Teil 1 Antidepressiva-ähnliche Wirkungen von Cistanche Tubulosa-Extrakt auf Ratten mit chronisch unvorhersehbarem Stress durch Wiederherstellung der Homöostase der Darmmikrobiota

Yang Li1, Ying Peng1, Ping Ma1, Hanlin Yang1, Haiyan Xiong1, Mengyue Wang1, Chongsheng Peng1, Pengfei Tu2 und Xiaobo Li1*

1 School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China, 2 State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Peking, China

Immer mehr Beweise zeigen, dass neuropsychiatrische Erkrankungen wie Depressionen über die Darm-Hirn-Achse mit dem Darmmikrobiom verbunden sind.Cistanches Herbaist in der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) für die Behandlung von „Nieren-Yang“-Mangel bekannt und wird in den letzten Jahren zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen eingesetzt. In dieser Studie wurde das durch chronischen unvorhersehbaren Stress (CUS) induzierte Depressionsmodell etabliert, um die Auswirkungen von zu untersuchenCistanche tubulosaExtrakt (CTE) auf Verhaltenstests, Monoamin-Neurotransmitter und neurotrophe Faktoren im Hippocampus und Dickdarm, Zusammensetzung der Darmmikrobiota und Produktion von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs). Darüber hinaus wurde eine Korrelationsanalyse verwendet, um die funktionelle Beziehung zwischen veränderter Darmmikrobiota, veränderten Neurotransmittern und Neurotrophinen im Hippocampus und Dickdarm und gestörter SCFA-Konzentration zu bewerten. CTE verbesserte signifikant depressionsähnliche Verhaltensweisen bei Ratten unter CUS. Die Hirnspiegel von 5-Hydroxytryptamin (5-HT) und die Expression des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors (BDNF) bei CUS-Ratten wurden durch CTE wiederhergestellt. Die relative Häufigkeit der Darmmikrobiota und die Konzentrationen von Acetat und Hexansäure könnten auch durch die CTE-Behandlung moduliert werden. Wir haben ferner gezeigt, dass die Anwendung von CTE bei CUS-Ratten zu einer starken Korrelation zwischen der gestörten Zusammensetzung der Darmmikrobiota, den Hippocampus-Neurotransmitterspiegeln und der Produktion von neuroaktiven Metaboliten SCFAs führte. Insgesamt identifizieren diese Ergebnisse CTE als potenzielle Behandlung für depressive Symptome durch Wiederherstellung der Homöostase der Darmmikrobiota bei Störungen der Mikrobiota-Darm-Hirn-Achse und eröffnen neue Wege auf dem Gebiet der Neuropsychopharmakologie.

Schlüsselwörter: Cistanche tubulosa, Antidepressivum, chronischer unvorhersehbarer Stress, Darmmikrobiota, Mikrobiota-Darm-Gehirn-Achse

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EINLEITUNG

Cistanches Herba(Rou Cong-Rong auf Chinesisch) wird offiziell als der getrocknete saftige Stängel von aufgezeichnetCistanche Deserticola(YC Ma) undCistanche tubulosa(Schrenk) in der Chinesischen Arzneibuchkommission (2015). Es ist eine bekannte traditionelle chinesische Medizin (TCM) zur Behandlung von Niereninsuffizienz, Impotenz, weiblicher Unfruchtbarkeit, krankhaftem Fluor, starker Metrorrhagie,

und senile Verstopfung (Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015). Frühere Studien haben mehrere chemische Hauptbestandteile von aufgedecktCistanches Herba, einschließlich Phenylethanoidglykoside (PhGs), Iridoide und Iridoidglykoside, Lignane, Alditole, Oligosaccharide und Polysaccharide. Pharmakologische Analysen haben gezeigt, dass Cistanches Herba ein breites Spektrum an neuroprotektiven, immunmodulatorischen, entzündungshemmenden und hepatoprotektiven Aktivitäten aufweist (Jiang und Tu, 2009; Fu et al., 2017). PhGs wurden als die wichtigsten aktiven Komponenten von Cistanches Herba angesehen, die verschiedene pharmakologische Aktivitäten besitzen, wie z. B. neuroprotektive, immunmodulatorische, entzündungshemmende, hepatoprotektive, antioxidative usw. (Jiang und Tu, 2009; Fu et al., 2017).Cistanches Herbawurde ursprünglich im Klassiker der Kräutermedizin ("Shennong Bencao Jing" auf Chinesisch), einem bekannten Buch über Heilpflanzen, das zwischen etwa 200 und 250 n. Chr. geschrieben wurde, als "hohes Kraut" aufgezeichnet, das "fünf (Eingeweide) Stämme regulieren kann und sieben (übermäßiges Essen, Wut, Feuchtigkeit, Kälte, Sorge, Wind und Regen und Angst) Beeinträchtigungen“ (Huang, 1982). Heutzutage ist Cistanches Herba weithin als pflanzliches Tonikum bei allgemeiner Schwäche anerkannt (Fu et al., 2017).C. tubulosaGlykosidkapseln (Memoregain®) werden zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit eingesetzt (Guo et al., 2013). Ein dysfunktionales dopaminerges System ist eine der wichtigsten Pathogenese der Monoamin-Hypothese der Depression (Duman et al., 1997; Krishnan und Nestler, 2008). Echinacosid (eines der PhGs) und PhGs ausCistanche-SalsaEs wurde festgestellt, dass sie dopaminerge Neuronen vor Dopamin (DA)-Neurotoxizität schützen, die durch 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) induziert wird, das DA erhöhen kann im Striatum von C57-Mäusen (Tian und Pu, 2005; Geng et al., 2007). Darüber hinaus sind Catalpol und Geniposid zwei repräsentative Iridoide in Cistanches Herba, und es wurde festgestellt, dass sie das durch chronischen unvorhersehbaren Stress (CUS) induzierte depressionsähnliche Verhalten verbessern, indem sie Funktionsstörungen der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA) wiederherstellen, und Catalpol kann die Gehirn- Expression des abgeleiteten neurotrophen Faktors (BDNF) (Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). Darüber hinaus liefert die jüngste Veröffentlichung einen neuen Beweis dafür, dass die Abkochung von Cistanches Herba die Immobilitätszeit im Mausschwanz-Suspendierungstest signifikant verkürzte, was stark darauf hindeutet, dass Cistanches Herba potenziell antidepressivumähnliche Eigenschaften besitzt (WangD. et al., 2017).

Aufgrund ihrer vergleichsweise moderaten Nebenwirkungen findet die Traditionelle Chinesische Medizin als Behandlung von Depressionen zunehmend Beachtung (Sarris et al., 2011; Feng et al., 2016). Verschiedene Arten von TCMs, wie einzelne Verbindungen aus der Rohdroge (Ginsenosid Rb1, Ginsenosid Rg3 und Yuanzhi-1) (Jin et al., 2015; Kang et al., 2017; Wang GL et al., 2017 ), einzelne chinesische medizinische Materialien (Panax-Ginsengwurzel, Acorus tatarinowii-Rhizom und Morinda officinalis) (Dang et al., 2009; Han et al., 2013; Xu et al., 2016) und TCM-Abkochungen (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan und Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010; Su et al., 2011; Su et al., 2014; Yan et al., 2016) wurden eingehend untersucht und gezeigt um depressionsähnliche Symptome umzukehren oder zu lindern. Beispielsweise wurde festgestellt, dass Kai-Xin-San die Symptome von CUS-induzierten depressiven Ratten deutlich lindert, indem es die Menge an Neurotransmittern, neurotrophen Faktoren und ihren entsprechenden Rezeptoren erhöht und die Expression von Synaptotagmin und die dendritische Wirbelsäulendichte fördert (Yan et al ., 2016).

Dennoch stützen sich frühere Studien der TCM auf Ergebnisse in dämpfungsmittelähnlichen Verhaltenstests und konzentrieren sich auf den konventionellen pharmakologischen Wirkungsmechanismus. Der Zusammenhang zwischen der antidepressiven Wirksamkeit von oral verabreichter TCM und der Darmmikrobiota ist nicht gut verstanden. Immer mehr Beweise belegen, dass die Darmmikrobiota eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Gehirnfunktionen spielt, insbesondere bei Depressionen und anderen stressbedingten Störungen (Foster und Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). Beispielsweise führt chronischer Stress zu einer Dysregulation der mikrobiellen Struktur des Rattendarms mit einer Abnahme des Firmicutes/Bacteroides-Verhältnisses und insbesondere zu einer Abnahme der relativen Häufigkeit von Lactobacillus und einer Zunahme von Oscillibacter (Meng et al., 2017). Darüber hinaus verlieh die fäkale Transplantation fehlregulierter Mikrobiota von depressiven Patienten auf keimfreie Mäuse diesen Tieren einen depressionsähnlichen Phänotyp, was darauf hinweist, dass fehlregulierte Darmmikrobiota Verhaltens- und physiologische Symptome von Depressionen und Angstzuständen verursachen (Kelly et al., 2016; Zheng et al ., 2016). In Tierversuchen wurde festgestellt, dass einige Mikrobiota-Modulatoren wie Probiotika und Präbiotika das depressionsähnliche Verhalten bei chronisch gestressten Mäusen verbessern, indem sie die Darmmikrobiota verbessern (Bravo et al., 2011; Bharwani et al., 2017; Burokas et al., 2017 ).

Angesichts des Zusammenhangs zwischen Darmmikrobiota und Krankheitsentwicklung sowie der Plastizität der Struktur der Darmmikrobiota haben wir uns entschieden, die Auswirkungen der Darmmikrobiota auf die Vermittlung von Depressionen zu untersuchen, die unsere Aufmerksamkeit erregt und untersucht wurden (Chang et al., 2017; Xu et al ., 2017). Um dies zu erreichen, wurde eine kombinierte 16S-rRNA-Gensequenzierungs-Meta-Stats-Analyse (White et al., 2009) durchgeführt, um die Zusammensetzung der Darmmikrobiota zu analysieren. In der vorliegenden Studie,C. tubulosawurde ausgewählt, um seine Antidepressiva-ähnlichen Wirkungen zu bewerten, da es im Vergleich zu einem höheren PhG-Spiegel aufweistC. Deserticola. Ein Ratten-CUS-induziertes Depressionsmodell wurde etabliert, um die Auswirkungen von zu untersuchenC. tubulosaExtrakt (CTE, bestehend aus 48,6 Prozent PhGs, 6,9 Prozent Iridoidglykosiden und 2 0,0 Prozent Gesamtsacchariden) auf Verhaltenstests, Monoamin-Neurotransmitter und neurotrophe Faktoren im Hippocampus und Dickdarm, Zusammensetzung der Darmmikrobiota und kurz- Kettenfettsäure (SCFA) Produktion. Darüber hinaus wurde die funktionelle Beziehung zwischen veränderten Darmmikrobiota, veränderten Neurotransmittern und Neurotrophinen sowohl im Hippocampus als auch im Dickdarm und einer gestörten Konzentration von SCFAs untersucht. Die Korrelationsanalyse wurde verwendet, um den Beweis zu untermauern, dass CTE auf die Darmmikrobiota zur Behandlung von Depressionen abzielt, indem die Mikrobiota-Darm-Gehirn-Achse moduliert wird.

Cistanchekann die Immunität stärken

MATERIALEN UND METHODEN

Materialien

Fluoxetin (FLX) wurde von Aladdin Industrial Inc. (Shanghai, China) erworben. 5-Hydroxytryptamin (5-HT), Norepinephrin (NE) und BDNF-ELISA-Kits wurden vom Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) erworben. Acetonitril in HPLC-Qualität wurde von Merck (Darmstadt, Deutschland) gekauft. Entionisiertes Wasser wurde aus destilliertem Wasser unter Verwendung eines Milli-Q-Wasserreinigungssystems (Millipore, Bedford, MA, USA) hergestellt. Alle anderen verwendeten Reagenzien und Chemikalien waren von analytischer Qualität.

Getrocknete Stiele vonC. tubulosawurden im Landkreis Hetian (Xinjiang, China) gesammelt. Die Belegexemplare wurden von Prof. Xiaobo Li authentifiziert und im Herbarium der School of Pharmacy der Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, China) hinterlegt. Das homogene PulverC. tubulosaDie Stiele wurden in 10-fachem 70-prozentigem Ethanol suspendiert und dreimal jeweils 1 Stunde lang bei 100 Grad unter Rückfluss erhitzt. Die Extrakte wurden unter Verwendung von Gaze filtriert, unter Vakuum bei 65 Grad eingedampft und lyophilisiert. Die Probe wurde wieder aufgelöst und dann durch makroporöses Harz D101 getrennt. Nach der Adsorption wurde die mit Wasser eluierte Fraktion verworfen. CTE wurde nach Elution mit 40 Prozent Ethanol erhalten, dann unter Vakuum bei 65 Grad eingedampft und lyophilisiert.

Analyse der chemischen Zusammensetzung von CTE

Der relative Gehalt an PhGs in CTE wurde durch UV-Spektrophotometrie bei 330 nm unter Verwendung von Echinacosid als Standard bestimmt. Der relative Gehalt an Iridoiden und Iridoidglycosiden wurde durch UV-Spektrophotometrie mit der Zweiwellenlängenmethode gemessen, um die spektrale Interferenz von PhGs zu vermeiden (237 nm wurde für die spektroskopische Quantifizierung verwendet, ein isosbestischer Punkt bei 280 nm wurde als Referenzwellenlänge verwendet), Geniposid wurde verwendet als Standard. Der Gesamtkohlenhydratgehalt von CTE wurde durch das kolorimetrische Phenol-Schwefelsäure-Verfahren mit Glucose als Standard bestimmt (Chow und Landhausser, 2004).

Die chemischen Hauptbestandteile von CTE wurden durch UPLC-Q-TOF-MS charakterisiert. Die UPLC-Q-TOF-MS-Analyse wurde auf einem Waters ACQUITY UPLC-System (Waters Corp., Milford, MA, USA) mit einer ACQUITY UPLC BEH C18-Säule (100 mm x 2,1 mm id, 1,7 &mgr;m, Waters Corp., Vereinigte Staaten) durch Gradientenelution unter Verwendung von 0,1 Prozent Ameisensäure, Acetonitril (A) und 0,1 Prozent Ameisensäure in Wasser (B) bei a Flussrate von 0,4 ml/min. Das Gradientenprofil war: 0-5 Min. (A: 5-20 Prozent), 5-7,5 Min. (A: 20-30 Prozent), 7,5-10 Min. ( A: 30-70 Prozent), 10-11 Min. (A: 70-100 Prozent), und für 1,5 Min. gehalten. Der Gradient wurde in 0,5 min auf 5 % zurückgeführt und für 2,5 min für den nächsten Durchlauf gehalten. Das Injektionsvolumen betrug 3 [il. Die Temperatur des Säulenofens wurde auf 35 Grad eingestellt.

Die Massenspektrometrie wurde unter Verwendung eines Massenspektrometers Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, USA) durchgeführt. Die Ionisation wurde im negativen Elektrospray (ESI)-Modus durchgeführt. Die MS-Parameter waren wie folgt: Kapillarspannung 2,0 kV; Konusspannung, 20 V; Quelltemperatur, 12 0 Grad; Desolvationstemperatur, 5 00 Grad; Gasflüsse von Konus und Desolvation, 50 bzw. 1,000 L/h. Für eine genaue Massenmessung wurde Leucin-Enkephalin als Sperrmasse verwendet, um ein [MH]-Ion (m/z 554,2615) zu erzeugen. Ein MSE-Experiment (Mass Spectrometry Elevated Energy) in zwei Scanfunktionen wurde wie folgt durchgeführt: Funktion 1 (niedrige Energie): m/z 50-1, 000, 0,25 s Scanzeit, 0,02 s Verzögerung zwischen den Scans , 6 eV Kollisionsenergie; Funktion 2 (hohe Energie): m/z 50-1,000, 0,25 s Scanzeit, 0,02 s Interscan-Verzögerung, Stoßenergierampe von 20-45 eV. Die Daten wurden unter Verwendung der Software UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, USA) verarbeitet.

Tierversuche

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (200 &mgr;m 20 g) wurden von der Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Peking, China) beschafft und im Laboratory Animal Center der Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, China) untergebracht. Die Tiere wurden in Gruppen bei kontrollierter Raumtemperatur (25 °C 2 Grad, 55 °C 10 Prozent relative Luftfeuchtigkeit) mit einem 12:12 h Hell-Dunkel-Wechsel gehalten. Den Ratten wurde 1 Woche lang freier Zugang zu normalem Laborrattenfutter und Wasser gewährt. Die Tiereinrichtungen und -protokolle wurden von der Tierethikkommission der Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, China) genehmigt.

Nach 1 Woche Akklimatisierung wurden 40 naive Ratten einem 72-stündigen Saccharose-Training und einem Saccharose-Basistest unterzogen. Die Ratten wurden basierend auf ihrer Saccharosepräferenz im Saccharose-Grundlinientest (ergänzende Abbildung S1) in fünf Gruppen (n=8) eingeteilt. Der Kontrollgruppe und der CUS-Gruppe wurde Kochsalzlösung (10 ml/kg) verabreicht. Für die anderen drei Gruppen CTE bei hoher Dosis (CTEH) (400 mg/kg), niedriger Dosis (CTEL) (200 mg/kg) und FLX (10 mg/kg) wurden 1 h vor dem CUS-Eingriff (8:00 bis 9:00 Uhr) über 4 Wochen intragastrisch verabreicht.

Chronischer unvorhersehbarer Stress wurde wie zuvor beschrieben entwickelt (Willner, 1997; Xue et al., 2013), mit Ausnahme der nicht gestressten Kontrollgruppe wurde eine Reihe von Stressoren auf die Ratten angewendet: über Nacht schwache stroboskopische Beleuchtung (120 Blitze/ min), weißes Rauschen (100 dB) für 1 h, Wasserentzug für 24 h, leere Wasserflaschen für 1 h (nach Wasserentzug), Nahrungsentzug für 24 h, Zwangsschwimmen (5 min), körperliche Fixierung ({{11 }} h), verschmutzter Käfig für 24 h (200 ml Wasser in 100 g Sägemehlstreu), Schwanzkneifen (1 min), 45-Grad-Käfigneigung für 24 h, Schock für 30 min und Beleuchtung über Nacht (12 h). Stressoren wurden 4 Wochen lang kontinuierlich und zufällig angewendet, Einzelheiten dazu sind in der Ergänzungstabelle S1 beschrieben. Nahrung und Wasser waren für die nicht gestressten Kontrollratten frei verfügbar, die ungestört in einem anderen Raum blieben, mit Ausnahme der 14-stündigen Entzugsperiode vor jedem Saccharosetest. Eine Ratte starb während des CUS-Verfahrens. Danach wurde ein erzwungener Schwimmtest (FST) durchgeführt

Nach 4 Tagen akuter Verabreichung und nach 28 Tagen Stress wurden Saccharosepräferenztest (SPT) (Tag 29), Freifeldtest (OFT) (Tag 31) und Neuheitsunterdrückungsfütterungstest (NSFT) (Tag 33) durchgeführt. Der Umriss eines Designs für CUS- und Verhaltenstests ist in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt.

Ein erzwungener Schwimmtest wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Porsolt et al., 1978). Das Verfahren bestand aus Vortest- und Testsitzungen unter Verwendung der gleichen Vorrichtung und Bedingungen (Durchmesser 20 cm, Höhe 45 cm, enthaltend 25 cm Wasser bei 26 Grad). Während der Vortestsitzung wurden die Ratten gezwungen, 15 Minuten lang zu schwimmen; 24 h später wurden die Ratten für eine 5-minütige Schwimmtestsitzung in dieselbe Vorrichtung gesetzt. Das Schwimmverhalten im Inneren

5 min wurden mit einer Videokamera beobachtet und die Dauer der Immobilität gemessen und analysiert.

Für SPT wurden Ratten zunächst darauf trainiert, 72 h vor dem SPT 1 Prozent (v/v) Saccharoselösung zu konsumieren. Der Saccharose-Baseline-Test vor dem CUS-Verfahren und der SPT am Ende des CUS wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Xue et al., 2013).

Der Open-Field-Test wurde am Ende des CUS-Verfahrens durchgeführt, die Vorrichtung und Methode waren die gleichen wie zuvor beschrieben (Xue et al., 2013). Ein Videoverfolgungssystem (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.) wurde verwendet, um die zurückgelegte Gesamtstrecke aufzuzeichnen.

Der Neuheits-unterdrückte Fütterungstest wurde wie zuvor beschrieben bewertet (Xue et al., 2013) und die Latenz bis zum Beginn des Fressens innerhalb von 5 Minuten wurde aufgezeichnet und analysiert.

Messung von Neurotransmittern und neurotrophen Faktoren

Nach den Verhaltenstests wurden von jeder Ratte mindestens vier Kotpellets entnommen, in sterile konische Röhrchen gegeben und sofort bei –80 °C für die Analyse der mikrobiellen Gemeinschaft und SCFAs eingefroren. Danach wurden Ratten geopfert; der Hippocampus und der Dickdarm wurden isoliert und sofort gewogen. Gewebeproben wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und zur Lagerung bei –80 °C aufbewahrt. Nach aufeinanderfolgendem Auftauen bei –20 °C und 4 °C wurden die Gewebeproben in Kochsalzlösung homogenisiert und 25 Minuten lang bei 2.500 U/min/4 °C zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde gesammelt und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. Die Spiegel von 5-HT im Hippocampus und Dickdarm, NE im Hippocampus und BDNF im Hippocampus wurden mit kommerziellen ELISA-Kits gemäß den Protokollen des Herstellers bestimmt (Hou et al., 2017).

Cistancheentlasten kannNiereErkrankung

Analyse des Zusammensetzungsprofils von Darmmikrobiota

Die Gesamt-DNA der Darmmikrobiota aus Stuhlproben wurde wie zuvor beschrieben extrahiert (Wei et al., 20{{20}}4). Jede Kotprobe (0,2 g) wurde in 1 ml PBS gemischt und zweimal vollständig homogenisiert, dann 6 min bei 200 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 20 × 20 Prozent PVP versetzt und 6 min bei 300 g zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde dann bei 12 000 g für 6 min zentrifugiert und Zellpellets wurden geerntet. Die Zellpellets wurden mit PBS gewaschen und dann in 300 &mgr;l Lysat I (150 mM NaCl, 100 mM EDTA·Na2·2H2, pH 8,0) resuspendiert. Die Suspension wurde mit 100 µl Lysozymlösung (100 mg/ml) und 20 µl 1-prozentiger RNase gemischt, 30 min bei 37 °C warmgebadet, dann 300 µl Lysat II (100 mM NaCl, 500 mM Tris-Base, pH 8,0) zugegeben. . Die Zellsuspension wurde vorsichtig mit 50 × 20 Prozent SDS gemischt und 5 Minuten lang in Eis gebadet. Die DNA wurde dann durch sequentielle Extraktion mit 1 Prozent PVP, Tris-äquilibriertem Phenol und Chloroform-Isoamylalkohol (Vol/Vol/Vol/Vol, 3,125:25:24:1) und Chloroform-Isoamylalkohol (Vol/Vol, 24 :1) gefolgt von Präzipitation bei –20°C für 2 h mit zwei Volumina Ethanol und 50 [il 3 M NaAc. DNA wurde durch Zentrifugation gesammelt, luftgetrocknet und in 100 ul sterilem deionisiertem Wasser gelöst. Die Nukleinsäurereinheit wurde unter Verwendung eines NanoDrop 2000c-Spektrophotometers (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) getestet. Die gesamte genomische DNA wurde dann einer PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern unterzogen, die für die V3-V4-Regionen des 16S-rRNA-Gens spezifisch sind: Vorwärtsprimer 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') und Rückwärtsprimer 806R (5 '-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'). PCR-Amplikons wurden mit Agencourt AMPure Beads (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA) gereinigt und mit dem PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) quantifiziert. Nach dem einzelnen Quantifizierungsschritt wurden die Amplikons in gleichen Mengen gepoolt, und es wurde eine Pair-End-Sequenzierung mit 2 x 300 bp unter Verwendung der Illumina MiSeq-Plattform mit MiSeq Reagent Kit v3 bei Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, China) durchgeführt. Paired-End-Reads wurden mit der FLASH-Software (Version 1.2.7) zusammengestellt, Rohsequenz-Reads wurden mit der QIIME-Software (Version 1.8.0) qualitätsgetrimmt, um nicht übereinstimmende Barcodes und Sequenzen unterhalb der Längenschwellenwerte zu entfernen. Anschließend wurden die gefilterten Sequenzen unter Verwendung von QIIME mit UCLUST in Operational Taxonomic Units (OTUs) mit einem Schwellenwert von 97 Prozent Sequenzähnlichkeit geclustert. Die Beta-Diversity wurde auf QIIME für die gewichtete UniFrac-Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) durchgeführt. Schließlich wurde die Meta Stats-Software verwendet, um die Unterschiede in der taxonomischen Zusammensetzung der Darmmikroben zwischen verschiedenen Gruppen zu vergleichen.

Konzentrationsanalyse von SCFAs

Die Konzentration von SCFAs (einschließlich Acetat, Propionat, Butyrat, Isobutyrat, Valeriansäure, Isovaleriansäure und Hexansäure) in Kotproben von Ratten wurde mit einem angepassten GC{{0}}-Gaschromatographen (Shimadzu, Japan) bestimmt mit einer DB-FFAP-Säule (30 mx 0,25 mm x {{10}},25 cm, Agilent, USA). Standardlösungen von Acetat, Propionat, Butyrat, Isobutyrat, Valeriansäure, Isovaleriansäure und Hexansäure wurden hergestellt bei1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0.01 bzw. 0,005 mg/ml mit Ether (einschließlich 2- Methylvaleriansäure 0,1 mg/ml als interner Standard). Jede Kotprobe (0,2 g) wurde in 0,8 ml deionisiertem Wasser durch Verwirbeln und Zentrifugieren bei 5, 000 U/min für 20 min bei 4°C gemischt, 450 ul des Überstands wurden mit 50 ul 50-prozentiger H2SO4 und 500 ul internem Standard hinzugefügt Lösung, Vortexen für 1 Minute und Zentrifugieren bei 12, 000 U/min für 10 Minuten, dann wurde die Mischung in 4°C für 30 Minuten gestellt. Der Überstand wurde zur GC-Analyse genommen. Die Analyse von SCFAs wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Wang et al., 2016).

Statistische Analyse

Alle Daten wurden als Mittelwerte 土 SEM dargestellt. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung der Software SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) mit einer einfachen ANOVA, gefolgt von Dunnett-Test oder Student-t-Test, durchgeführt. Daten wurden von Analysen ausgeschlossen, wenn sie größer als zwei Standardabweichungen vom Mittelwert waren. Werte von p < 0,05="" wurden="" als="" statistisch="" signifikant="" betrachtet.="" pearsons="" korrelationsanalyse="" wurde="" verwendet,="" um="" den="" zusammenhang="" zwischen="" der="" relativen="" häufigkeit="" von="" darmmikrobiota,="" scfas,="" hippocampus-5-ht-,="" ne-="" und="" bdnf-spiegeln="" und="" kolon-5-ht="" zu="">

Cistanchekann die Immunität stärken und den Blutdruck senken

ERGEBNISSE

Analyse der chemischen Zusammensetzung von CTE

Die chemische Zusammensetzung von CTE wurde zunächst umfassend analysiert. Wie in Tabelle 1 gezeigt, waren PhGs die Hauptkomponente von CTE mit einem relativen Gehalt von 48,6 Prozent, Iridoide und Iridoidglykoside machten 6,9 Prozent aus und Gesamtsaccharide machten 20,0 Prozent aus. Diese

Komponenten von CTE wurden dann unter Verwendung von UPLC-Q-TOF-MS charakterisiert. Insgesamt wurden 27 Bestandteile nachgewiesen und identifiziert, darunter 20 Bestandteile von PhGs, fünf Iridoide und Iridoidglykoside und zwei Oligosaccharide. Detaillierte Informationen, einschließlich Retentionszeit, genauer MS und MS/MS-Fragmentionen, sind in den Hintergrundinformationen (Ergänzungstabelle S2) aufgeführt. Das UPLC-Q-TOF-MS-Gesamtionenchromatogramm (TIC) von CTE ist in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt.

CTE verbesserte das depressive Verhalten bei CUS-Ratten

Bei CUS-Ratten wurden die Gesamtimmobilitätszeit in der FST und die Latenz zum Essen in der NSFT durch die CTE-Behandlung signifikant verringert, und die Saccharose-Präferenz in der SPT und die zurückgelegte Gesamtstrecke in der OFT waren erhöht.

1A veranschaulicht die akuten Wirkungen von CTE auf die Immobilitätszeit bei FST in CUS-Ratten. Verglichen mit der CUS-Modellgruppe reduzierte die akute orale Verabreichung von CTE am 3- Tag die gesamte Immobilitätszeit bei FST signifikant [Einweg-ANOVA, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. Weitere Post-hoc-Analysen ergaben diese Verwaltung

TABELLE 1|Chemische Zusammensetzung des C. tubulosa-Extrakts. Der CTE bei der Hochdosisgruppe (Dunnett-Test, p < 0.05)="" und="" der="" niedrigdosisgruppe="" (dunnett-test,="" p="">< 0,05)="" zeigte="" eine="" deutliche="" verringerung="" der="" die="" gesamte="" immobilitätszeit="" im="">

Die Auswirkungen von CTE auf die Saccharosepräferenz bei SPT bei CUS-Ratten sind in Abbildung 1B dargestellt. Ein achtundzwanzigtägiges Stressverfahren verursachte eine signifikante Abnahme der Saccharose-Präferenz in der CUS-Modellgruppe im Vergleich zu den nicht-gestressten Kontrollratten [Einweg-ANOVA, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}}09; Dunnett-Test, p < 0,05],="" was="" anzeigt,="" dass="" das="" cus-modell="" erfolgreich="" entwickelt="" wurde.="" als="" positive="" kontrolle="" erhöhte="" die="" flx-gruppe="" signifikant="" die="" saccharose-präferenz="" bei="" cus-ratten="" [einweg-anova,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" dunnett-test,="" p="">< 0,05],="" was="" die="" vorhersagevalidität="" des="" cus-modells="" demonstriert.="" chronische="" orale="" gabe="" von="" cte="" in="" der="" hochdosisgruppe="" zeigte="" schlüsselwirkungen="" auf="" die="" saccharosepräferenz="" [einweg-anova,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" dunnett-test,="" p="">< 0,01],="" der="" es="" bei="" cus-ratten="" auf="" normale="" werte="" zurückführte.="" der="" cte="" zeigte="" bei="" der="" niedrigdosisgruppe="" einen="" steigenden="" trend,="" aber="" die="" wirkung="" war="" statistisch="" nicht="" signifikant="" (dunnett-test,="" p="">

Wie in Abbildung 1C gezeigt, wurde die in OFT zurückgelegte Gesamtstrecke auch verwendet, um die Auswirkungen von CTE auf CUS-Ratten zu bewerten. Verglichen mit Ratten ohne Stress zeigte die CUS-Modellgruppe eine viel kürzere Gesamtdistanz [einfache ANOVA, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}}01; Dunnett-Test, p < 0,001]="" nach="" einer="" 4--wöchigen="" exposition="" gegenüber="" cus,="" und="" die="" flx-behandlung="" der="" positivkontrolle="" erhöhte="" die="" gesamtdistanz="" bei="" cus-ratten="" [einweg-anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001;" dunnett-test,="" p="">< 0,05].="" die="" tägliche="" orale="" verabreichung="" von="" cte="" mit="" hoher="" und="" niedriger="" dosis="" zeigte="" eine="" deutliche="" wirkung="" auf="" die="" gesamtstrecke="" bei="" cus-ratten="" [einweg-anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" dunnett-test,="" p="">< 0,01="" für="" die="" gruppe="" mit="" hoher="" dosis,="" p="">< 0,001="" für="" die="" gruppe="" mit="" niedriger="" dosis].="" die="" ergänzende="" abbildung="" s4="" zeigt="" die="" aktivitätsspurkarte="" in="">

Abbildung 1D zeigt die Auswirkungen von CTE auf die Latenz bis zum Fressen in der NSFT bei CUS-Ratten. Das 28-tägige Stressverfahren verursachte in der CUS-Modellgruppe im Vergleich zu den nicht gestressten Kontrollratten eine signifikante Zunahme der Latenz bis zum Beginn des Fressens [einfache ANOVA, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{{10}}19; Dunnett-Test, p < 0,05],="" was="" anzeigt,="" dass="" das="" cus-modell="" erfolgreich="" entwickelt="" wurde.="" die="" langfristige="" orale="" verabreichung="" von="" cte="" mit="" einer="" hohen="" dosis="" zeigte="" im="" vergleich="" zur="" cus-gruppe="" deutliche="" auswirkungen="" auf="" die="" latenz="" bis="" zum="" beginn="" des="" essens="" (student's="" t-test,="" t="2.759," p="">< 0,05),="" während="" sich="" eine="" niedrige="" cte-dosis="" zeigte="" kein="">

CTE stellte den Spiegel an Neurotransmittern und neurotrophen Faktoren bei CUS-Ratten wieder her

Die Auswirkungen von CTE auf die {{{{10}}}}}HT- und NE-Spiegel im Hippocampus von CUS-Ratten sind in den Abbildungen 2A,B dargestellt. Ein vierwöchiges Belastungsverfahren verursachte eine signifikante Reduktion von 5-HT [einfache ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0001; Dunnett-Test, p < 0,001]="" und="" ne="" [einfache="" anova,="" f(4,34)="6,376," p="0,0006;" dunnett-test,="" p="">< 0,001]-konzentration="" im="" hippocampus="" von="" cus-ratten="" im="" vergleich="" zur="" kontrollgruppe,="" und="" das="" antidepressivum="" flx="" stellte="" die="" 5-ht-spiegel="" im="" hippocampus="" signifikant="" wieder="" her="" [einfache="" anova,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" p="0.0001;" dunnett-test,="" p="">< 0,001].="" nach="" oraler="" verabreichung="" von="" cte="" in="" der="" hochdosisgruppe="" wurde="" ein="" signifikanter="" anstieg="" des="" 5-ht-spiegels="" beobachtet="">

ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0001; Dunnett-Test, p < 0,001],="" während="" die="" ne-konzentrationen="" nicht="" verändert="" wurden.="" in="" ähnlicher="" weise="" war="" die="" bdnf-expression="" in="" der="" cus-modellgruppe="" im="" vergleich="" zu="" den="" nicht="" gestressten="" ratten="" signifikant="" reduziert="" (student's="" t-test,="" t="4.171," p="">< 0,01)="" (abbildung="" 2c).="" sowohl="" langfristige="" orale="" verabreichung="" von="" cte="" mit="" hoher="" dosis="" (student's="" t-test,="" t="2.548," p="">< 0,05)="" als="" auch="" flx="" (student's="" t-test,="" t="2.263," p="">< 0,05="" )="" erhöhte="" bdnf-expression="" im="" vergleich="" zur="" cus-modellgruppe.="" cte="" mit="" niedriger="" dosis="" zeigte="" keine="" signifikante="" wirkung="" auf="" die="">

Der {{0}}HT-Spiegel im Dickdarm von CUS-Ratten unterschied sich von dem im Hippocampus, und das 4-wöchige Belastungsverfahren hatte keinen Einfluss auf den 5-HT des Dickdarms (Abbildung 2D ). Umgekehrt stimulierte die orale Verabreichung von CTE mit hoher Dosis die 5-HT-Spiegel im Dickdarm im Vergleich zur CUS-Modellgruppe (Student's t-Test, t=2.173, p < 0,05).="" cte="" mit="" einer="" niedrigen="" dosis="" zeigte="" keine="" wirkung="" auf="" den="" 5-ht-spiegel="" im="">

CTE regulierte die mikrobielle Zusammensetzung des Darms von CUS-Ratten

Die Wirkung von CTE auf die mikrobielle Darmzusammensetzung von CUS-Ratten wurde durch die auf 16S-rRNA-Gensequenzierung basierende Methode bewertet. Es wurde festgestellt, dass die 28-tägige orale Verabreichung von CTE die mikrobielle Zusammensetzung des Darms von CUS-Ratten veränderte und verschiedene Auswirkungen hatte

mikrobielle taxonomische Ebenen unter Rattengruppen (Klassenebene 1, Ordnungsebene 1, Familienebene 1, Gattungsebene 8 und Artenebene 2). Dies deutet darauf hin, dass die mikrobiologische Gemeinschaft des Darms eine Rolle bei den antidepressiven Wirkungen von CTE spielen könnte. Detaillierte Informationen zu signifikant veränderten Darmmikroben-Taxa auf verschiedenen taxonomischen Ebenen sind in Tabelle 2 dargestellt.

Die MiSeq-Sequenzierung ergab insgesamt 2.132.980 Raw-Reads nach Qualitätskontrolle, Denoising und Chimären-Entfernungsprozess. Als nächstes wurden die Reads in OTUs geclustert, die den Taxa vom Phylum bis zur Artebene zugeordnet wurden. Die Studie der Beta-Diversitätsanalyse wurde durchgeführt, um die Ähnlichkeit der Bakteriengemeinschaftsmuster zwischen den fünf Rattengruppen zu untersuchen. PCoA basierend auf gewichteten UniFrac-Abständen von Darmmikrobiota aus den fünf Rattengruppen der Studie ist in Abbildung 3Adargestellt. Die Beta-Diversitätsanalyse durch PCoA zeigte eine klare Trennung der mikrobiellen Gemeinschaft von der Kontrollgruppe und der CUS-Modellgruppe, während der CTE mit der Gruppe mit hoher Dosis im Vergleich zur CUS-Gruppe tendenziell näher an der Kontrollgruppe lag.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 Prozent . Wie in den ergänzenden Abbildungen S5A, B gezeigt, verursachte das 4-wöchige Stressverfahren einen nicht signifikanten Trend zu einem erhöhten Firmicutes-Spiegel und einen nicht signifikanten Rückgang von Bacteroidetes in der CUS-Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Nach täglicher Verabreichung von CTE mit hoher und niedriger Dosis kehrte die relative Häufigkeit von Firmicutes und Bacteroidetes auf ähnliche Werte wie in der Kontrollgruppe zurück, jedoch ohne statistische Signifikanz. Und obwohl ähnliche Veränderungen für das Firmicutes/Bacteroides-Verhältnis bei den Rattengruppen beobachtet wurden, wurden keine statistischen Unterschiede gezeigt (ergänzende Abbildung S5C). In der CUS-Modellgruppe wurde im Vergleich zu den nicht gestressten Kontrollratten ein nicht signifikanter Trend zu einem verringerten Gehalt an Cyanobakterienstämmen gefunden; während die Verabreichung von CTE mit einer hohen Dosis zu einer signifikanten Zunahme der relativen Häufigkeit von Cyanobakterien im Vergleich zur CUS-Gruppe führte (ergänzende Abbildung S5D).

Auf Gattungsebene waren Bacteroides und Ruminococcus zwei der am häufigsten vorkommenden mikrobiellen Taxa, die in allen fünf Rattengruppen etwa 30 Prozent der relativen Häufigkeit ausmachten. Das vierwöchige Stressverfahren verursachte eine signifikante Verringerung der relativen Häufigkeit von Bacteroides und eine signifikante Zunahme von Ruminococcus in der CUS-Modellgruppe im Vergleich zu den nicht gestressten Kontrollratten (Abbildungen 4A, B). Die langfristige Verabreichung von CTE führte zu einer signifikanten Zunahme der Abundanz von Bacteroides sowie zu einer signifikanten Abnahme von Ruminococcus im Vergleich zu den CUS-Ratten. Zusätzlich zeigten sechs Gattungen von Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus und Brachybacterium statistisch signifikante Unterschiede zwischen der CUS-Modellgruppe und der Kontrollgruppe (Abbildungen 4C-H). Nach 28-tägiger CTE-Behandlung war die relative Häufigkeit der oben genannten sechs Gattungen jeweils auf Werte ähnlich der Kontrollgruppe verändert.

Eine geringe Häufigkeit von Deinococcus auf verschiedenen taxonomischen Ebenen, einschließlich Klassenebene (Deinococci), Ordnungsebene (Deinococcales), Familienebene (Deinococcaceae) und Gattungsebene (Deinococcus), wurde in der CUS-Rattengruppe nachgewiesen, während es in der Kontrolle nicht nachgewiesen wurde Gruppe und die Verabreichungsgruppen (Figuren 5A-D).

Auf Artenebene war Weissella beninensis in der CUS-Gruppe viel geringer als in der Kontrollgruppe, und nach Verabreichung von CTE mit einer hohen Dosis wurde eine signifikante Zunahme der relativen Häufigkeit beobachtet (Abbildung 5E). Umgekehrt kehrte die CTE-Verabreichung den signifikanten Anstieg der relativen Häufigkeit des Brachybacterium-Konglomerats um, der bei den CUS-Ratten beobachtet wurde (Fig. 5F).

CTE-modulierte SCFAs in CUS-Ratten

Die SCFA-Konzentrationen (einschließlich Acetat, Propionat, Butyrat, Isobutyrat, Valeriansäure, Isovaleriansäure und Hexansäure) in Kotproben von Ratten wurden mittels GC analysiert und sind in Abbildung 6 dargestellt. Die Acetatkonzentrationen [Einweg-ANOVA, F( 4,32)=2.721, p=0.0467; Dunnett-Test, p < 0.05]="" und="" hexansäure="" [einfache="" anova,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" dunnett-test,="" p="">< 0,05]="" waren="" bei="" den="" ratten="" der="" cus-modellgruppe="" im="" vergleich="" zur="" kontrollgruppe="" signifikant="" erhöht.="" nach="" langzeitgabe="" von="" cte="" mit="" hoher="" dosis,="" acetat="" (student's="" t-test,="" t="2,182," p="">< 0,05)="" und="" hexansäure="" [einweg-anova,="" f(4,30)="3" 0,028,="" p="0" 0,0328;="" dunnett-test,="" p="">< 0,05]="" konzentrationen="" waren="" im="" vergleich="" zur="" cus-gruppe="" überwiegend="" verringert,="" was="" darauf="" hindeutet,="" dass="" cte="" seine="" antidepressive="" aktivität="" über="" die="" modulation="" der="" gestörten="" neuroaktiven="" metaboliten="" scfas="" ausüben="" könnte.="" die="" verabreichung="" von="" cte="" in="" der="" niedrigdosisgruppe="" zeigte="" einen="" abnehmenden="" trend,="" aber="" keine="" bemerkenswerte="" wirkung="" auf="" die="" acetat-="" und="">

Korrelationsanalyse der Darmmikrobiota, Neurotransmitter und Neurotrophine im Hippocampus, 5-HT im Dickdarm und SCFAs

Um die funktionelle Beziehung zwischen veränderter Darmmikrobiota auf Gattungsebene, veränderten Neurotransmittern und Neurotrophinen im Hippocampus und Dickdarm und der störenden Konzentration von SCFAs zu untersuchen, wurden Korrelationskoeffizienten nach Pearson entwickelt (Meng et al., 2017). Korrelationen zwischen ihnen (r > 0,4 oder r < -0,4,="" p="">< 0,05)="" sind="" in="" abbildung="" 7="" dargestellt.="" die="" koeffizienten="" zeigten="" starke="" korrelationen="" zwischen="" der="" veränderten="" zusammensetzung="" der="" darmmikrobiota="" auf="" gattungsebene,="" der="" konzentration="" von="" sieben="" scfa-typen="" und="" depressions-bezogenen="" monoamin-neurotransmittern="" (5-ht="" und="" ne).="" die="" häufigkeit="" von="" ruminococcus="" zeigte="" eine="" signifikante="" negative="" korrelation="" mit="" einer="" 5-ht-konzentration="" im="" hippocampus,="" was="" bedeutet,="" dass="" das="" cus-verfahren="" zu="" einer="" erhöhung="" der="" relativen="" häufigkeit="" von="" ruminococcus="" und="" einer="" verringerung="" der="" 5-ht-konzentrationen="" führt.="" nach="" der="" behandlung="" mit="" cte="" wurde="" die="" relative="" häufigkeit="" von="" ruminococcus="" auf="" das="" niveau="" der="" kontrollgruppe="" reduziert,="" und="" es="" wurde="" festgestellt,="" dass="" sich="" die="" 5-ht-spiegel="" verbessert="" hatten.="" darüber="" hinaus="" korrelierte="" die="" relative="" häufigkeit="" von="" bacteroides="" positiv="" mit="" einem="" 5-ht-spiegel="" im="" hippocampus="" und="" negativ="" mit="" der="" konzentration="" von="" butyrat,="" isobutyrat,="" valeriansäure,="" isovaleriansäure="" und="" hexansäure;="" die="" häufigkeit="" von="" parabacteroides="" zeigte="" eine="" signifikante="" positive="" korrelation="" mit="" einem="" 5-ht-spiegel="" im="" hippocampus="" und="" der="" propionatkonzentration,="" während="" sie="" eine="" negative="" korrelation="" mit="" isobutyrat-="" und="" isovaleriansäurekonzentrationen="" aufwies;="" ein="" signifikant="" positiver="" zusammenhang="" zwischen="" der="" relativen="" häufigkeit="" von="" butyricimonas="" und="" dem="" ne-spiegel="" im="" hippocampus="" wurde="" ebenfalls="" beobachtet,="" und="" die="" relative="" häufigkeit="" von="" deinococcus="" korrelierte="" positiv="" mit="" der="" acetatkonzentration.="" dies="" zeigte,="" dass="" cte="" seine="" antidepressive="" aktivität="" ausüben="" könnte,="" indem="" es="" die="" zusammensetzung="" der="" darmmikrobiota="" verändert,="" die="" neurotransmitterspiegel="" im="" hippocampus="" stört="" und="" neuroaktive="" metaboliten="" scfas="" wiederherstellt.="" detaillierte="" daten="" der="" korrelationsanalyse="" sind="" in="" der="" ergänzungstabelle="" s3="">