Teil 1 Chemische und genetische Diskriminierung von Cistanches Herba Basierend auf UPLC-QTOF / MS und DNA-Barcoding
Mar 03, 2022
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Abstrakt
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), bekannt als "Ginseng der Wüste", hat eine auffällige heilende Wirkung auf Kraft und Ernährung, insbesondere bei der Nierenverstärkung zur Stärkung des Yang. Die beiden pflanzlichen Ursprünge von Cistanches Herba, Cistanche deserticola und Cistanche tubulosa, unterscheiden sich jedoch hinsichtlich der pharmakologischen Wirkung und der chemischen Komponenten. Um den pflanzlichen Ursprung von Cistanches Herba zu unterscheiden, wurde in dieser Studie zunächst ein kombiniertes Methodensystem aus chemischer und genetischer Methode – UPLC-QTOF/MS-Technologie und DNA-Barcoding – eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass drei potentielle Markerverbindungen (ein Isomer von Campneosid II, Cistanosid C und Cistanosid A) erhalten wurden, um die beiden Ursprünge durch PCA- und OPLS-DA-Analysen zu unterscheiden. DNA-Barcoding ermöglichte es, zwei Ursprünge genau zu unterscheiden. Der NJ-Baum zeigte, dass sich zwei Ursprünge in zwei Kladen gruppierten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die beiden Ursprünge von Cistanches Herba unterschiedliche chemische Zusammensetzungen und genetische Variationen besitzen. Dies ist die erste berichtete Bewertung von zwei Ursprüngen von Cistanches Herba, und der Befund wird die Qualitätskontrolle und ihre klinische Anwendung erleichtern.
Einleitung
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), bekannt als "Ginseng der Wüste", stammt aus getrockneten Sukkulentenstängeln vonCistanche deserticolaY.C. Ma undCistanche tubulosa(Schrenk) Perücke nach dem chinesischen Arzneibuch (Ausgabe 2010) und ist beliebt für seine Tonisierung des Nieren-Yin, den Nutzen der Lebensessenz und die Entspannung des Darms. ZurzeitCistanches Herbaist hauptsächlich in trockenen und warmen Wüsten im Nordwesten Chinas verbreitet, insbesondere in den Provinzen Xinjiang und der Inneren Mongolei. Die beiden Ursprünge vonCistanches Herbaunterscheiden sich in ihrer pharmakologischen Aktivität und chemischen Komponenten. Tu et al. untersuchten die Abkochung von drei Cistanche-Arten (C. deserticola,C. tubulosa,Cistanche salsa) und stellte fest, dassC. tubulosazeigte den geringsten Effekt im Yang-Mangel-Mausmodell [1]. Zhang et al. verglichen die pharmakologische Aktivität zwischenC. deserticola,C. tubulosa,undC. salsa,und fanden heraus, dass diese Arten medizinische Funktionen wie Anti-Müdigkeit und Hypoxie-Toleranz hatten, aber nicht im gleichen Maße [2]. Frühere Forschungen berichteten über die chemische Komponente und zeigten den Unterschied der chemischen Komponente und des Gehalts für pflanzliche Ursprünge vonCistanches Herba[3]. Was die klinische Anwendung und den Marktumlauf betrifft, so gilt als Tonikum,C. tubulosawurde traditionell als durchblutungsförderndes Mittel und bei der Behandlung von Impotenz, Sterilität, Hexenschuss, Körperschwäche in Japan eingesetzt [4–8]. Folglich ist es von großer Bedeutung, zwei Ursprünge vonCistanches Herbafür die Qualitätskontrolle und klinische Anwendung. Es gibt jedoch keinen Forschungsschwerpunkt auf Diskriminierung zweier Ursprünge vonCistanches Herba. Viele erforschte Methoden, einschließlich Mikroskopie, Ultraviolett- und Infrarotdetektion, intereinfache Sequenzwiederholungsmethode, wurden verwendet, um die Gattung vonZistanches, aber nicht nur für zwei Ursprünge vor allem [9–20]. Hier haben wir in Verbindung mit chemischen und molekularen Techniken zwei Ursprünge von Cistanches Herba, UPLCQTOF/MS (Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Quadrupol-Time-of-Flight-Massenspektrometrie) und DNA-Barcoding unterschieden. UPLC-QTOF/MS liefert Informationen im Vergleich zu anderen Techniken schneller und effizienter. Die hohe Selektivität und Sensitivität von UPLC-QTOF/MS hat zu seiner Anwendung sowohl für quantitative als auch für qualitative Analysen sowie für die Metabolitenanalyse und Identifizierung komplexer Verbindungen in der Traditionellen Chinesischen Medizin geführt [21–22]. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und die orthogonale Projektion zur Latentstrukturdiskriminanzanalyse (OPLSDA) werden ebenfalls entwickelt, um potenzielle Markerverbindungen zu identifizieren. DNA-Barcoding, eine einfachere und universellere molekulare Markertechnologie, verwendet ein DNA-Fragment, um Arten oder Gattungen zu identifizieren. Es ist objektiv, genauer und einfacher durchzuführen als herkömmliche Identifizierungsmethoden und andere molekulare Markertechnologien. Darüber hinaus wurde DNA-Barcoding erfolgreich angewendet, um Tiere und Pflanzen, einschließlich Heilpflanzen, zu identifizieren [23-26]. Ziel dieser Forschung ist es, ein wissenschaftliches Methodensystem zu etablieren, kombiniert UPLC-QTOF/MS und DNA-Barcoding, zur Unterscheidung zweier pflanzlicher Ursprünge vonCistanches Herba.
Cistanches ganze Wurzeln
Materialien und Methoden
Ethikerklärung Wir bestätigen, dass es sich bei den Feldstudien nicht um gefährdete oder geschützte Arten handelte. GPS-Koordinaten wurden in die Beispielinformationen aufgenommen, siehe Tabelle 1."
Pflanzenstoffe und Reagenzien
Sukkulentenstämme von Cistanches Herba wurden im Mai 2012 aus den wilden Wüstenregionen in der Inneren Mongolei, den Provinzen Qinghai, dem Uigurischen Autonomen Gebiet Xinjiang und der Volksrepublik China gesammelt (Tabelle 1). Die Proben der Forschung wurden alle in wilden Wüstenregionen gesammelt, nicht auf privatem Land, wo keine spezifischen Genehmigungen erforderlich waren. Die botanischen Identitäten der Stämme wurden von Dr. Linfang Huang bestätigt. Gutscheinproben wurden am Institut für Heilpflanzenentwicklung hinterlegt. Für die UPLC-Analyse wurden Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Acetonitril (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) und Ameisensäure (Tedia, USA) verwendet. Deionisiertes Wasser wurde mit einem Milli-Q-System (Millipore, Bedford, MA, USA) gereinigt. Alle anderen Chemikalien waren von analytischer Qualität.
Probenvorbereitung
Cistanches Herba-Proben (1,0 g, 65-mesh) wurden in einen 50-ml-konischen Kolben überführt und 50 ml 70% Methanol wurden zugegeben. Nach dem Einweichen für 30 min wurde Ultraschall (35 kHz) bei Raumtemperatur für 30 min durchgeführt. Nach der Zentrifugation bei 10.000 U/min für 10 min wurde der Überstand bei 4 °C gelagert und durch eine 0,22-mm-Membran filtriert, bevor er zur Analyse in das UPLC-QTOF/MS-System eingespritzt wurde.
UPLC-QTOF/MS
Für die UPLC-Analyse wurden die folgenden Systeme/Parameter verwendet: Waters Acquity System (Waters) mit einer binären Lösungsmittelabgabepumpe, einem Auto-Sampler und einem PDA-Detektor, der an eine Waters Empower 2-Datenstation angeschlossen ist; Ultraschall (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, China); und eine elektronische Analysenwaage Modell AB135-2 (MettlerToledo., Greifensee, Zürich, Schweiz). Eine Waters Acquity UPLC BEH C18 Säule (1,7 mm, 2.16100 mm, Waters) und eine Waters C18 Schutzsäule (gleiches Material, Gewässer) wurden verwendet und bei 30uC gewartet. Die mobile Phase bestand zu 0,1% aus wässriger Ameisensäurelösung (A) und Acetonitril (B) mit einem Gradientenprogramm wie folgt: 0–3 min, 10–22% B; 3–4 min, 22–23% B; 4–6 min, 23–35% B; 6–8 min, 35–37% B; 8–11 min, 37–42% B; 11–12 min, 42–48% B; 12–15 min, 48%–50% B bei einer Durchflussrate von 0,3 ml/min. Das Injektionsvolumen betrug 5 ml.
Die UPLC/MS-Analyse wurde auf einem QTOF Synapt G2 HDMS-System (Waters, Manchester, UK) durchgeführt, das mit einer im Negativ-Ionen-Modus betriebenen Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) ausgestattet war. N2 wurde als Desolvationsgas verwendet. Die Desolvationstemperatur wurde auf 450 ° C bei einer Durchflussrate von 800 l / h und die Quelltemperatur auf 120 ° C festgelegt. Die Kapillar- und Kegelspannungen wurden auf 2500 bzw. 40 V eingestellt. Die Daten wurden zwischen 50 und 1200 Da mit einer Scanzeit von 0,1 s und einer Verzögerung von 0,01 s zwischen den Scans über eine Analysezeit von 15 Minuten gesammelt. Als Kollisionsgas wurde Argon bei einem Druck von 7,06661023 Pa verwendet. Alle MS-Daten wurden mit dem LockSpray-System gesammelt, um Massengenauigkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Das [M-H]-Ion von Leucin-Enkephalin bei m/z 554.2615 wurde als Sperrmasse im negativen ESI-Modus verwendet.
Datenanalyse
UPLC-QTOF/MS-Daten für Cistanches Herba-Proben wurden analysiert, um potenzielle Diskriminanzvariablen zu identifizieren. Das Peak-Finding, die Ausrichtung und die Filterung von ES-Rohdaten wurden mit dem Marker Lynx Applications Manager, Version 4.1 (Waters, Manchester, UK) durchgeführt. Die verwendeten Parameter waren wie folgt: Retentionszeit (tR) von 0–15 min, Masse von 50–1200 Da, Retentionszeittoleranz von 0,02 min und Massentoleranz von 0,02 Da. Es wurden drei Replikatproben verwendet, die von jedem geografischen Standort gesammelt wurden (n = 3). Insgesamt wurden 6.339 Variablen verwendet, um das Modell zu erstellen.
DNA-Barcoding: DNA-Extraktion, PCR-Amplifikation und Sequenzierung
Proben aus getrockneten fleischigen Stängeln von C. deserticola und C. tubulosa (30 mg) wurden 2 Minuten lang mit einer Frequenz von 30 r/s gerieben. DNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tiangen) extrahiert. Insbesondere wurde das Protokoll so modifiziert, dass Chloroform durch eine Mischung aus Chloroform ersetzt wurde: Isoamylalkohol (24: 1 im gleichen Volumen) und Pufferlösung GP2 mit Isopropanol (gleiches Volumen). Das geriebene Pulver wurde in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen gegeben, 700 ml 65 ° C vorgewärmtes GP1 und 1 ml b-Mercaptoethanol hinzugefügt, um es mit Vortex für 10-20 s zu mischen, und 60 Minuten lang bei 65 ° C inkubiert; Zugabe von 700 ml Mischung aus Chloroform: Isoamylalkohol (24: 1), Zentrifuge für 5 Minuten bei 12000 U / min (,134006g); Pipettenüberstand zu einem neuen Röhrchen, Zugabe von 700 ml Isopropanol, Mischen für 15-20 Minuten; Verrohrung der gesamten Mischung in Spinsäule CB3 und Zentrifuge für 40 s bei 12000 U / min; Verwerfen des Filtrats und Zugabe von 500 ml GD (Zugabe von quantitativem wasserfreiem Ethanol vor dem Gebrauch), Zentrifuge bei 12000 U / min für 40 s; Verwerfen des Filtrats und Zugabe von 700 ml PW (Zugabe von quantitativem wasserfreiem Ethanol vor dem Gebrauch), um die Membran zu waschen, Zentrifuge für 40 s bei 12000 U / min; Verwerfen des Filtrats und Zugabe von 500 mL PW, Zentrifuge für 40 s bei 12000 U/min; Verwerfen des Filtrats und der Zentrifuge für 2 Minuten bei 12000 U / min, um den verbleibenden Waschpuffer PW zu entfernen; Überführen der Spinsäule CB3 in ein sauberes 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen und Trocknen bei Raumtemperatur für 3–5 Minuten; Zentrifugieren Sie für 2 Minuten bei 12000 U / min, um die gesamte DNA zu erhalten. Die Grundierungen für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierten auf zuvor berichteten Sequenzen [4,5]. PCR-Reaktionsgemische enthielten 2-ml-DNA-Template, 8,5-mL ddH2O, 12,5-mL 26Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., China), 1/1-mL Forward/Reverse (F/R) Primer (2,5 mM), in einem Endvolumen von 25 mL. Die PCR-Amplifikation wurde wie von Kress et al. beschrieben durchgeführt [4]. Die Primer der PCR-Reaktion waren fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59-39) und rev TH: CGCGCATGGTGGATTCAATCC (59-39). PCR-Produkte wurden durch 1% Agarosegelelektrophorese getrennt und nachgewiesen. PCR-Produkte wurden nach dem Protokoll des Herstellers gereinigt und direkt einer Sequenzierung unterzogen.
Die wichtigste wirksame Verbindung der Zistanche: Acteosid
Befund
Vorläufige Peakzuweisung durch UPLC-QTOF/MS Repräsentative Chromatogramme von C. deserticola und C. tubulosa aus verschiedenen Produktionsgebieten sind in Abbildung 1 dargestellt. Das Fingerabdruckchromatogramm zeigte Ähnlichkeiten zwischen Cistanches Herba-Proben an. Insgesamt wurden 23 qualifizierte Massenpeaks nachgewiesen und 16 Peaks identifiziert, indem die Retentionszeiten und Massenspektren mit den zuvor berichteten abgeglichen wurden (Tabelle 2) [29–35]. Die Peaks 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 und 23 wurden vorläufig als Cistanosid F, Mussaenosisäure, Cistanbulosid C1/C2, Campneosid II, Isomer von Campneosid II, Echinacosid, Cistanosid A, Acteosid, Isoacteosid, Syringalid A-39-a-L-rhamnopyranosid, Cistanosid C, 29-Acetylacetosid, Osmanthusid B, Cistanosid D, Tubulosid B bzw. Cistancinensid A identifiziert. Es wurde festgestellt, dass chemische Bestandteile in erster Linie Phenylethanoidglykoside (PhGs) sind, während eine Verbindung, Mussaenosidsäure, ein iridoides Polysaccharid war. PhGs sind die wichtigsten Wirkstoffe in Bezug auf die Behandlung von Nierenmangel und antioxidative und neuroprotektive Wirkungen [36]
PCA von C. deserticola und C. tubulosa
PCA wurde verwendet, um Proben verschiedener Pflanzenarten zu unterscheiden. PCA ist eine unüberwachte multivariate Datenanalysemethode, die darauf abzielt, die Ähnlichkeiten und/oder Unterschiede innerhalb multivariater Daten der Sekundärmetabolitenzusammensetzung zu visualisieren [37]. Auf das Zwei-Komponenten-PCA-Modell entfielen kumulativ 46,04 % der Abweichung (PC1, 36,43 %; PC2, 9,61%). Abbildung 2 zeigt, dass 24 Proben in den PCA-Scores nach Artherkunft in zwei Gruppen gruppiert wurden, was darauf hindeutet, dass sich die chemische Zusammensetzung von C. deserticola und C. tubulosa signifikant unterschied.
Die wichtigste wirksame Verbindung von Cistanche: Echinacosid
