt der Pharmazie, Yeditepe-Universität, Istanbul, Türkei. 4.3. Extraktionsverfahren

Die wässrige Extraktion wurde gewählt, da sie als Zubereitungstechnik in der traditionellen Medizin weit verbreitet ist. Die grob luftgetrockneten und pulverisierten oberirdischen Teile von Cistus-Arten (100 g) wurden mit heißem destilliertem Wasser (80 Grad, 1,5 l) unter Verwendung einer Schüttelvorrichtung für 15 min extrahiert. Dann wurden wässrige Extrakte durch ein Filterpapier filtriert und unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft. Nachdem das Gefriertrocknungsverfahren abgeschlossen war, wurden die Extrakte zur weiteren Verarbeitung in destilliertem Wasser gelöst (unverdaute Probe: ND) (die Ausbeute an Extrakten: 13,04 % für C.creticus, 15,7 % für C. laurifolus, 12,8 % für C. monspeliensis). 14,94 Prozent für C. parviflorus, 14,74 Prozent für C. salvifolius). 4.4. In-vitro-Methode zur Simulation der menschlichen Verdauung

Das menschliche Verdauungssimulationsmodell wurde in vitro auf Cistus-Proben angewendet, wobei die zuvor von Celeb et al. [34] beschriebene Methode befolgt wurde. Zuerst wurden 1 g NaCl und 1,6 g Pepsin in 500 ml destilliertem Wasser gelöst, um eine simulierte Magenflüssigkeitslösung (SGF) zu erhalten. Später wurde der pH der SGF-Lösung mit HCl (5 M); 17,5 ml dieser Lösung auf 2 eingestellt wurde mit 2,5 ml Pflanzenproben gemischt und diese Mischung für 2 h in das Schüttelwasserbad bei 37 Grad gestellt, um die peristaltischen Bewegungen des Verdauungssystems zu imitieren. Nach 2 h wurden die Proben in ein Eisbad gegeben, um die enzymatischen Reaktionen zu inaktivieren; 2 ml der Proben wurden als "postgastrische" (PG) Probe für weitere Experimente beiseite gelegt. Eine Zellulose-Dialysemembran, die mit einer geeigneten Menge NaHCO 3 (1 M, pH 7) beladen war, wurde in den kalten Probenlösungen angeordnet; somit wurde die gastrointestinale Absorption nachgeahmt. Dann wurden 4,5 ml Gallensäuren/Pankreatin-Lösung mit den Lösungen vereinigt und die Mischung weitere 2 h bei 37 Grad inkubiert. Schließlich wurde die Flüssigkeit innerhalb der Dialysemembran als "bioverfügbare" Probe (IN) erfasst. Nachdem das Verfahren beendet war, wurden alle Proben für weitere Experimente bei -20 Grad aufbewahrt. 4.5. In-vitro-Schätzung des Phenolprofils 4.5.1. Assay des Gesamtphenolgehalts Die spektrophotometrische Bestimmung des Gesamtphenolgehalts der Proben wurde in einer 96--Well-Plattenvorlage gemäß dem zuvor von Barak et al. [32] beschriebenen Verfahren durchgeführt; 75 ul NagCO3 (20 Prozent in H2O). ） wurde zu 20 μL frisch zubereiteter Proben- und Referenzlösungen gegeben. Dann wurden 100 &mgr;l Folin-Ciocalteu-Reagenz mit der Mischung kombiniert. Nach einer 30-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur im Dunkeln wurde die Extinktion bei 690 nm gemessen. Gallussäure wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen, und der Gesamtphenolgehalt wurde als Gallussäureäquivalente (GAE) ausgedrückt. 4.5.2. Assay des Gesamtflavonoidgehalts Die spektrophotometrische Bestimmung des Gesamtflavonoidgehalts der Proben wurde in einer 96--Well-Plattenschablone gemäß dem zuvor erläuterten Verfahren von Bardakci et al. <51>; 150 μl 75-prozentiges Ethanol, 10 μl Aluminiumchlorid und 10 μl 1 M Natriumacetattrihydrat wurden getrennt mit 50 μl Proben- und Referenzlösungen kombiniert. Dann wurden diese Mischungen bei Dunkelkammertemperatur für 30 min inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde die Extinktion bei 405 nm berechnet. Quercetin wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen, und die gesamten Flavonoidgehalte wurden als Quercetin-Äquivalente (QE) dargestellt.

4.5.3.Gesamtgehalt an Phenolsäure

Der Gesamtphenolsäuregehalt der Proben wurde spektrophotometrisch nach dem früher von Barak et al. berichteten Verfahren gemessen. [52]. Zunächst wurden geeignete Mengen an Natriumnitrit und Natriummolybdat in destilliertem Wasser gelöst, um das Arnow-Reagenz zu erhalten. Dann wurde 1 ml der Proben getrennt mit 1 ml Arnow-Reagenz, 1 ml 0,1 M HCl und 1 ml 1 M NaOH kombiniert. Danach wurde das Volumen der Mischung mit destilliertem Wasser auf 10 ml eingestellt und die Extinktion wurde sofort bei 490 nm abgelesen. Kaffeesäure wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Eichkurve zu erhalten, und die Gesamtgehalte an Phenolsäure wurden als Kaffeesäureäquivalente (CAE) angegeben.

4.5.4.Gesamt-Proanthocyanidin-Gehaltsassay

Die spektrophotometrische Bestimmung des gesamten Proanthocyanidingehalts der Proben wurde in einer 96--Well-Plattenvorlage nach dem Verfahren von Barak et al. [11]. Kurz gesagt wurden 25 ul der Probenlösungen mit 150 ul 4-prozentiger Vanillin- bzw. 75 ul HCl-Lösung (32 prozentig) gemischt. Nach 15 min Inkubationszeit bei Dunkelkammertemperatur wurde die Extinktion auf 492 nm eingestellt. Catechinhydrat wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Eichkurve zu erhalten. Als Kontrolllösung wurde Methanol eingesetzt. Der Gesamt-Proanthocyanidingehalt der Proben wurde als Catechin-Äquivalente (CE) angegeben.

4.6. Radikalfänger-Aktivitäts-Assays 4.6.1.DPPH Radikalfänger-Aktivitäts-Assay

Die DPPH-Radikalfängeraktivität der Proben wurde in einer 96-Well-Plattenvorlage nach der von Celeb et al.[53] modifizierten Methode bestimmt. Zunächst wurden 150 μM DPPH-Lösung frisch hergestellt. Dann wurden 200 &mgr;l DPPH-Lösung mit 25 &mgr;l Probenlösungen gemischt. Dann wurde diese Mischung bei Dunkelkammertemperatur für 50 min inkubiert. Die Extinktion wurde bei 540 nm berechnet. Als Referenzlösung wurde butyliertes Hydroxytoluol (BHT) in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt. Methanol wurde als Kontrolllösung verwendet. Die Aktivität der Proben wurde als EC50 angegeben, was der Konzentration entspricht, die 50 % Aktivität zeigt.

4.6.2. DMPD-Radikalfänger-Aktivitätsassay

Die radikalfangende Aktivität von DMPD* (N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin) der Proben wurde in einer 96--Napfplattenmatrize gemäß dem zuvor von Inan et al. [13]. Erstens 10{{10}} mM DMPD plus Lösung, 0,05 M FeCl; 6H2O-Lösung und 0,01 M Acetatpuffer wurden frisch hergestellt. Dann wurden 1 ml DMPD-Lösung, 100 ml Acetatpuffer und 0,2 ml FeCl3-6H2O-Lösung gemischt, und später wurden 15 ul Probenlösungen mit 210 ul dieser Mischung kombiniert. Nach 50 min Inkubationszeit bei Dunkelraumtemperatur wurde die Extinktion bei 492 nm gemessen. Trolox wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu erhalten. Die Konzentrationen der Probenlösungen betrugen 1 mg/ml. DMPD-Radikalfängeraktivitäten der Proben wurden als Trolox-Äquivalente (TE) angegeben. 4.7. Metallreduzierende Aktivitätsassays

4.7.1.Eisen reduzierender Antioxidans-Leistungsassay (FRAP)

Die Bestimmung der FRAP-Aktivität der Proben wurde in einem 96-Well-Platten-Template nach dem früher von Bardakci et al.[54] beschriebenen Verfahren durchgeführt. Zu Beginn des Experiments wurde das FRAP-Reagenz durch Mischen von Acetatpuffer, Eisentripyridyltriazin und FeCl;6H2O-Lösungen gebildet. Danach wurde das FRAP-Reagenz für 30 min in den 37-Grad-Ofen gegeben. Dann wurden 10 ul der Probenlösungen mit 30 ul destilliertem Wasser bzw. 260 ul FRAP-Reagenz kombiniert. Nach 30-minütiger Inkubationszeit bei 37 Grad wurde die Extinktion auf 593 nm eingestellt. Eine Standardkurve wurde erstellt, indem verschiedene Molaritäten von Eisensulfatlösung (0,25-2 mM) verwendet wurden, um die Ergebnisse zu bewerten. BHT wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet. FRAP-Aktivitäten der Proben wurden als mM FeSO4 in 1 g Trockenextrakt dargestellt.

4.7.2.Cupric Reducing Antioxidant Capacity Assay (CUPRAC)

Die CUPRAC-Aktivität der Proben wurde in einer 96-Well-Plattenvorlage nach dem von Celeb et al. modifizierten Verfahren bestimmt. 【31】; 85 μl CuSO4 (10 mM), Neocuprain- und Ammoniumacetatlösungen und 51 μl destilliertes Wasser wurden separat zu 43 μl Probenlösungen gegeben. Nach einer Inkubationszeit (20 min) bei 50 Grad im Wasserbad wurde die Extinktion bei 450 nm gemessen. Ascorbinsäure wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Eichkurve zu erhalten. Die CUPRAC-Aktivitäten der Proben wurden als Ascorbinsäureäquivalente (AAE) dargestellt. 4.8.Gesamt-Antioxidans-Aktivitäts-Assay (TOAC)

Die Bestimmung der antioxidativen Gesamtaktivität der Proben wurde in einer 96-Well-Plattenvorlage nach dem Verfahren von Celeb et al. [55]. Zunächst wurde eine bestimmte Menge Natriumphosphat, Ammoniummolybdattetrahydrat und Schwefelsäure gemischt, um die TOAC-Lösung zu erhalten. Dann wurden 300 &mgr;l TOAC-Lösung zu 30 &mgr;l Probenlösungen hinzugefügt. Nach der Inkubationszeit bei 95 Grad im Wasserbad für 90 min wurde die Extinktion bei 690 nm bestimmt. Ascorbinsäure wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Eichkurve zu erhalten. Die TOAC-Aktivitäten der Proben wurden als Ascorbinsäureäquivalente (AAE) dargestellt. 4.9.Schätzung des Bioverfügbarkeitsindex

Der Bioverfügbarkeitsindex (BAvI) wurde nach der von Inan et al.[13] beschriebenen theoretischen Gleichung berechnet:

BAVI=CIN/CND Der "Bioverfügbarkeitsindex" (BAvI) wurde als das Verhältnis der Anzahl der Phenole in der bioverfügbaren Probe (IN) zu der in der unverdauten Probe (ND) beschrieben. 4.10. Quantifizierung von Marker-Flavonoiden durch HPTLC

Die quantitative Bestimmung der Salidrosid-, Hyperosid- und Quercitrinkonzentrationen in allen Simulationsproben (ND, PG, IN) der wässrigen Extrakte aus Cistus-Arten erfolgte mittels Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPILC) (CAMAG, Muttenz, Schweiz) nach der von Guzelmeric et al. [16]. Hyperosid, Salidrosid und Quercitrin wurden in Konzentrationen von 25,50 und 10{{30}} ug/ml hergestellt, und die Konzentrationen von frisch hergestellten Probenlösungen wurden angepasst 10 mg/ml. Diese Lösungen wurden mit bestimmten Volumina (1-5 μl Standardlösungen und 5 μl Probenlösungen) unter Verwendung von 100-μl-Spritzen auf Normalphasen-Kieselgelplatten mit Glasrücken (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Deutschland) aufgetragen. Hamilton, Bonaduz, Schweiz）. Das Aufbringungsverfahren wurde mit dem Probenapplikator Linomat 5 durchgeführt. Der Entwicklungsprozess wurde in einer automatisierten Entwicklungskammer (ADC 2) und Ethylacetat: Dichlormethan, Essigsäure, Ameisensäure: Wasser (10:25:10) durchgeführt :10:10:10me) wurde als mobile Phase ausgewählt Anschließend wurden die Platten mit Natural Product Reagent (NPR) (1g Diphenylborsäure 2-aminoethylester in 200mL Ethylacetat) im Eintauchgerät (CAMAG) derivatisiert Während Hyperosid und Quercitrin spektrophotometrisch bei 260 nm analysiert wurden, wurde die Menge an Salidrosid mit einem UV-Scanner bei 330 nm gemessen. Die Rf-Werte der Standards wurden als Hyperosid （≈0,35）, Quercitrin （c0,45）, Tilirosid （≈ bestimmt 0,65）. Die Korrelationskoeffizienten (r²) wurden zu gefunden für die Quantifizierung der Markerflavonoide x0,98 sein.

4.11. Inhibitorische Aktivität auf Diabetes-verwandte Enzyme 4.11.1. -Glucosidase-Inhibitoraktivität

-Glucosidase-Inhibitoraktivitäten der unverdauten und bioverfügbaren Proben, die aus den wässrigen Extrakten von Cistus-Spezies erhalten wurden, wurden nach dem zuvor von Balan et al. [56]. Zuerst wurden geeignete Mengen an Mononatriumphosphat und Dinatriumphosphat mit der Beschaffung von 100 mM Phosphatpuffer (pH7) gemischt. ac-Glucosidase-Enzym wurde in Phosphatpuffer gelöst, um die -Glucosidase-Lösung (0,2 U/ml) zu erhalten. Dann wurden 17 0 ul Phosphatpuffer, 20 ul der -Glucosidase-Lösung und 20 ul Probenlösungen kombiniert und in einem 37-Grad-Ofen für 15 min inkubiert. Danach wurden 20 &mgr;l 2,5 mM p-Nitrophenyl- -D-glucopyranosid-Lösung in 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) zu der Mischung gegeben, und eine weitere Inkubationsperiode wurde bei 37 Grad für 15 Minuten durchgeführt. Dann wurden 80 &mgr;l 0,2 M Natriumcarbonatlösung zu der Mischung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen. Als Referenz wurde Quercetin-Lösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der inhibitorischen Aktivität in Konzentrationen von 1 mg/ml und 0,5 mg/ml von ND- und IN-Proben der wässrigen Extrakte von Cistus-Spezies geschätzt.

4.11.2. -Amylase-Inhibitoraktivität

-Amylase-Hemmaktivität von unverdauten und bioverfügbaren Proben, die aus wässrigen Extrakten von Cistus-Arten gewonnen wurden, wurde nach dem zuvor von Balan et al. [56] beschriebenen Verfahren bestimmt. Die spektrophotometrische Bestimmung der a-Amylase-Hemmaktivitäten der Proben wurde unter Verwendung von DNS (3, 5- Dinitrosalicylsäure)-Reagenz durchgeführt. Wie in dem Verfahren angegeben, wird Maltose aus der Umwandlung der Stärke gebildet, und die gelbe Farbe der alkalischen DNS wird aufgrund der aus Stärke hergestellten Maltose in die orange-rote Farbe umgewandelt. So wurde aus der Mischung von Natriumkaliumtartratlösung (gelöst in 2 M NaOH) und einer bestimmten Menge DNS (gelöst in destilliertem Wasser) eine 96 mM DNS-Lösung hergestellt. Dann wurde 2 0 mM Natriumphosphatpuffer mit 6,7 mM NaCl (Co-Faktor des &agr;-Amylase-Enzyms) bei 20 Grad (pH: 6,9) hergestellt. das a-Amylase-Enzym (1 U/ml) und Stärke (10 mg/ml) wurden in diesem Puffer gelöst. Danach wurden 50 &mgr;l Natriumphosphatpuffer und 10 &mgr;l a-Amylase-Enzymlösung mit 20 &mgr;l der Probenlösungen gemischt. Diese Mischung wurde 45 Minuten lang bei 37 Grad inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden 20 &mgr;l der Stärkelösung zu der Mischung hinzugefügt. Eine weitere Inkubationsperiode wurde bei 37 Grad für 45 min gestartet. Das gleiche Verfahren wurde auf die Proben ohne Zugabe einer o-Amylase-Enzymlösung, die als "Probenhintergrund" bezeichnet wird, angewendet. Die Kontrollgruppe wurde mit dem gleichen Verfahren in Abwesenheit von Probenlösungen untersucht. Die Extinktion wurde bei 540 nm gemessen. Acarbose wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der inhibitorischen Aktivität in Konzentrationen von 1 mg/ml und 0,5 mg/ml von ND- und IN-Proben aus wässrigen Extrakten von Cistus-Arten dargestellt. 4.11.3. AGE-Inhibitoraktivität

Die AGE-Inhibitoraktivität von unverdauten und bioverfügbaren Proben aus wässrigen Extrakten von Cistus-Spezies wurde nach dem von Starow-icz et al. [57]. Vor jedem Prozess wurden Konzentrationen von 1 mg/ml und 0,5 mg/ml von ND- und IN-Proben frisch zubereitet. Dann wurde 1 ml einer Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) in einer Konzentration von 10 mg/ml zu 1 ml ND- und IN-Probenlösungen gegeben. Kontrollproben wurden ohne Zugabe von ND- und IN-Probenlösungen hergestellt, und die Blindproben wurden ohne Zugabe von 0,5 M Glucose hergestellt. Anschließend wurden alle vorbereiteten Proben für 40 h in einem Schüttelwasserbad bei 55 Grad inkubiert. Nach Beendigung der Inkubationszeit wurde der Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX Multimode-Mikroplatten-Reader im Anregungsbereich von 370 nm/Emission von 440 nm zur Berechnung der Fluoreszenzintensität verwendet. Quercetin wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet.

5. Schlussfolgerungen

In der vorliegenden Studie wurden die wässrigen Extrakte aller Cistus-Arten, die in der türkischen Flora nachgewiesen wurden, auf ihre phenolischen Profile und ihre antioxidativen und antidiabetischen Potenziale in vitro untersucht. Da Abkochung oder Aufguss die übliche Form in der traditionellen Medizin ist, ist die Verwendung von wässrigen Extrakten zur Aktivitätsbewertung in experimentellen Studien besonders wichtig. Andererseits werden hydrophile Bestandteile im wässrigen Extrakt nach der Einnahme einer Reihe von metabolischen Umwandlungen im Magen-Darm-System unterzogen. Daher sollten für eine korrekte Aktivitätsbewertung traditioneller Formulierungen auch die Aktivitäten der bioverfügbaren Metaboliten untersucht werden.

Dies ist die erste Studie, die die Folgen der Simulationsmethode der menschlichen Verdauung in vitro auf türkische Cistus-Arten untersucht. Darüber hinaus wurde in dieser Studie erstmals das Hemmpotential türkischer Cistus-Arten auf AGEs untersucht. Darüber hinaus wurden Salidrosid, Hyperosid und Quercitrin Marker-Flavonoide zugeordnet, und Änderungen ihrer Konzentrationen wurden im In-vitro-Verdauungsverfahren überwacht. Während der Phenolgehalt und die antidiabetischen und antioxidativen Aktivitäten der Extrakte durch gastrointestinale Verdauungsverfahren negativ beeinflusst wurden, zeigten sie immer noch eine signifikante Bioaktivität. Den Ergebnissen zufolge wurde C. salviifolius-Extrakt als die wirksamste Pflanze in Bezug auf den Phenolgehalt und die antioxidativen und antidiabetischen Aktivitäten identifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass oberirdische Teile türkischer Cistus-Arten einen reichen Phenolgehalt und potenzielle antioxidative und antidiabetische Aktivitäten aufweisen. Während die In-vitro-Verdauungssimulationsmethode zur Bewertung der Bioverfügbarkeit eingesetzt wurde, ahmt sie die im Organismus auftretenden Stoffwechselwege möglicherweise nicht vollständig nach. Daher sind weitere In-vivo- und klinische Studien erforderlich, um die Bioverfügbarkeit der phenolischen Verbindungen und ihren Beitrag zu den berichteten pharmakologischen Wirkungen im Detail zu beurteilen.

Autorenbeiträge:Konzeptualisierung, YI, EC, EY; Methodik, YI, SA, IK, EC formale Analyse, YI, IK.-C., SA; Untersuchung, YI, IK.-C, SA; Ressourcen, YI, IK.SA, EC und EY; Datenpflege, YI, IK-C., SA; Schreiben – YI, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, YI, EC, EY; Visualisierung, YI; Supervision, ECand EYAlle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Finanzierung:Diese Forschung erhielt keine Drittmittel. Erklärung des Institutional Review Board: Entfällt. Einwilligungserklärung: Nicht zutreffend.

Erklärung zur Datenverfügbarkeit:Die in dieser Studie präsentierten Daten sind auf Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.

Interessenskonflikte:Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an.

Probenverfügbarkeit:Proben der Verbindungen sind von den Autoren nicht erhältlich.

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Molecules 2021, 26, 5322. https://doi.org/10.3390/molecules26175322 https://www.mdpi.com/journal/molecules