Teil 1 Nachweis von Cistanches Herba (Rou Cong Rong) Arzneimittel unter Verwendung artspezifischer Nukleotidsignaturen

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Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* und Shi-lin Chen 3

1 Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Bildungsministerium, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medicinal Science und Peking Union Medicinal College, Beijing, China, 2 NHP Research Alliance, Biodiversity Institute of Ontario (BIO), University of Guelph, Guelph, ON, Kanada,

3 Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Peking, China

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Cistanches Herbaist eine Heilpflanze, die entgiftende Eigenschaften hat und häufig in Asien verwendet wird. Aufgrund des Ungleichgewichts zwischen Angebot und Nachfrage werden häufig Verfälschungsmittel für den Profit hinzugefügt. Es gibt jedoch keine regulatorische Aufsicht, da Qualitätskontrollinstrumente nicht ausreichen, um stark verarbeitete Produkte zu identifizieren. So wurde ein neuartiges molekulares Werkzeug entwickelt, das auf Nukleotidsignaturen und artspezifischen Primern basiert. Die ITS2-Regionen ab 251Cistanches Herbaund adulterente Proben wurden sequenziert. Auf der Grundlage von SNP-Sites wurden vier Nukleotidsignaturen innerhalb von 30∼37 bp und sechs artspezifische Primer entwickelt, die durch künstliche experimentelle Mischungen aus sechs verschiedenen Spezies und unterschiedlichen Verhältnissen validiert wurden. Diese Methode wurde auch angewendet, um 66Cistanches HerbaProdukte auf dem Markt, einschließlich Extrakte und chinesische Patentmedikamente. Die Ergebnisse zeigten den Nutzen von Nukleotidsignaturen bei der Identifizierung von Verfälschungsmitteln in Gemischen. Die Marktstudie ergab 36,4% Verfälschung: 19,7% betrafen eine Verfälschung mit Cynomorium songaricum oderCistancheSinensis, und 16,7% betrafen die Substitution mit Cy. Songaricum, Ci. sinensis oder Boschniakia rossica. Die Ergebnisse zeigten auch, dass Cy. Songaricum war das häufigste Verfälschungsmittel auf dem Markt. Daher empfehlen wir den Einsatz artspezifischer Nukleotidsignaturen zur Regulierung von Verfälschungen und zur Überprüfung der Qualitätssicherung von Arzneimittellieferketten, insbesondere bei verarbeiteten Produkten, deren DNA abgebaut wird.

Schlüsselwörter: Cistanches Herba, Chinesische Patentmedizin, Nukleotidsignatur, abgebaute DNA, Arzneimittelqualitätskontrolle

EINLEITUNG

Cistanches Herba(Rou Cong Rong) ist eine bekannte Pharmakopöe-aufgezeichnete Medizin in Asien (Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015; Japanisches Pharmakopeial-Übereinkommen, 2016); Dieses Arzneimittel wird aus den getrockneten sukkulenten Stängeln vonCistanche deserticolaY. C. Ma oderCistanche tubulosaTonikum, da es nicht toxisch ist und über einen längeren Zeitraum eingenommen werden kann (Li et al., 2016). AußerdemZistanchesHerba wurde die Ehre zuteil, wegen seines großen medizinischen Wertes, insbesondere bei der Stärkung der männlichen Sexualfunktion, "Desert Ginseng" genannt zu werden (Zhang und Su, 2014; Gu et al., 2016). Es gibt mehr als 100 chinesische Patentarzneimittel, die in der chinesischen Pharmakopöeia-Kommission (2015) und in anderen lokalen offiziellen Standards (Wang et al., 2012) registriert sind. Da die Population älterer Menschen zunimmt, besteht eine erhebliche Nachfrage nachCistanches Herbaund seine Arzneimittel. Rohstoffressourcen werden jedoch immer knapper. In der Tat sind die beiden ursprünglichen Arten vonCistanches Herbawurden als staatlich geschützte Wildpflanzen (Kategorie II) in das China Plant Red Data Book aufgenommen (Fu, 1991). Die auf dem Markt befindlichen Arzneimittel werden hauptsächlich im Nordwesten Chinas angebaut.

Aufgrund des erheblichen Ungleichgewichts zwischen Angebot und Nachfrage vonZistanchesHerba, viele Verfälschungsmittel sind auf den Markt gekommen; Diese Verfälschungsmittel entsprechen nicht den Standards und können die Arzneimittelsicherheit gefährden. Zu den bekannten Verfälschungsmitteln gehören die getrockneten Sukkulentenstängel von Cynomorium songaricum Rupr. (Cynomorii Herba, Suo Yang auf Chinesisch),Cistanchesinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan und Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. et Flerov (Sun et al., 2012). Diese Verfälschungsmittel haben morphologische Eigenschaften, die denen vonZistanchesHerba, was die traditionelle taxonomische Identifizierung erschwert, insbesondere nachdem das Material zu Arzneimitteln verarbeitet wurde. Eine mikroskopische Identifizierung ist nicht verfügbar, daZistanchesHerbahat keine definitiven oder einzigartigen mikroskopischen Eigenschaften. Aktuelle Werkzeuge der analytischen Chemie reichen nicht aus, um eine Verfälschung von Cistanches Herba nachzuweisen, da ähnliche Verbindungen auch innerhalb der bekannten Verfälschungsmittel Ci vorhanden sind. Salsa (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) und Ci. sinensis (Liu et al., 2013). Daher ist die Entwicklung einer schnellen molekularen Methode zur Authentifizierung von Cistanches Herba und seinen Produkten für geeignete Qualitätskontrollsysteme in der chinesischen Patentmedizin und anderen Arzneimittelindustrien dringend erforderlich.

Chen et al. schlugen zuerst den internen transkribierten Abstandshalter 2 (ITS2) als universellen Barcode für Heilpflanzen vor (Chen et al., 2010). Sun et al. verifizierten die ITS2-Region als bevorzugten DNA-Barcode zur IdentifizierungZistanchesHerba und seine Verfälscher (Sun et al., 2012). ITS2 kann jedoch nicht verwendet werden, um chinesische Patentmedizin von abgebauter DNA zu unterscheiden. In jüngster Zeit haben immer mehr Studien gezeigt, dass der "Mini-Barcode" eine nützliche Methode zur Amplifikation degradierter DNA ist (Hajibabaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2015). Nukleotidsignaturen sind jedoch besser geeignet als Mini-Barcodes, da sich die ersteren auf ein oder mehrere Nukleotide beziehen, die für eine Spezies einzigartig sind und von vielen molekularen Techniken wie DNA-Sonden, Mikrofluidik und schleifenvermittelter isothermer Amplifikation effektiv genutzt werden können (de Boer et al., 2015). Han et al. entwickelten Nukleotidsignaturen für Panax Ginseng, Angelica Sinensis und Lonicera japonica und identifizierten erfolgreich die damit verbundenen chinesischen Patentmedikamente (Liu et al., 2016; Wang et al., 2016a; Gao et al., 2017).

funktionelle Produkte, dieZistanchesHerba. Konkret haben wir (1) vier Nukleotidsignaturen und sechs spezifische Primerpaare zur Differenzierung authentischerZistanchesHerba und bekannte Verfälschungsmittel, (2) validierten die vier Nukleotidsignaturen in Experimenten, einschließlich Mischungen bekannter taxonomischer Gutscheine, die zur Herstellung von Cistanches Herba-Produkten verwendet wurden, die sowohl authentische als auch verfälschte Inhaltsstoffe enthalten, und (3) führten eine Marktumfrage von 66 durchZistanchesHerba-Produkte über ihre Nukleotidsignaturen.

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MATERIALIEN UND METHODEN

Probenentnahme und -vorbereitung

Insgesamt wurden 251 Proben unter anderem aus der Inneren Mongolei, Xinjiang und Ningxia entnommen; Diese Proben enthielten 214Cistanches Herbaund 37 Verfälschungsmittel und sind in der Ergänzenden Tabelle S1 aufgeführt. Entsprechende Belegproben wurden von Taxonomen validiert und im Herbarium des Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, China, hinterlegt. Insgesamt 35 Chargen von Pulvern, Gewürzen und Extrakten ausZistanchesHerba wurden in Online-Shops und stationären Drogerien in Peking und Chengdu gekauft (Tabelle 1). Insgesamt 31 Chargen chinesischer Patentmedizin, dieZistanchesHerba wurden von verschiedenen Drogerien gekauft (Tabelle 2), und die deklarierten Zusammensetzungen verschiedener chinesischer Patentarzneimittel sind in der Ergänzungstabelle S3 aufgeführt. Die unterschiedlichen morphologischen Merkmale der verschiedenen Dosisformen sind in Abbildung 1 dargestellt.

Gemischte Proben: Pulver von Ci.deserticolaCi.TubulosaCy. Songaricum, Ci. Sinensis, B. rossica und O. coerulescens wurden vor der Extraktion künstlich in verschiedenen Kombinationen (im Verhältnis 1:1) gemischt. Die Details dieser gemischten Stichproben sind in der Legende von Abbildung 3 dargestellt. Zusätzlich wurden die Pulver von vier Verfälschungsmitteln mit dem echten Ci vermischt. Deserticola in verschiedenen Gewichtsverhältnissen: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 und 60000:1 (Tabelle 3). Und die beiden echten Produkte werden in den gleichen Anteilen gemischt.

Abkochung: Scheiben von Ci. deserticola und Cy. Songaricum wurde verwendet, um die Abkochung vorzubereiten. Die Scheiben (10 g) wurden in 300 ml doppelt destilliertem Wasser für 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 und 240 min gekocht und dann zur DNA-Extraktion verwendet.

DNA-Extraktion, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Amplifikation und Sequenzierung

Proben, Abkochung und Mischproben: Die Proben (40–50 mg) wurden über eine Retsch MM400 Labormischermühle (Retsch Co., Deutschland) mit einer Frequenz von 30 Hz zu feinen Pulvern gemahlen. Die genomische DNA wurde anschließend mit einem Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co., China) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. ITS2 wurde durch die Universalprimer 2F/3R verstärkt (Chen et al., 2010).

parallel pro Charge. Das chinesische Patentmedizinpulver wurde mit 700 μL Vorwaschpuffer gewaschen [100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 20 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 8,0;

700 mM NaCl; 2% Polyvinylpyrrolidon (PVP)-40; und 0,4% β-Mercaptoethanol] mehrmals, bis der Überstand klar und farblos war, danach wurde das Gemisch bei 7500 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Niederschlag wurde anschließend verwendet, um die genomische DNA über das Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co.) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren. Am Ende wurde DNA aus jeder Charge in einer Röhre konzentriert. Sechs speziesspezifische Primerpaare: SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

SCRF/SCRR und LDF/LDR – wurden über Primer Premier entwickelt

6.0-Software (Premier Co., Kanada) zur Verstärkung von Cistanches Herba und seinen Verfälschungsmitteln (die Details sind in Tabelle 4 dargestellt). Die PCR wurde in einer 50-μL-Volumenreaktion durchgeführt, die 1 μL

KOD FX (Toyobo Co., Japan), 25 μL von 2 × PCR-Puffer, 10 μL dNTPs (2 mM), 1,5 μL von jedem Primer (10 μM) und 4 μL (∼50 ng) DNA-Vorlage; Das restliche Volumen bestand aus doppelt destilliertem Wasser. Die Reaktionen wurden durchgeführt von

ein Thermocycler (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., USA); Die Thermalprogramme sind in Tabelle 4 aufgeführt. Die PCR-Produkte wurden mittels 3%iger Agarosegelelektrophorese untersucht und für die bidirektionale Sequenzierung mit einem ABI 3730XL Sequenzer (Applied Biosystems Co.) nach der Sanger-Sequenzierungsmethode gereinigt. Anschließend wurde die Sensitivität der sechs Primer über den quantitativen real-time PCR (qRT-PCR) Assay mit einem CFX96 Real-time System (Bio-rad Lab., USA) getestet. Die Zyklusschwellen wurden vom System automatisch über das Modell "PCR Baseline Subtracted Curve Fit" berechnet. Die qRT-PCR wurde in einer 15-μL-Volumenreaktion durchgeführt, die 7,5 μL SYBR(X)R Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus) enthielt

(Takara Bio Co., Japan), 1,0 μL von jedem Primer (10 μM) und 1,0 μL DNA-Vorlage, wobei das verbleibende Volumen aus doppelt destilliertem Wasser besteht. Die qRT-PCR wurde mit drei technischen Replikaten durchgeführt, auf deren Grundlage der Standardfehler berechnet wurde.

Sequenzanalyse: Die Sequenzen wurden über CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., USA) bearbeitet und manuell zusammengesetzt.

ITS-Sequenzen von GenBank wurden über das Hidden-Markov-Modell (HMM) annotiert, um die ITS2-Sequenzen zu erhalten (Keller et al., 2009). Die Sequenzen wurden dann von der MEGA 5.0-Software über die "Muscle"-Ausrichtungsmethode ausgerichtet (Edgar, 2004; Tamura et al., 2011).

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BEFUND

Entwicklung von Nukleotidsignaturen und artspezifischen Primerpaaren für Cistanches Herba und Verfälschungsmittel

Die PCR-Amplifikations- und Sequenzierungserfolgsraten der 251 Proben betrugen 100%, wenn das Primerpaar 2F/3R verwendet wurde. Die ausgerichtete Länge der Cy. Songaricum ITS2-Sequenzen betrugen 229 bp (Ergänzende Abbildung S1). Die Analyse der Sequenzen der Herbararten und der eng verwandten Arten, die von GenBank (Ergänzende Tabelle S2) abgerufen wurden, ergab zwei Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP) -Stellen für Cy. Songaricum. Auf der Grundlage der SNPs wurde ein Cy. Songaricum-spezifische 30-BP-Nukleotidsignatur (5′-caattatttg aggtgcattg taagaagcgt-3') wurde entwickelt (Abbildung 2A). Die Ergebnisse des Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) in NCBI zeigten, dass diese Nukleotidsignatur für Cy einzigartig war. Songaricum (Tabelle 5). Mit einer ähnlichen Analyse der Sequenzen von eng verwandten Arten wurden ein bis zwei SNPs von Ci entdeckt. sinensis, B. rossica und O. coerulescens. Auf der Grundlage der SNPs wurden auch die Nukleotidsignaturen für die anderen drei Verfälschungsmittel ähnlich entwickelt, einschließlich einer 34-bp-Signatur (5′-cgatggtctc ccgtggcga,ggatgcacgg ccgg-3′) für Ci. Sinensis, eine 37-bp-Signatur (5′- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') für B. rossica und eine 31-bp-Signatur (5′-gtctctcgtg tcggatggtg ttgctgttg g-3′) für O. coerulescens (Abbildungen 2BD). Die BLAST-Analyse in NCBI ergab auch, dass diese Nukleotidsignaturen spezifisch waren und bei keiner anderen Spezies vorhanden waren (Tabelle 5).

Cistanches Herbaund seine Verfälschungsmittel könnten gleichzeitig aus Gemischen über das 2F/3R-Universalprimerpaar verstärkt werden. Daher haben wir speziesspezifische Primer für die Nukleotidsignaturverstärkung entwickelt, indem wir die ITS2-Sequenzen ausgerichtet haben. Vier spezifische Primerpaare – SYF1/SYR1, CCRF/CCRR, SCRF/SCRR und LDF/LDR – wurden entwickelt, um die Nukleotidsignaturen von Cy zu verstärken. Songaricum, B. rossica, Ci. sinensis bzw. O. coerulescens (Tabelle 4). Die Längen der Amplicons betrugen 123, 72, 131 bzw. 71 bp.

Zusätzlich wurden insgesamt 214 ITS2-Sequenzen aus experimentellen Cistanches Herba-Materialien analysiert. Zwei kurze spezifische Primer – HMRCF/HMRCR und GHRCF/GHRCR für Ci. deserticola und Ci. Tubulosen wurden entwickelt, um die kurzen Bereiche der abgebauten Proben zu verstärken (Tabelle 4). Die Längen der Amplicons betrugen 132 bzw. 134 bp.

Validierung der Nukleotidsignatur- und artspezifischen Primermethode auf Basis künstlicher Mischungen und Abkochung

Die Verstärkungswirkungsgrade der neuen Primerpaare wurden aus der Mischung validiert. PCR-Produkte wurden über jedes Primerpaar für jede Zielspezies erhalten, wie gezeigt

cq-Werte von B. rossica oder O. coerulescens konnten erhalten werden, obwohl der Anteil der Proben 30000:1 oder 40000:1 betrug, und die Amplifikationsergebnisse von Ci. sinensis, Ci.Tubulosa, und Ci deserticola konnte nachgewiesen werden, wenn das Verhältnis 20000:1 war. Für Cy konnten jedoch keine nachweisbaren Ergebnisse erzielt werden. Songaricum, wenn es den Anteil von 20000:1 ausmachte.

Um zu überprüfen, ob die Nukleotidsignaturmethode mit verarbeiteten Materialien funktioniert, werden Abkochungen von Ci. deserticola und Cy. Songaricum wurden vorbereitet. Die Ergebnisse zeigten, dass der Kurz-Barcode von Ci. Deserticola konnte verstärkt werden, auch nachdem die Proben für 210 min gekocht wurden. Darüber hinaus ist die Nukleotidsignatur von Cy. Songaricum konnte verstärkt werden, nachdem die Proben 150 min lang gekocht wurden, während nach dem Kochen der Proben für 210 oder 240 min keine PCR-Produkte nachgewiesen wurden (Abbildung 4). Die Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass die kurze Nukleotidsignatur erfolgreich aus der Abkochung gewonnen wurde.

Marktstudie zu Verfälschungen mittels Nukleotidsignatur und spezifischen Primern

Die obige Methode wurde für die Erkennung vonZistanchesHerba-Produkte auf dem Markt. Fünfunddreißig Chargen vonZistanchesHerba-Scheiben, -Pulver und -Extrakte wurden unter Verwendung von sechs speziellen Grundierungen verstärkt und sequenziert (die Ergebnisse der Agarosegelelektrophorese sind in Ergänzungsabbildung S2 dargestellt und die Sequenzen sind in Ergänzungsdatenblatt 1 aufgeführt). Die Analyse der Sequenzen über ihre Nukleotidsignaturen ergab, dass fünf Chargen von Scheiben authentisch waren. Eine Scheibencharge und eine Pulvercharge wurden durch Cy ersetzt. Songaricum und ein Extrakt wurden durch Ci ersetzt. Sinensis. Die anderen sechs Chargen von Pulvern waren Mischungen: fünf wurden mit Cy. songaricum und Ci. sinensis und eine wurden mit Cy. Songaricum (Tabelle 1). Zusätzlich wurde eine Scheibencharge durch Salvia miltiorrhiza ersetzt.

Die Cistanches Herba in chinesischen Patentarzneimitteln unterliegen verschiedenen Prozessen, die die Authentifizierung erschweren. Die Fähigkeit der sechs Primerpaare, die speziesspezifischen Nukleotid-Signaturregionen aus den chinesischen Patentarzneimitteln zu verstärken, wurde getestet (die Ergebnisse der Agarosegelelektrophorese sind in Ergänzender Abbildung S2 dargestellt). Die meisten chinesischen Patentarzneimittel enthalten Bestandteile verschiedener Artenarten. Zum Beispiel enthalten Shihu Yeguang Pillen (ZCY34) 25 Inhaltsstoffe, darunter Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu) und Ginseng Radix et Rhizoma (Ren Shen). Aus diesen Inhaltsstoffen konnte Cistanches Herba gezielt über das Primerpaar GHRCF/GHRCR verstärkt werden. Die direkte Sequenzierung der PCR-Produkte ergab sehr saubere Spuren. Ein sichtbares Band konnte jedoch mit dem Primerpaar HMRCF/HMRCR nicht erhalten werden.

Ein weiteres Beispiel sind Kangguzhi Zengsheng Pillen (ZCY44). Es gibt acht Zutaten zusätzlich zuZistanchesHerba in dieser chinesischen Patentmedizin, aber es gab keine sichtbaren Banden, die entweder von GHRCF / GHRCR oder HMRCF / HMRCR erhalten wurden, was bedeutete, dass keineCistanches Herbawar anwesend. Die verfälschende Region von Cy. Songaricum wurde erfolgreich durch das spezifische Primerpaar SYF1/SYR1 verstärkt. Die Sequenzierungsergebnisse zeigten die kurze Nukleotidsignatur von Cy. Songaricum wurde erfolgreich erworben.

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