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Yasaman Alaghbanda,b,c, Janine L. Kwapisa,b,d, Alberto J. Lópeza,b,c, André O. Whitea,b,c,3, Osasumwen V. Aimiuwua,b,c,1, Amni Al- Kachaka,b,c,2, Kasuni K. Bodinayakea,b,c,

Nicole C. Oparaugoa, b, c, Richard Danga, b, d, Mariam Astarabadia, b, c, 4, Dina P. Matheosa, b, und Marcelo A. Wooda, b, c, d

a301 Qureshey Research Lab, Abteilung für Neurobiologie und Verhalten, Zentrum für die

Neurobiologie des Lernens uErinnerung, University of California, Irvine, Irvine, Kalifornien, 92697 Zentren für die Neurobiologie des Lernens undErinnerung(CNLM), Irvine, Kalifornien, 92697 c

Irvine Center for Addiction Neuroscience (ICAN), University of California, Irvine, Kalifornien, 92697d Institut fürErinnerungBeeinträchtigungen und neurologische Störungen, University of California, Irvine,

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Abstrakt

Histon-Deacetylasen (HDACs) sind Chromatin-modifizierende Enzyme, die als starke negative Regulatoren von involviert sindErinnerungProzesse. Es wurde gezeigt, dass HDAC3 eine zentrale Rolle im Langzeitgedächtnis für die Objektlokalisierung sowie die Auslöschung von Kokain-assoziierten Proteinen spieltErinnerung, aber es ist unklar, ob diese Funktion von der Deacetylase-Domäne von HDAC3 abhängt. Hier haben wir getestet, ob die Deacetylase-Domäne von HDAC3 eine Rolle bei der Objektlokalisierung spieltErinnerungBildung sowie die Bildung und Löschung von Kokain-assoziierten Erinnerungen. Unter Verwendung einer Deacetylase-Totpunkt-Mutante von HDAC3 fanden wir heraus, dass die selektive Blockierung der HDAC3-Deacetylase-Aktivität im dorsalen Hippocampus das Langzeitgedächtnis für die Objektlokalisierung verbesserte, aber keinen Einfluss auf die Bildung des Kokain-assoziierten Gedächtnisses hatte. Als derselbe Punktmutantenvirus von HDAC3 in den prälimbischen Kortex infundiert wurde, konnte er Kokain-assoziierte Viren nicht beeinflussenErinnerungFormation. In Bezug auf die Extinktion hatte die Beeinträchtigung der HDAC3-Deacetylase-Domäne im infralimbischen Kortex keine Auswirkung auf die Extinktion, aber ein erleichterter Extinktionseffekt wurde beobachtet, als das Punktmutantenvirus in den dorsalen Hippocampus gebracht wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Deacetylase-Domäne von HDAC3 langfristig eine selektive Rolle in bestimmten Hirnregionen spieltErinnerungBildung von Objektort sowie Kokain-assoziiertErinnerungEntstehung und Untergang.

Schlüsselwörter

Langzeitgedächtnis; Epigenetik; Chromatin; Objektort; bedingte Ortspräferenz; dorsaler Hippocampus

Einführung

Die Histonacetylierung ist ein gut untersuchter Chromatin-modifizierender Mechanismus, der an der Regulation der erforderlichen Genexpression beteiligt istErinnerung. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Histonacetylierung langfristig beteiligt istErinnerungBildung (z. B. in Levenson und Sweatt, 2006; McQuown und Wood, 2011; Gräffand Tsai, 2013; Peixoto und Abel, 2013; Penney und Tsai 2014). Die Histonacetylierung wird durch Histonacetyltransferasen und Histondeacetylasen (HDACs) durchgeführt, die im Allgemeinen die Genexpression erleichtern bzw. unterdrücken (Jenuwein und Allis 2001; Kouzarides, 2007). Histon-Deacetylase 3 (HDAC3) ist das am stärksten exprimierte Klasse-I-HDAC im Gehirn, und dieses spezifische HDAC ist ein starker negativer Regulator von Lern- und Gedächtnisprozessen (Kwapis et al., 2017; Malvaez et al., 2013; McQuown et al ., 2011; Rogge et al., 2013). Unser Labor hat gezeigt, dass HDAC3 eine entscheidende Rolle bei der Objektlokalisierung und der angstbezogenen Gedächtnisbildung spielt (McQuown et al., 2011; Kwapis et al., 2017), indem es Hippocampus- und Amygdala-spezifische HDAC3-Manipulationen verwendet. Wir haben auch gezeigt, dass die HDAC3-Hemmung das Aussterben des Drogensuchverhaltens auf eine Weise erleichtert, die die Wiederaufnahme blockiert (Malvaez et al., 2013). Die Extinktionsexperimente in Malvaez et al. (2013) verwendeten einen selektiven HDAC3-Inhibitor, der systemisch verabreicht wurde, daher konnten wir nicht identifizieren, welche Gehirnregionen für die HDAC3--abhängige Modulation der Extinktion am wichtigsten sind.

HDAC3 selbst hat eine starke Deacetylase-Aktivität (Guenther et al., 2002; Lahm et al., 2007; Zhang et al., 2002), und es assoziiert mit HDAC4/HDAC5 über Wechselwirkungen mit dem Co-Repressor Nuclear Receptor Corepressor (NCoR). bilden einen funktionellen Multiprotein-Repressorkomplex (Guenther et al., 2001; Fischle et al., 2002; Alenghat et al., 2008). Eine Idee ist, dass diese Multiproteinkomplexe für die Deacetylierung erforderlich sein könnten, da HDAC4 wenig bis gar keine katalytische Aktivität auf kanonische Acetyl-Lysin-Substrate hat (Lahm et al., 2007). Es wurde gezeigt, dass HDAC4 moduliertErinnerungunabhängig von seiner Deacetylase-Domäne (Sando et al., 2012). Außerhalb des Lernbereichs uErinnerung, HDAC3--vermittelte Genexpression in anderen Geweben erfordert nicht unbedingt die enzymatische Funktion von HDAC3 (Sun et al., 2013), was darauf hindeutet, dass die Deacetylase-Aktivität von HDAC3 möglicherweise nicht für die Gedächtnisbildung erforderlich ist. Bis vor kurzem war die Deacetylase-Aktivität von HDAC3 bei der Gedächtnisbildung nicht direkt getestet worden. Kwapis und Kollegen (2017) zeigten, dass tatsächlich die enzymatische Aktivität von HDAC3 für Amygdala-abhängige Formen erforderlich istErinnerungFormation.

Frühere Studien hatten gezeigt, dass die systemische Verabreichung eines HDAC3-Inhibitors sowohl die Bildung der Objektlokalisierung erleichtern könnteErinnerung(OLM) sowie das Aussterben von Kokain-Kontext verbundenErinnerung(Malvaez et al., 2013). Ob jedoch die Deacetylase-Aktivität von HDAC3 für die Objektlokalisierung erforderlich istErinnerungOLM im Hippocampus und die Auslöschung des kokainkontextassoziierten Gedächtnisses im infralimbischen Kortex bleiben unklar. In der aktuellen Studie zielten wir speziell auf die Deacetylase-Aktivität von HDAC3 in der Hippocampus-abhängigen Gedächtnisbildung sowie im dorsalen Hippocampus (DH), prälimbischen Kortex (PrL) und infralimbischen Kortex (IL) im Hinblick auf den Erwerb und die Auslöschung von ab kokainbedingte Ortspräferenz oder kokainbedingter KontextErinnerungProzesse.

Materialen und Methoden

Themen

Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California, Irvine, genehmigt und entsprachen den Richtlinien der National Institutes of Health. Die Mäuse waren 8–12 Wochen alt und hatten Zugang zu Futter und Wasser nach Belieben in ihren Heimkäfigen, wobei die Beleuchtung auf einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten wurde. Verhaltenstests wurden während des leichten Teils des Zyklus durchgeführt. Die Testpersonen waren erwachsene männliche C57BL/6J-Mäuse für die AAV-HDAC3(Y298H)-v5-Experimente. Für das HDAC3-flox-Deletionsexperiment wurden Hdac3flox/flox- und Wildtyp-Hdac3 plus/plus-Wurfgeschwistermäuse auf einem C57BL/6J-Hintergrund gehalten (Mullican et al., 2011). Kurz gesagt, diese Mäuse wurden im Labor von Dr. Mitch Lazar an der University of Pennsylvania (Philadelphia, PA) mit loxP-Stellen erzeugt, die Exon 4 bis Exon 7 des Hdac3-Gens flankieren, eine Region, die für die katalytische Aktivität des Enzyms erforderlich ist (Mullican et a., 2011).

Drogen

Kokain-HCl wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) gekauft und in Kochsalzlösung (0,9 Prozent NaCl) gelöst. Kokain-HCl wird als Gewicht des Salzes ausgedrückt. Für das Kokain-CPP-Training in den Erwerbsexperimenten wurde Kokain-HCl auf eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml gelöst und in einem Volumen von 10 ml/kg Körpergewicht verabreicht, was zu einer Enddosis von 5 führte mg/kg. Für das Kokain-CPP-Training im Extinktionsexperiment wurde Kokain-HCl auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml gelöst und in einem Volumen von 10 ml/kg Körpergewicht verabreicht, was eine Enddosis von 20 mg/kg ergab. Kokain-HCl und Kochsalzlösung wurden intraperitoneal (ip) verabreicht.

Chirurgie

Mäuse wurden mit 4 Prozent Isofluran in Sauerstoff induziert und für die Dauer der Operation bei 1,5–2,0 Prozent gehalten. Den Tieren wurde entweder AAV-HDAC3(Y298H)-v5 oder AAV-EV (leerer Vektor) injiziert (Kwapis et al., 2017). Für die DH-Experimente wurde 1 µl Virus bilateral infundiert. Für die prälimbischen und infralimbischen Experimente wurden 0,3 µl Virus bilateral infundiert. Immunfluoreszenz wurde verwendet, um die Expression von HDAC3(Y298H) zu bestätigen. Injektionsnadeln wurden mit einer Geschwindigkeit von 0,2 mm/15 s auf die gewünschten Koordinaten abgesenkt. {{20}}min nach Erreichen der Zieltiefe wurde Virus mit einer Rate von 6 µl/h injiziert. Nach der Infusion wurden die Injektionsnadeln für 2- min an Ort und Stelle belassen, damit sich das Virus ausbreiten konnte. Die Injektoren wurden dann um 0,1 mm angehoben und für eine weitere Minute ruhen gelassen, bevor sie langsam entfernt wurden (0,1 mm/15 s). Der Schnitt wurde vernäht und es wurden 2 Wochen für die volle Virusexpression vor dem Verhalten zugelassen. Die Viren wurden mit dualen 28-Gauge-Infusoren (DH: 3 mm Mitte-zu-Mitte; PrL/IL: 0,8 mm Mitte-zu-Mitte) infundiert, die an PE50-Schläuchen befestigt und mit Hamilton-Spritzen verbunden waren an Infusionspumpen montiert. Koordinaten für die DH waren: AP, –2,0 mm; ML, ±1,5 mm; DV, –1,5 mm relativ zu Bregma. Koordinaten für die PrL waren: AP, plus 1,9 mm; ML, ±0,4 mm; DV, –2,2 mm relativ zu Bregma. Koordinaten für die IL waren: AP, plus 1,5; ML, ±0,4 mm; DV, –3,2 mm relativ zu Bregma.

AAV-Produktion

Wildtyp-HDAC3 wurde aus Maus-Hippocampus-cDNA amplifiziert und in ein modifiziertes pAAV-IRES-hrGFP (Agilent) unter der Kontrolle des CMV-Promotors und -Globin-Introns kloniert. Um die Punktmutation zu erzeugen, wurde eine einzelne Nukleotidsubstitution in Exon 11 zur direkten Produktion eines Histidinrests anstelle von Tyrosin bei Aminosäure 298 erzeugt (Plasmid MW92). Bei der leeren Vektorkontrolle war die HDAC3-kodierende Sequenz nicht vorhanden, aber alle anderen Elemente blieben (Plasmid MW87). Adeno-assoziiertes Virus (AAV) wurde vom Penn Vector Core (University of Pennsylvania) aus den oben beschriebenen Plasmiden hergestellt und mit AAV 2.1 serotypisiert. Der Endtiter von AAV-HDAC3(Y298H) war 6,48 × 1012 GC/ml und der Endtiter von AAV-EV war 1,35 × 1013 GC/ml.

Immunfluoreszenz

In den in den Abbildungen 2–7 gezeigten Verhaltensexperimenten hatte jedes Tier, das in die Verhaltensanalysen einbezogen wurde, eine virale Infusion, die durch Immunhistochemie bestätigt wurde. Mäuse wurden durch zervikale Dislokation eingeschläfert und ihre Gehirne wurden entfernt und in eiskaltem Isopentan schockgefroren. 20-µm-Scheiben wurden während der IL/PrL oder DH gesammelt, auf Objektträgern aufgetaut und bis zur Verwendung bei -80 Grad gelagert. Für die Immunfluoreszenzanalyse wurden die Objektträger mit 4 % Paraformaldehyd für 10 Minuten fixiert und in 0,01 % Triton X-100 in 0,1 M PBS für 15 Minuten permeabilisiert. Die Objektträger wurden dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur in 8 Prozent normalem Ziegenserum (Jackson) blockiert und über Nacht bei 4 Grad in primärem Antikörper (HDAC3-Klon Y415-Antikörper: 1:250; Abcam) inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Objektträger für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa 488 (1:1 000 Verdünnung, Invitrogen) im Dunkeln inkubiert, gefolgt von entweder einer 15--minütigen DAPI-Inkubation (1: 10.000, Invitrogen; DH). Für die Experimente, in denen rot fluoreszierender Nissl-Farbstoff NeuroTrace (1:50 NeuroTrace 530/615; Life Technologies) verwendet wurde, wurden die Objektträger 50 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von zwei Waschgängen in 0,01 % Triton-X-100 für 5 Minuten und dann zweimal 5 Minuten in PBS gewaschen. Die Objektträger wurden unter Verwendung von VectaShield Antifade-Eindeckmedium (Vector Laboratories) eingedeckt.

Alle Bilder wurden mit einem Olympus Scanner VS110 mit einem 20× apochromatischen Objektiv (numerische Apertur 0,75) mit VS110-Scannersoftware aufgenommen. Alle Behandlungsgruppen wurden auf jedem Objektträger dargestellt und alle Bilder auf einem Objektträger wurden mit der gleichen Belichtungszeit aufgenommen. Die Intensität der Immunmarkierung wurde mit ImageJ quantifiziert, indem die optische Dichte in der Zellschicht von CA1, normalisiert auf den Hintergrund, abgetastet wurde.

Quantitative RT-PCR

Quantitative Echtzeit-RT-PCR wurde durchgeführt, um die V5-Expression und die Hochregulierung der Wildtyp-Hdac3mRNA-Expression nach AAV-HDAC3(Y298H)-Infusion (Experiment 1) wie zuvor beschrieben zu verifizieren (López et al., 2016; White et al., 2016). Für Experiment 1 wurden 1-mm-Stanzungen in der DH aus 500-μm-Schnitten im Bereich der viralen Expression (oder einer äquivalenten Region bei EV-Mäusen) gesammelt, wie durch Immunfluoreszenz bestätigt wurde. Das gesamte Gewebe wurde bis zur Verarbeitung bei –80 Grad gelagert.

RNA wurde mit einem RNeasy Minikit (Qiagen) isoliert und cDNA wurde mit dem Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Applied Science) erzeugt. Die folgenden Primer wurden verwendet, abgeleitet von der Roche Universal ProbeLibrary: Hdac3right-Primer, 5'-ttcaacgtgggtgatgactg-3'; Hdac3linker Primer, 5'-ttagctgtgttgctccttgc-3'; Sonde, ctgctccc; Hdac3-v5rechter Primer, 5'-tggagattctcgagggtaagc-3'; Hdac3-v5linker Primer, 5'-atgccaccgtagatctgg-3'; Sonde, ctctcctc. Jede der Sonden für diese Zielgene wurde an den Farbstoff FAM konjugiert. Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (Gapd) wurde als Referenzgen für alle RT-qPCR-Assays verwendet. Für Gapd haben wir die folgenden Primer verwendet: linker Primer, 5'atggtgaaggtcggtgtga-3'; rechter Primer, 5-aatctccactttgccactgc-3'; Sonde, tggcggtattgg. Die Gapdprobe wurde mit LightCycler Yellow 555 konjugiert. Die nicht überlappenden Farbstoffe und Quencher auf dem Referenzgen ermöglichen Multiplexing in den Roche LightCycle 480 II-Maschinen (Roche Applied Sciences). Alle Werte wurden auf Gapd-Expressionsniveaus normalisiert. Analysen und Statistiken wurden unter Verwendung der proprietären Roche-Algorithmen und der Software REST 2009 basierend auf der Pfaffl-Methode (Pfaffl 2001; Pfaffl et al., 2002) durchgeführt.

OLM- und ORM-Aufgaben

Für OLM und neuartige ObjekterkennungErinnerung(ORM), Gewöhnungsdaten (zurückgelegte Strecke während einzelner Gewöhnungssitzungen), Trainings- und Testvideos wurden mit der Verhaltensanalysesoftware ANY-maze gesammelt. Training und Tests für OLM und ORM wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (López et al., 2016; McQuown et al., 2011; Vogel-Ciernia et al., 2013; Vogel-Ciernia und Wood, 2014). Vor dem Training wurden die Mäuse 1–2 min für 4 d behandelt und 5 min an die OLM-Kammer für 6 aufeinanderfolgende Tage in Abwesenheit von Objekten an die experimentelle Vorrichtung gewöhnt. Während des Trainingsversuchs wurden Mäuse mit zwei identischen Objekten (OLM: 100-ml-Becher, 2,5 cm Durchmesser, 4 cm Höhe; ORM: Gewürzdosen und Glaskerzenhalter) in die Versuchsapparatur gesetzt und durften diese Objekte 3 min lang erkunden , was weder kurz- noch langfristig zur Folge hatErinnerung. Wir haben zuvor gezeigt, dass eine 3-minütige Trainingszeit nicht ausreicht, um LTM zu erzeugen, die nach 24 h getestet wurde (Haettig et al., 2011, 2013; López et al., 2016; McQuown et al., 2011; Stefanko et al., 2009). . 24 Stunden später wurde die Retention der Tiere für 5 min getestet. Für OLM wurde eine Kopie des vertrauten Objekts an der gleichen Stelle wie während des Trainingsversuchs platziert, und eine Kopie des vertrauten Objekts wurde in der Mitte der Box platziert. Für ORM wurde eine Kopie des vertrauten Objekts und ein neues Objekt an der gleichen Stelle wie während des Trainingsversuchs platziert. Alle Trainings- und Testversuche wurden von Personen, die gegenüber Tierbehandlungen blind waren, auf Video aufgezeichnet und von Hand bewertet. Videos wurden zusätzlich zum Diskriminationsindex (DI) [(Zeit, die mit der Erforschung eines neuen Ziels verbracht wurde, die mit der Erforschung eines bekannten Objekts verbracht wurde)/(Gesamtzeit mit der Erforschung beider Objekte) × 100 Prozent] auf die Gesamterkundung von Objekten analysiert. Alle Kombinationen und Standorte von Objekten wurden in ausgewogener Weise verwendet, um potenzielle Verzerrungen zu reduzieren, die auf eine Präferenz für bestimmte Standorte oder Objekte zurückzuführen sind.

Bedingter Platzpräferenzapparat

Die Platzierungskonditionierung wurde wie zuvor in unseren Studien beschrieben durchgeführt (Malvaez et al., 2011; Rogge et al., 2013; White et al., 2016). Kurz gesagt, Mäuse wurden 3 Tage vor Beginn des Experiments (Tage 1–3) jeden Tag 1 Minute behandelt. Das CPP-Verfahren für alle Experimente wurde unter Verwendung eines unvoreingenommenen, ausgeglichenen Protokolls durchgeführt. Grundlinienpräferenzen für jedes der Experimente wurden bewertet, indem die Tiere in das mittlere Abteil der Platzpräferenzvorrichtung gesetzt wurden und 15 Minuten lang freier Zugang zu allen Abteilen gewährt wurde (Vortest; Tag 4). Die Trainingsphase begann einen Tag nach dem Vortest. Die Konditionierung wurde über die folgenden 4 Tage bei geschlossenen Guillotinentüren durchgeführt, wodurch die Tiere für 30 min (Tage 5–8) auf eine der beiden äußeren Kammern der CPP-Vorrichtung beschränkt wurden. Es wurde ein unvoreingenommenes Design verwendet, so dass die Hälfte der Tiere Kokain vor dem Einsetzen in das karierte Abteil und die andere Hälfte Kokain vor dem Einsetzen in ein weißes Abteil am Trainingstag 1 (CS plus ) erhielt. Am nächsten Tag wurden Behandlung und Abteil für jedes Tier vertauscht (Trainingstag 2), den Mäusen wurde Kochsalzlösung injiziert, bevor sie in das alternative Abteil (CS–) platziert wurden. Die Injektionen wurden für nachfolgende Konditionierungssitzungen geändert. Für die in den Fign. 3–5 erhielten die Tiere insgesamt zwei 30--Minuten-Paarungen mit Kokain in einem Kompartiment und zwei 30--Minuten-Paarungen mit Kochsalzlösung im anderen. Achtundvierzig Stunden nach der letzten Konditionierungssitzung wurde die Präferenz (15 min; Nachtest 1; Tag 10) bei allen Tieren wie oben beschrieben in einem wirkstofffreien Zustand bewertet. Für die in den Abbn. 6–7 wurden die Tiere konditioniert, gefolgt von 1 48 Stunden nach der letzten Konditionierungssitzung, wie oben beschrieben. Zwei Wochen nach der viralen Infusion in die DH oder IL wurden die Tiere täglich wiederholten arzneimittelfreien Präferenztests unterzogen (15 min; Nachtests 2–5; Tage 25–28). Der CPP-Score wurde als Zeit (s) berechnet, die in Kokain-gepaarten (CS plus) minus Kochsalzlösung-gepaarten (CS–) Kompartimenten verbracht wurde. Die in jedem der großen Außenfächer verbrachte Zeit wurde durch automatisierte Software aus MPEG-Videos unter Verwendung der Software EthoVision 3.1 (Noldus Technology; siehe Malvaez et al., 2011) analysiert.

Statistische Analyse

Graphpad Prism 7.02 (GraphPad Software) wurde für alle statistischen Analysen verwendet.

Die Gewöhnung wurde unter Verwendung einer zweifachen ANOVA analysiert, um die Gesamtstrecke zu vergleichen, die über die Gewöhnungssitzungen zurückgelegt wurde. Trainings- und Testdaten wurden unter Verwendung eines Student's t-Tests analysiert, um entweder Exploration oder DI zwischen Kontroll- und Testtieren zu vergleichen. Die Testdaten wurden auch unter Verwendung eines einseitigen t-Tests analysiert, bei dem die DI-Werte mit Null verglichen wurden, um zu bestimmen, ob eine signifikante Diskriminierung beobachtet wurde oder nicht. CPP-Experimente wurden unter Verwendung von zweifacher Varianzanalyse (ANOVAs), gefolgt von Bonferroni-Posthoc-Tests mit Präferenzwerten (PS) bei Tests als Innersubjektvariablen und Gruppe/Genotyp (leerer Vektor vs. Y298H-Punktmutante; Hdac3 plus / plus vs. Hdac3flox/flox). Dieser statistische Test wurde verwendet, um spezifische Vergleiche anzustellen, wenn signifikante Wechselwirkungen und/oder Hauptgruppeneffekte beobachtet wurden. Die Testdaten wurden auch unter Verwendung eines einseitigen t-Tests analysiert, bei dem die PS-Werte mit Null verglichen wurden, um zu bestimmen, ob eine signifikante Präferenz beobachtet wurde oder nicht. Für Extinktionsexperimente wurden zuerst Student's t-Tests durchgeführt, um zu bestimmen, ob Tiere eine signifikante Präferenz für Post-Test 1 vor der viralen Infusion bildeten. RT-qPCR-Werte wurden wie oben beschrieben erhalten. Unterschiede in den RT-qPCR-Werten wurden mit Student's t-Tests bewertet. Für alle Analysen war für die Signifikanz ein Wert von 0,05 erforderlich.