TEIL 1 Cistanche Deserticola Polysaccharid hemmt OVX-induzierten Knochenverlust bei Mäusen und RANKL-induzierte Osteoklastogenese
Mar 02, 2022
Einführung
Osteoporose – eine Krankheit, die durch verringerte Knochenmasse, anormale Mikrostruktur des Knochengewebes, erhöhte Knochenbrüchigkeit und Knochenbrüche gekennzeichnet ist (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli & Ginaldi, 2006) – betrifft derzeit mehr als 200 Millionen Menschen weltweit und stellt einen erheblichen medizinischen und medizinischen Nutzen dar sozioökonomische Belastung der modernen Gesellschaft (Strom et al., 2011). Die klinische Behandlung der Osteoporose konzentriert sich hauptsächlich auf Hormonersatz-, Bisphosphonat- oder Denosumab-Therapie. Diese Methoden sind wirksam, bergen jedoch langfristige Nebenwirkungen wie das potenzielle Risiko von Brustkrebs und atypischen Femurfrakturen (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof-Bauer, 2011). Daher besteht ein dringender Bedarf, Medikamente zu erforschen, die nicht nur hemmen könnenOsteoporosesondern besitzen auch weniger unerwünschte Nebenwirkungen.
Cistanche Deserticola(CD), ein in China weit verbreitetes Tonikum und medizinisches Lebensmittel, bekannt als "Wüstenginseng", ist der getrocknete Sukkulentenstiel mit SchuppenblattC. DeserticolaYC Ma (Gu, Yang & Huang, 2016) und ist vielfältig und effektivpharmakologischAktivitäten, wie Immunregulation, Antioxidation und Anti-OsteoporoseEigenschaften (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Bisherige Studien zu den Wirkstoffen von CD konzentrierten sich hauptsächlich auf die Behandlung von OsteoporosePhenylethanoidGlykoside(Li, Jiang & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao & Ma, 2017). Die CD enthält jedoch auch andere wirksame Komponenten wie Iridoide, Lignane,Polysaccharide(Wang, Zhang und Xie, 2012). Die klinische Anwendung der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) ist hauptsächlich das Abkochen von Wasser.Polysaccharidesind wasserlösliche Bestandteile und höchstwahrscheinlich die wichtigsten pharmakodynamischen Bestandteile der TCM. Von aus TCM extrahierten Polysacchariden wurde wild berichtet, dass sie eine Anti-OsteoporoseWirkung und einigen unerwünschten Nebenwirkungen, die im Allgemeinen in Kliniken verwendet wurden (z. Yan, 2018) und Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Daher haben wir das vermutetCistanche DeserticolaPolysaccharid(CDP), das aus CD extrahiert wird, könnte ein potenziell sicheres Medikament zur Behandlung von Osteoporose sein.
Typischerweise halten Knochenresorption und Knochenbildung während des Knochenumbaus ein dynamisches Gleichgewicht in Koordination mit mehreren Zelltypen aufrecht, darunter Osteoklasten, Osteoblasten, Knochenauskleidungszellen und Osteozyten (Kular, Tickner, Chim & Xu, 2012). Eine Störung dieses Gleichgewichts kann zu einer Vielzahl von Knochenstoffwechselerkrankungen führen, wie zOsteoporose(Zhu et al., 2018) und Osteosklerose (Ihde et al., 2011). Osteoklasten sind als enddifferenzierte Zellen, die von der mononukleären/Makrophagen-Linie abstammen, die einzigen Zellen mit Knochenresorptionsfunktion (Teitelbaum, 2000). Es gibt zwei Schlüsselzytokine, die an der Differenzierung und Reifung von Osteoklasten beteiligt sind (Koga et al., 2004): Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF) und Rezeptoraktivator des Nuklearfaktors κB (NF-κB)-Ligand (RANKL). M-CSF vermittelt die Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen zu Osteoklasten-Vorläufern und fördert die Differenzierung von Osteoklasten durch Hochregulierung der Expression des RANK-Rezeptors (Takayanagi, 2007). Die Bindung von RANKL und RANK auf der Osteoklasten-Zelloberfläche führt zu Folgendem: (1) Rekrutierung von signalgebenden Adaptermolekülen wie TNF-Rezeptor-assoziiertem Faktor 6 (TRAF6); (2) Aktivierung mehrerer nachgeschalteter Ziele, einschließlich NF-κB und Mitogen-aktivierter Proteinkinasen (MAPKs); und (3) Hochregulierung der Expressionsniveaus des Kernfaktors aktivierter T-Zellen, zytoplasmatisch 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Die Aktivierung dieser Signalwege reguliert direkt die Expression von Osteoklasten-Genen, einschließlich saurer Phosphatase 5 (Acp5) [kodiert für Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAcP)], Matrix-Metalloproteinase 9 (MMP9) und Cathepsin K (CTSK) (Boyle, Simonet , & Lacey, 2003). Daher ist die Hemmung von Signalwegen, die mit der RANKL-induzierten Osteoklasten-Differenzierung in Verbindung stehen, ein potenzielles therapeutisches Verfahren für Osteoporose.
In dieser Studie wollten wir die Auswirkungen der CDP-Behandlung auf die ovariektomierte (OVX)-induzierte bestimmenOsteoporoseMausmodell in vivo und auf RANKL-induzierte Osteoklastenaktivität in vitro, mit Fokus auf die Expression osteoklastenspezifischer Gene und die Aktivierung von NFATc1 sowie der NF-κB- und MAPKs-Signalwege. Unsere Ergebnisse könnten neue Einblicke in das Potenzial von CDP als sicheres und wirksames Medikament zur Behandlung von Osteoporose liefern.
Für mehr Informationen, kontaktieren sie bitte:Joanna.jia@wecistanche.com
2. Materialien und Methoden
2.1. Chemikalien und Probenentnahme
CD (Nr. 180801) wurde von Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, China) erworben und von Professor Haibo Huang von der School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, China, identifiziert. Estradiolvalerat-Tabletten wurden von Bayer (Leverkusen, Nordrhein-Westfalen, Deutschland) gekauft. Alpha-modifiziertes minimales essentielles Medium
(-MEM) und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bezogen. Penicillin/Streptomycin und das TRAcP-Färbekit wurden von Solarbio (Peking, China) erworben. Rekombinantes Maus-M-CSF und rekombinantes Maus-RANKL wurden von R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) bezogen. Mit Hydroxyapatit beschichtete Platten wurden von Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA) bezogen. Die primären Antikörper für NFATc1 und CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK und P-JNK (Cell Signalling Technology, Danvers, MA, USA); und -Actin (CWBIO, Peking, China) wurde ebenfalls erhalten. Die anderen in dieser Studie verwendeten Reagenzien waren von Analysequalität, und das Wasser wurde mit dem Milli-Q-Wasserreinigungssystem (Millipore, Bedford, MA, USA) gereinigt.
2.2. CDP-Extraktion
Die CD wurde zu einem feinen Pulver gemahlen und dreimal mit Petrolether gemischt, um es zu zerstören. Der feste Rückstand wurde durch Filtration gesammelt und dann bei Raumtemperatur getrocknet. DasPolysaccharidewurden aus den vorbehandelten Proben dreimal 2 h mit Wasser extrahiert, konzentriert, durch Zugabe von wasserfreiem Ethanol auf eine Endkonzentration von 80 Prozent (v/v) gefällt und 24 h bei 4 ◦C gelagert. Die Präzipitate wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 3000 U/min gesammelt, in destilliertem Wasser gelöst und unter Verwendung der Sevag-Methode (Zhao et al., 2019) gereinigt (Entfernung freier Proteine). Die genesenPolysaccharidewurden dialysiert, getrocknet und bis zur weiteren Verwendung gelagert. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der chemischen Zusammensetzung, dass der Gesamtzucker-, Uronsäure-, Sulfat- und Proteingehalt von CDP 67,63 0,98 Prozent, 21,05 0,49 Prozent, 1,{{7 }},24 Prozent und 8,81 0,36 Prozent .
Die Monosaccharidzusammensetzung und die Fourier-Transformations-Infrarotanalyse von CDP wurden in den ergänzenden Fig. 1 und 2 gezeigt.
2.3. OVX-induziertes Osteoporose-Mausmodell
Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der Guangzhou University of Chinese Medicine genehmigt (genehmigt SYXK 2019-0202). Dreißig 6- Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse wurden vom Experiment Animal Center der Guangzhou University of Chinese Medicine zur Verfügung gestellt. Nach 1-wöchiger Akklimatisierung wurde einer Gruppe von Mäusen eine Scheinoperation (Schein-Gruppe) unterzogen, während die verbleibenden Mäuse einer Ovarektomie-Operation (OVX-Gruppe) unterzogen wurden. Nach der Operation durften sich die Mäuse 1- Wochen lang erholen. Dann wurden erfolgreich modellierte Mäuse zufällig in 5 Gruppen mit 6 Mäusen pro Gruppe eingeteilt:
(1) Schein-Gruppe: behandelt mit destilliertem Wasser, (2) OVX-Gruppe: behandelt mit destilliertem Wasser, (3) OVX E2-Gruppe (E2): behandelt mit 0,13 mg/kg Estradiolvalerat-Tabletten, (4 ) OVX CDP Niedrigdosisgruppe (CDP-L): behandelt mit 300 mg/kg CDP, (5) OVX CDP Hochdosisgruppe (CDP-H): behandelt mit 600 mg/kg CDP. Destilliertes Wasser, E2 oder CDP wurde einmal täglich per Schlundsonde verabreicht. Alle Mäuse wurden nach der Behandlungsdauer von 12- Wochen getötet (Fig. 1A). Die Uteri wurden gesammelt und gewogen, und die linken Schienbeine wurden für nachfolgende Untersuchungen gesammelt. Vollblutproben wurden gesammelt und bei 5000 U/min zentrifugiert
15 min bei 4 ◦C. Die Serumüberstände wurden abgesaugt und bei gelagert
—80 ◦C bis zur weiteren Analyse.
2.4. Mikro-Computertomographie (Mikro-CT)-Analyse und Knochenhistomorphometrie
Die linken Schienbeine wurden mit 4 Prozent Paraformaldehyd für 48 h fixiert und anschließend in Zentrifugenröhrchen mit normaler Kochsalzlösung gegeben. Die fixierten Proben wurden mit dem Mikro-CT-Instrument Skyscan 1172 (Bruker Mikro-CT, Skyscan, Kontich, Belgien) unter Verwendung der folgenden Einstellungen gescannt: Spannung, 8 0 kV; Quellenstrom, 100 μA; Al, 0,5-mm-Filter; Pixel
Größe 9,76 μm; und Rotationsschritt, 0.6◦. Mehrere Parameter der
trabekulärer Knochen, einschließlich Knochenmineraldichte (BMD), Knochenvolumenanteil (BV/TV), Knochenoberfläche pro Gesamtvolumen (BS/TV), Trabekelzahl (Tb. N) und Trabekelabstand (Tb. Sp) wurden mit gemessen CT-Analyser®-Software (Bruker Mikro-CT, Skyscan). Dreidimensionale Bilder wurden unter Verwendung der CTVol-Software (Bruker Mikro-CT. Skyscan) erzeugt.
Nach der Mikro-CT-Analyse wurden die linken Schienbeine in 14-prozentiger EDTA-Lösung entkalkt und zum Schneiden in Paraffin eingebettet. Die Proben wurden vor den Färbeexperimenten mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) und TRAcP unter Verwendung eines Mikrotoms in 5 &mgr;m-Schnitte geschnitten. Die gefärbten Schnitte wurden mit dem Mikroskop Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokio, Japan) untersucht und dokumentiert.
Cistanchekann die Knochendichte erhöhen und Osteoporose lindern
2.5. Serumanalyse
Die Konzentrationen von Calcium (Ca) und Phosphor (P) wurden gemäß den Kit-Anweisungen bestimmt, die vom Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) entworfen wurden. Die TRAcP-5b- und RANKL-Spiegel im Serum wurden mit dem TRAcP-5b-ELISA-Kit (CUSABIO, Wuhan, China) bzw. dem RANKL-ELISA-Kit (Cloud-CloneCorp., Wuhan, China) analysiert.
2.6. In-vitro-Osteoklastogenese-Assay
BMMs wurden aus Tibia und Femur von 6- Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen isoliert. Die isolierten Zellen wurden in -MEM-Medium kultiviert, das 25 ng/ml M-CSF, 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin enthielt. Nach Erreichen der Konfluenz wurden die BMMs (1 104-Zellen/Vertiefung) in 96--Vertiefungsplatten ausgesät und mit CDP in Gegenwart von 50 ng/ml RANKL behandelt. Das Medium und CDP wurden alle 2 Tage ausgetauscht. Nach 7 Tagen wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und auf das Vorhandensein von TRAcP gefärbt. Die Anzahl der Osteoklasten, definiert als TRAcP-positive Zellen mit drei oder mehr Zellkernen, wurde gezählt und lichtmikroskopisch dokumentiert.
2.7. Zellproliferationsassay
Die BMMs (1 × 104 Zellen/Vertiefung) wurden in eine 96-Well-Platte ausgesät und über Nacht inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 48 h lang mit unterschiedlichen CDP-Konzentrationen (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 und 40 µg/ml) behandelt. Die Zellkonfluenz wurde mit IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA), einem dynamischen Echtzeit-Bildgebungssystem für lebende Zellen, nachgewiesen und analysiert.
2.8. Hydroxylapatit-Resorptionsassay
Die BMMs ({{0}} Zellen/Vertiefung) wurden in eine mit Hydroxyapatit beschichtete Platte ausgesät, mit CDP in den angegebenen Konzentrationen (0, 5 und 10 µg/ml) behandelt und in vollständigem -MEM kultiviert enthält 25 ng/ml M-CSF und 50 ng/ml RANKL. Nach 7 Tagen wurden die Zellen mit einer 10-prozentigen Bleichlösung gewaschen, um die Zellbestandteile zu entfernen. Die Bilder der Hydroxyapatit-Resorptionsbereiche wurden mit IncuCyte ZOOM® aufgenommen und mit der ImageJ-Software (NIH, Bethesda, MD, USA) analysiert (Abramoff, Magelhaes & Ram, 2003).
2.9. RNA-Isolierung und Echtzeit-Reverse-Transkription-quantitative PCR (RT-qPCR)-Analyse
Die BMMs ({{0}} Zellen/Well) wurden in eine 6-Well-Platte gesät und mit RANKL und M-CSF in Gegenwart von CDP in verschiedenen Konzentrationen (0, 5 und 10) stimuliert µg/ml) für 5 Tage. Gesamt-RNA wurde aus Zellen oder Knochengewebe von Mäusen unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Sigma-Aldrich) isoliert. Komplementäre DNA wurde aus 2 &mgr;g Gesamt-RNA unter Verwendung eines Reverse-Transkriptase-Kits (TransGen Biotech, Peking, China) synthetisiert. Die RT-qPCR-Reaktionen wurden mit PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) vorbereitet und mit dem ABI 7500-System (Applied
Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Die Zyklusparameter für die PCR wurden wie folgt eingestellt: 95 ◦C für 5 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ◦C für 15 s und 60 ◦C für 30 s. Die verwendeten spezifischen Primer sind in Tabelle 1 gezeigt, und die Menge jedes Zielgens wurde auf GAPDH (interne Kontrolle) normalisiert.
2.10. Western-Blot-Analyse
Die BMMs ({{0}} Zellen/Well) wurden in einer 6-Well-Platte ausgesät. Für Kurzzeitexperimente wurden die Zellen mit den verschiedenen Konzentrationen von CDP (0, 5 und 10 µg/mL) für 1 h vorinkubiert und dann mit 50 ng/mL RANKL für 30 min behandelt . Für einen Langzeitverlauf wurden die Zellen mit 50 ng/ml RANKL an den Tagen 3, 5 und 7 in Gegenwart von CDP (0, 5 und 10 ug/ml) stimuliert. Gesamtproteine wurden unter Verwendung des RIPA-Lysepuffers (CWBIO) extrahiert. Proteine wurden durch 10 % SDS-PAGE getrennt und auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % Magermilch bei Raumtemperatur für 2 h blockiert und mit Primärmilch inkubiert
Antikörper über Nacht bei 4 ◦C, und dann mit den entsprechenden sekundären
Antikörper für 1,5 h. Die Membranen wurden unter Verwendung von ECL-Reagenzien (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) entwickelt, und Bilder wurden unter Verwendung des Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, China) aufgenommen.
Cistanchekann die Knochendichte erhöhen
2.11. Nachweis der NFATc1-Translokation mittels Immunfluoreszenztest
Die BMMs wurden auf {{0}}-Well-Deckgläser ausgesät, mit RANKL und M-CSF stimuliert und 5 Tage lang mit 10 µg/ml CDP behandelt. Die Zellen wurden mit 4 % Paraformaldehyd für 15 min fixiert, dreimal mit PBS gewaschen und mit 0,1 % Triton X-100 für 10 min permeabilisiert. Die Zellen wurden mit 10 Prozent Ziegenserum (CWBIO) gemischt und für 2 h inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4 °C und dann mit dem sekundären Ziegen-Anti-Maus-Antikörper Alexa Fluor 488 (Abcam, Cambridge, MA, USA) für 1 h im Dunkeln inkubiert. Die Deckgläser wurden mit PBS gewaschen, in Prolong Gold Antifade Reagent mit 4′, 6-Diamidino-2-phenyl in-dole (DAPI) (Solar) montiert und
inspiziert mit Zeiss LSM 800 mit konfokalem Airyscan-Mikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland).
2.12. statistische Analyse
Alle Versuchsdaten wurden mit SPSS 25.0-Statistiksoftware (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) analysiert. Die Daten für Tier- und Zellstudien sind als Mittelwerte ± SEM bzw. Mittelwerte ± Standardabweichung ausgedrückt. Die Ergebnisse basieren auf der Einweg-Varianzanalyse oder dem Student-t-Test. Werte von p < 0,05="" wurden="" als="" statistisch="" signifikant="">
CistancheKann reduzierenApoptoseund Knochen stärkenDichte
