TEIL 1 Echinacosid induziert eine Vasorelaxation der Pulmonalarterien der Ratte, indem es die NO-cGMP-PKG-BKCa-Kanäle öffnet und die intrazellulären Ca2+-Spiegel reduziert

Wie bewirkt Echinacosid eine venöse Entspannung?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri- li GE1, 2, * 1 Department of Pharmacology, School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 2 Forschungszentrum für Höhenmedizin, Medical College der Qinghai University, Xining 810001, China; 3 School of Pharmacy, Qinghai University for Nationalities, Xining 810007, China; 4 Qinghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xining 810001, China

Ziel:Eine anhaltende pulmonale Vasokonstriktion, wie sie in großer Höhe auftritt, kann zu pulmonaler Hypertonie (PH) führen. Der Hauptzweck dieser Studie ist es, die gefäßerweiternde Wirkung von zu untersuchenEchinacosid(ECH), ein Phenylethanoidglykosid aus dem tibetischen Kraut Lagotis brevituba Maxim undCistanche tubulosa, über die Pulmonalarterie und ihren möglichen Mechanismus.

Methoden:Von männlichen Wistar-Ratten erhaltene Lungenarterienringe wurden in mit Krebs-Henseleit-Lösung gefüllten Organkammern aufgehängt, und die isometrische Spannung wurde unter Verwendung eines Kraftwandlers gemessen. Die intrazellulären Ca2+-Spiegel wurden in kultivierten pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen (PASMCs) von Ratten unter Verwendung von Fluo 4-AM gemessen.

Ergebnisse: EM(30–300 μmol/l) entspannte durch Noradrenalin (NE) vorkontrahierte Lungenarterien der Ratte in einer konzentrationsabhängigen Weise, und dieser Effekt konnte sowohl in intaktem Endothel als auch in Endothel-denudierten Ringen beobachtet werden, jedoch mit einer signifikant niedrigeren maximalen Reaktion und a höhere EC50 in Endothel-denudierten Ringen. Dieser Effekt wurde durch L-NAME, TEA und BaCl2 signifikant blockiert. IMT, 4-AP und Gli hemmten jedoch nichtEM-induzierte Entspannung. Unter extrazellulären Ca2+-freien Bedingungen wurde die maximale Kontraktion auf 24,54 Prozent ± 2,97 Prozent und 10,60 Prozent ± 2,07 Prozent in Ringen reduziert, die mit 100 bzw. 300 μmol/l ECH behandelt wurden. Unter Bedingungen des extrazellulären Calciumeinstroms wurde die maximale Kontraktion auf 112,42 % ± 7,30 %, 100,29 % ± 8,66 % und 74,74 % ± 4,95 % in Ringen reduziert, die mit 30, 100 bzw. 300 μmol/l ECH behandelt wurden. Nachdem die Zellen mit Fluo 4-AM beladen wurden, war die mittlere Fluoreszenzintensität bei den damit behandelten Zellen niedrigerEM(100 μmol/L) als bei NE.

Fazit: EMunterdrückt die NE-induzierte Kontraktion der Pulmonalarterie der Ratte durch Verringerung der intrazellulären Ca2+-Spiegel und induziert seine Entspannung durch den NO-cGMP-Weg und die Öffnung von K+-Kanälen (BKCa und KIR).

Schlüsselwörter:Tibetisches Kraut;Echinacosid; pulmonale Hypertonie; Hohe Höhe; Vasorelaxation; NEIN; BKCa; KIR; Arterienring; pulmonalarterielle glatte Muskelzellen.

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Einführung

Eine anhaltende pulmonale Vasokonstriktion, wie sie in großer Höhe auftritt, kann zu pulmonaler Hypertonie (PH) und medialer Hypertrophie führen[1], die als Hauptursache für rechtsventrikuläre Hypertrophie und Herzinsuffizienz identifiziert wurden[2]. Personen, die vorübergehend oder dauerhaft in großer Höhe leben, können eine leichte bis mäßige pulmonale Hypertonie aufweisen, und Personen mit einer größeren Anfälligkeit für Hypoxie können eine übertriebene pulmonale Vasokonstriktion aufweisen, was zu verschiedenen Höhenkrankheiten führt, die mit erheblicher Morbidität und Mortalität verbunden sind, wie z Höhenlungenödem und Herzerkrankungen[3].Echinacosid(ECH) (Abbildung 1) ist einPhenylethanoidglykosidgefunden in einer Vielzahl von chinesischen Kräutern wie dem tibetischen Kraut Lagotis brevituba Maxim undCistanche tubulosa[4, 5]. Lagos brevituba Maxim ist eine Art von Lagotis spp, die zu den Scrophulariaceae gehört und weit verbreitet in einer Höhe von über 3000 Metern auf dem Qinghai-Tibet-Plateau wächst.EMhat verschiedene wünschenswerte pharmakologische Eigenschaften, wie z. B. antioxidative, entzündungshemmende, neuroprotektive, hepatoprotektive und Stickoxid (NO)-radikalfangende Eigenschaften[6]. Es kann auch eine Endothel-abhängige Entspannung in thorakalen Aortenringen von Ratten hervorrufen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen heilen[7]. Nach unserem besten Wissen gab es jedoch keine Studie, die seine Auswirkungen auf den Gefäßtonus in Lungenarterien untersuchte. Die Zwecke dieser Studie sind wie folgt: (1) zu untersuchen, ob ECH in vitro Vasorelaxation in mit Noradrenalin (NE) vorkontrahierten Lungenarterien von Ratten induziert und ob diese Wirkung, falls vorhanden, Endothel-abhängig ist oder direkt auf die glatte Gefäßmuskulatur wirkt ; (2) um die Wirkung von ECH auf den extrazellulären Calciumeinstrom und die intrazelluläre Calciumfreisetzung in glatten Muskelzellen der Pulmonalarterien der Ratte (PASMCs) zu untersuchen; und (3) um mögliche Wege und K plus -Kanäle zu identifizieren, die an der ECH-induzierten Relaxation beteiligt sind.

Materialen und Methoden

Reagenzien

ECH wurde freundlicherweise von Dr. Peng-fei TU der Peking-Universität (Peking, China) zur Verfügung gestellt, mit einer Reinheit von mehr als 98 Prozent, bestimmt durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde von Solar Science & Technology Co, Ltd (Peking, China) gekauft; NE, Acetylcholin (ACh, größer oder gleich 99 Prozent), Indomethacin (IMT), Nω-Nitro-L-Arginin-Methylester-Hydrochlorid (L-NAME), Tetraethylammoniumchlorid (TEA), Bariumchlorid (BaCl2), {{ 9}}Aminopyridin ({{10}}AP) und Glibenclamid (Gli) von Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA); Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, fötales Rinderserum (FBS) und Trypsin von Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, USA); Maus-Anti-Ratte-Primär-Glattmuskel-Aktin (-SMA)-Antikörper und Ziege-Anti-Maus-Sekundär-Antikörper von Boshide Biotech Co, Ltd (Wuhan, China); Fluo Calcium Indicators (Fluo 4-AM) von Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, USA); und alle anorganischen Salze von Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Peking, China). IMT wurde in DMSO gelöst und 5 % NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM und ECH wurden in DMSO gelöst, und alle anderen Reagenzien wurden in Krebs-Henseleit (KH) oder PBS-Lösung gelöst. Vorversuche zeigten, dass DMSO bei weniger als 0,1 Prozent (v/v) keine Wirkung auf die Spannungsentwicklung isolierter Lungenarterienringe hatte.

Versuchstiere

Alle Verfahren und Protokolle wurden vom Animal Care and Use Committee des Medical College der Qinghai University genehmigt. Männliche Wistar-Ratten, 6–8 Wochen alt, 250–300 g Körpergewicht, wurden vom Animal Center der Lanzhou University (Lanzhou, China) gekauft und mit einer Standard-Labordiät und Leitungswasser nach Belieben bei einer Umgebungstemperatur von 22 ± 2°C gehalten 2 Grad und eine relative Luftfeuchtigkeit von 45 Prozent –55 Prozent während der gesamten Experimente.

In-vitro-Lungenarterienperfusion

Präparation von Ratten-Lungenarterienringen

Ratten mit einem Gewicht von 250–300 g wurden durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (40 mg/kg) anästhesiert, und dann wurden ihre Herzen und Lungen entfernt und sofort in eiskalte KH-Lösung eingetaucht, die (in mmol/l) enthielt: : 118 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4·7H2O, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3 und 11,1 Glucose (pH 7,4). Die intrapulmonalen Arterien (0,7–1,5 mm Durchmesser) wurden frei von umgebendem Bindegewebe und Adventitia präpariert und dann in Ringe von etwa 2–3 mm Länge geschnitten. Die Ringe wurden in Organkammern aufgehängt, die mit 10 ml KH-Lösung bei 37 Grad gefüllt und mit 95 % O2–5 % CO2 begast wurden [8], und die isometrische Spannung wurde unter Verwendung eines Kraftaufnehmers (JH-2, Space Medico -Engineering Institute, Peking, China)

Beurteilung der Gefäßringaktivität und Beurteilung der Endothelfunktion

Gefäßringe wurden 2 h unter einer Grundspannung von 400 mg äquilibrieren gelassen, während dieser Zeit wurde die KH-Lösung alle 15 min gewechselt; dann wurde 1 &mgr;mol/l NE in die Kammer gegeben, um die Aktivität jedes Rings durch Erfassen des Kontraktionsprozentsatzes zu bewerten. Vor und nach dem experimentellen Protokoll wurde der Kontraktionsprozentsatz gemessen (Abbildung 2A und 2B). Endothelium wurde in einigen Ringen durch sanftes Reiben der Intimaoberfläche mit einem feinen Stahldraht entfernt, und die Integrität wurde qualitativ anhand des durch ACh (10 μmol/L) verursachten Relaxationsgrades im Prozentsatz des durch NE induzierten kontraktilen Tonus (1 μmol/l). Wenn die Relaxation mit ACh größer als 80 Prozent war, blieb das Endothel in gutem Zustand; wenn die Entspannung weniger als 30 Prozent betrug, wurde das Endothel zerstört (Abbildung 2A und 2B)[9].

Isolierung und Kultur von Ratten-PASMCs

Distale Lungenarterien wurden aus Lungenlappen von Ratten isoliert, und das Endothel und die Adventitia wurden sorgfältig entfernt. Nachdem die Gewebe in {{0}}-mm-Stücke zerkleinert worden waren, wurden sie sofort in die Kolben gegeben, bei 37 Grad und 5 Prozent CO2 in einem befeuchteten Inkubator etwa vier Stunden lang gehalten und dann mit DMEM mit hohem Glukosegehalt kultiviert ergänzt mit 20 Prozent FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin für ungefähr fünf Tage. Die Hälfte des Kulturmediums wurde durch frisches Medium ersetzt, als die Zellen auftauchten. Als die Zellen eine Konfluenz von 80 Prozent erreichten, wurden sie mit 0,125 Prozent Trypsin geerntet und in die Kolben (Verhältnis 1:2) ausgesät, die DMEM mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 Prozent FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin, enthielten . Für alle Experimente wurden Zellen mit drei bis acht Passagen verwendet.

Identifizierung von PASMCs durch Immunhistochemie

PASMCs waren positiv für immunchemische Färbung, wenn typische "Hügel-und-Tal"-Merkmale beobachtet wurden. Die Zellen wurden in 6-Wellplatten mit Glasdeckgläschen ausgesät. Als die Zellen 80 Prozent Konfluenz erreichten, wurden sie in 4 Prozent Paraformaldehyd fixiert, mit 3 Prozent Wasserstoffperoxid für 15 Minuten blockiert und dann mit Maus-Anti-Ratten-Primär-SMA-Antikörper über Nacht bei 4 Grad inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS für 10 min wurden die Zellen mit sekundärem Ziegen-anti-Maus-Antikörper bei Raumtemperatur für 45 min inkubiert, erneut dreimal in PBS für 10 min gewaschen und mit Diaminobenzidin sichtbar gemacht.

Nachweis der intrazellulären Calciumkonzentration in PASMCs der Ratte

PASMCs wurden in {{0}}-Well-Platten mit Deckgläsern aus Glas ausgesät. Als die Zellen eine Konfluenz von 8 0 Prozent erreichten, wurden die Kulturmedien durch serumfreies DMEM ersetzt. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen mit 7 μmol/L Fluo 4-AM bei 37 Grad für 30 Minuten in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 beladen. Der restliche Farbstoff wurde mit Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS) gewaschen, die Folgendes enthielt (in mmol/l): 1,26 CaCl2, 0,49 MgCl2·6H2O, 0,41 MgSO4·7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 und 5,56 D-Glucose, ohne Phenolrot. Mit Fluo 4-AM beladene Zellen wurden einer von drei Behandlungsbedingungen ausgesetzt: (1) der Kontrollgruppe (con-Gruppe), in der Zellen mit serumfreiem DMEM inkubiert wurden; (2) die NE-Gruppe, in der Zellen mit serumfreiem DMEM, ergänzt mit 1 &mgr;mol/l NE, 10 Minuten lang inkubiert wurden; und (3) die NE plus ECH (100 μmol/l)-Gruppe (NE plus ECH100-Gruppe), in der Zellen mit serumfreiem DMEM, ergänzt mit 1 μmol/l NE, für 10 min und 100 μmol/l ECH inkubiert wurden für 20 min. Die Fluoreszenzintensität wurde beobachtet und durch Fluoreszenzmikroskopie fotografiert (IX71, Olympus, Tokyo, Japan)[11]. Für jede Probe wurden sechs Sichtfelder (200x) gesammelt. Die intrazelluläre Calciumkonzentration wurde durch Messen der mittleren Fluoreszenzintensität unter Verwendung der Software Image Pro-Plus 6.0 quantifiziert.

statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Wenn ein angemessener, signifikanter Unterschied durch den Dunnett-Test oder den Student-Newman-Keuls-Test für multiple Vergleiche nach einer einfachen Varianzanalyse (ANOVA) festgestellt wurde. Ein Wahrscheinlichkeitsniveau von P<0.05 was="" considered="">

Ergebnisse Vasorelaxierende Wirkungen von ECH auf isolierte Pulmonalarterien

Zu Versuchsbeginn hatte die kumulative Zugabe von ECH von 30 bis 300 µmol/L keinen signifikanten Effekt auf die Grundspannung der Pulmonalarterie. Nachdem die NE-induzierte Vasokonstriktion ein Plateau erreicht hatte, wurde ECH kumulativ (30–300 μmol/L) zu dem intakten Endothel (E plus , Abbildung 2C) oder den Endothel-entblößten Ringen (E– , Abbildung 2C) hinzugefügt. Bei intakten Endothelringen erweiterte die kumulative Zugabe von ECH die Gefäße konzentrationsabhängig mit einer maxi-

prozentuale Entspannung der Mutter von 89,22 % ±0,32 % bei 300 μmol/L und einem EC50-Wert von 51,60±0,57 μmol/L (Abbildung 2A und 2C). In ähnlicher Weise dilatierte ECH auch in Endothel-denudierten Ringen die Gefäße in einer konzentrationsabhängigen Weise, jedoch mit einer signifikant niedrigeren maximalen Reaktion von 67,72 Prozent ± 1,69 Prozent (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Auswirkungen von ECH auf die intrazelluläre Calciumfreisetzung und den extrazellulären Calciumeinstrom

Die Endothel-denudierten Ringe wurden 1 &mgr;mol/l NE ausgesetzt, bis die maximale Kontraktion erreicht war. Unter extrazellulären Ca 2 plus -freien Bedingungen wurden die Ringe in Ca 2 plus -freier KH-Lösung, die 0,2 mmol/l EGTA enthielt, vor Beginn der Experimente äquilibriert. Nach drei Waschgängen mit Ca2+- und EGTA-freier KH-Lösung wurden die Ringe mit ECH (30, 100 und 300 μmol/l) für 20 min vorinkubiert und dann erneut 1 μmol/l NE ausgesetzt. Die hergestellten Ringe

nicht anhaltende Kontraktionen, die schnell zum Ausgangswert zurückkehrten, verglichen mit den anfänglichen Kontraktionen, die durch NE induziert wurden, die als Referenz dienten. Die maximale Kontraktion der Kontrolle betrug 33,27 Prozent ± 2,94 Prozent (Abbildung 3A und 3E), war jedoch signifikant reduziert auf 24,54 Prozent ± 2,97 Prozent und 10,60 Prozent ± 2,07 Prozent in Ringen, die mit 100 bzw. 300 μmol/l ECH vorbehandelt wurden (P<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Rollen verschiedener Inhibitoren bei der ECH-induzierten Ratten-Lungenarterien-Vasorelaxation

ECH-induzierte Ratten-Lungenarterien-Vasorelaxation wurde in Anwesenheit oder Abwesenheit der folgenden Inhibitoren untersucht: L-NAME (eNOS-Inhibitor), IMT (Cyclooxygenase-Inhibitor), TEA (großleitfähiger Ca2 plus -aktivierter K plus-Kanal-Inhibitor), BaCl2 ( Einwärtsgleichrichter K plus Kanalinhibitor), 4-AP (spannungsabhängiger K plus Kanalinhibitor) und Gli (ATP-sensitiver K plus Kanalinhibitor). Die Ringe wurden maximal kontrahiert mit 1 μmol/L NE und dann L-NAME (100 μmol/L), IMT (10 μmol/L), TEA (1 mmol/L) , BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L) oder Gli (10 μmol/L) wurden hinzugefügt. Sobald ein neues Plateau erreicht war, wurde ECH kumulativ von 30 bis 300 &mgr;mol/L hinzugefügt. Die Konzentrations-Antwort-Kurven in Gegenwart verschiedener Inhibitoren sind in Abbildung 4 dargestellt. Die vasorelaxierende Wirkung von ECH auf pulmonale Arterienringe, die mit 1 μmol/l NE kontrahiert waren, wurde durch L-NAME (100 μmol/l), TEA ( 1 mmol/L) und BaCl2 (1 mmol/L) mit maximalen Relaxationen von 64,41 Prozent ±3,20 Prozent, 84,38 Prozent ±0,70 Prozent bzw. 75,27 Prozent ±0,93 Prozent (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Identifizierung von Ratten-PASMCs

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95 Prozent) (Abbildung 6A). Braun gefärbte Myofilamente wurden im Zytoplasma bei starker Vergrößerung deutlich beobachtet (Abbildung 6B).

CistancheEchinacosidwiderstehen kannApoptose

Wirkung von ECH auf die intrazelluläre Calciumkonzentration in Ratten-PASMCs

NE (1 μmol/L) erhöhte signifikant die intrazelluläre Calciumkonzentration (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">