Teil 1: Auswirkungen des wässrigen Extrakts von Cistanche Tubulosa auf die Darmmikrobiota von Mäusen mit Darmerkrankungen

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Störungen der Darmmikrobiota sind mit vielen Krankheiten verbunden. *e wässriger Extrakt ausCistanche tubulosa (CT), eine traditionelle chinesische Kräuterformel, soll dabei eine Rolle spielenSchutz des menschlichen Darms. Über die Auswirkungen auf die Darmmikrobiota ist jedoch wenig bekannt. *Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um festzustellen, ob der wässrige CT-Extrakt das Darmmikrobiom bei Mäusen mit Darmerkrankungen modulieren kann. Wir fanden, dass die beschädigtDarmmorphologiedie aus der Behandlung mit Cefixim resultieren, konnten mit dem wässrigen CT-Extrakt gerettet werden. *Der Vergleich der mikrobiellen Diversität zwischen Mäusen, die mit dem CT-Extrakt behandelt wurden, und Kontrollmäusen zeigte auch, dass die Störung in der Mikrobiomgemeinschaft der Modellgruppen durch Behandlung mit hohen und mittleren Konzentrationen des wässrigen Extrakts wiederhergestellt werden konnte. Die Behandlung mit Cefixim führte zu einer signifikanten Abnahme der Milchsäurebakterien; jedoch stellte die Ergänzung des wässrigen CT-Extrakts das Wachstum dieser Milchsäurebakterien wieder her. Darüber hinaus war der wässrige CT-Extrakt in der Lage, die durch Cefixim induzierten dramatischen Veränderungen in den Stoffwechselwegen des Darmmikrobioms zu mildern. * Diese Ergebnisse lieferten einen Einblick in die vorteilhaften Wirkungen des wässrigen CT-Extrakts auf die Darmmikrobiota und lieferten auch eine wichtige Referenz für die Entwicklung verwandter Arzneimittel in der Zukunft.

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Einführung

haben gezeigt, dass C.Deserticola-PolysaccharideMelanogenese induzierenMelanozyten, reduzieren oxidativen Stress[15], lindern kognitive Dysfunktion durch Regulierung von antioxidativen und entzündungshemmenden Prozessen bei Ratten [16], schützen PC12-Zellen vor OGD/RP-induzierter Schädigung [17], verbessern die Echinacosid-Absorption in vivo und beeinflussen die Darmmikrobiota [ 18]. Probiotika sind lebende apathogene Mikroorganismen, die gesundheitliche Vorteile haben und bei Verabreichung in angemessenen Mengen ein mikrobielles Gleichgewicht im Magen-Darm-Trakt bewirken [19]. *ey können unspezifische zelluläre Immunantworten verstärken, die durch die Aktivierung von Makrophagen, natürlichen Killerzellen (NK) und antigenspezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten und die Freisetzung verschiedener Zytokine auf stammspezifische und dosisabhängige Weise gekennzeichnet sind [20]. Probiotische Stämme verbessern die Eigenschaften des Darmepithels durch TJ-Modulation, und es wurde gezeigt, dass spezifische probiotische Stämme die Muzinexpression regulieren, wodurch sie die Eigenschaften der Schleimschicht beeinflussen und indirekt das Immunsystem des Darms regulieren [21]. Stämme von Milchsäurebakterien (LAB) und Bifidobacterium sind wichtige Probiotika, die in vielen Bereichen eingesetzt wurden [22–26]. *Ihre gesundheitlichen Vorteile sind zahlreich, wobei ihre antioxidative Kapazität ein wichtiger Faktor für ihre gesundheitsbezogenen Funktionen ist[27]. Probiotika können Metallionen chelatieren, um sie daran zu hindern, die Oxidation zu katalysieren [28, 29]; sie können auch die Expression antioxidativer Enzyme erhöhen [30, 31], verschiedene Metaboliten mit antioxidativer Aktivität produzieren [32, 33], antioxidative Signalwege vermitteln [34–36] und die Enzyme regulieren, die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und die Darmreaktion produzieren Mikroorganismen gegenüber oxidativem Stress[37]. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass die Polysaccharide von CD das Wachstum einiger Milchsäurebakterien stimulieren könnten, was der menschlichen Gesundheit zugute kommen könnte [38]. Der Gehalt an Polysacchariden in CD unterscheidet sich jedoch von dem in CT [7, 39], und dieser Unterschied kann zu unterschiedlichen Wirkungen bei Darmmikroorganismen führen. Obwohl CD-Polysaccharide oxidativen Stress reduzieren können, indem sie den NRF2/HO-1-Weg aktivieren [15], können sich die Wirkungen einzelner Polysaccharide von der Gesamtwirkung mehrerer Zusammensetzungen bei CT unterscheiden. *uns ist es notwendig, die Wirkung von CT wässrigen Extrakten auf Darmmikroorganismen genau zu definieren. Darüber hinaus können Fans auch oxidativem Stress widerstehen [40] und durch Lipolysaccha-Fahrt vermittelte Entzündungsreaktionen unterdrücken, indem sie den Keap1/Nrf2/HO-1-Weg aktivieren [41]. *Vorher ist die Bestimmung der Wirkung des wässrigen CT-Extrakts von großem Wert. Darüber hinaus deuten die Wirkungen bestimmter Bestandteile des wässrigen CD-Extrakts auf oxidativen Stress und die Darmflora darauf hin, dass die Resistenz gegen oxidativen Stress mit Veränderungen der Darmflora korreliert sein könnte. Um die Wissenslücken zu den oben genannten Themen zu schließen, untersuchten wir die Auswirkungen des CTaqueous-Extrakts auf die Darmmikrobiota von Mäusen mit Störungen der Darmflora. *Diese Ergebnisse werden wertvolle Informationen über die möglichen Mechanismen liefern, durch die sich die Darmflora verändert und dem Darm Resistenz gegen oxidativen Stress verleiht.

2. Materialien und Methoden

verabreicht täglich um 12:00 h, und andere Substanzen wurden täglich um 15:00 h verabreicht. Während der Experimente wurden die C-, D-, E- und F-Gruppen im Modellzustand der Darmerkrankungen gehalten. * Die Fäkalien wurden alle sieben Tage auf einem sterilen, bedienbaren Tisch gesammelt und bei –20 Grad gelagert. 2.4. Histopathologische Beobachtung des Dickdarms von Mäusen. Am Ende des Experiments wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet, und ihr Dickdarminhalt wurde auf einem sterilen, funktionsfähigen Tisch gesammelt und bei –80 Grad gelagert; gleichzeitig wurden Dickdarmgewebeproben in 10 % neutralem Formalin fixiert.*de, die Proben wurden unter Verwendung einer Gradientenkonzentration von Ethanol dehydriert, unter Verwendung von Xylol hyalinisiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Morphologische Veränderungen in der Dickdarmschleimhaut wurden beobachtet und unter Verwendung eines optischen Mikroskops verglichen. Zottenlänge und Kryptentiefe im Dickdarm wurden gemessen und das Verhältnis von Zottenlänge zu Kryptentiefe (V/C-Wert) berechnet (51).2.5. DNA-Extraktion und Bibliotheksaufbau. DNA wurde aus den Fäkalien unter Verwendung des EZNA ® Soil DNA Kits (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Die DNA-Qualität wurde mit einem Fluorometer (QuantiFluor™–ST, Promega Corporation, USA) bestimmt. Gepaarte Primer in der V3-V4-Region von 16s-rDNA wurden entwickelt, um die Region zu amplifizieren und 466-bp-DNA-Fragmente zu produzieren. *Der Vorwärtsprimer war 341F (-5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3-) und der Rückwärtsprimer war 806R (-5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3-). Jedes PCR-Volumen betrug 25 μl und enthielt 2,5 μl 10 × PCR-Puffer, 2 μl dNTPs, 1 μl jedes Primers und 20–30 ng Matrizen-DNA. *de, die indizierten Adapter wurden an das Ende der Amplikons angehängt, um Sequenzierungsbibliotheken zu generieren. *Bibliotheken wurden mit einem QuantiFluor™ Fluorometer validiert und auf 10 nmol quantifiziert.2.6. 16s-rRNA-Gensequenzierung und mikrobielle Gemeinschaftsanalyse. *e Illumina-Plattform (Illumina MiSeq) wurde verwendet, um Paired-End-Daten mit 2 × 250 bp zu erhalten. Operative taxonomische Einheiten (OTUs) wurden unter Verwendung der Uparse-Software durch Standard-Clustering mit 97 Prozent Ähnlichkeit erhalten. * Der naive Bayesian-Zuweisungsalgorithmus des RDP-Klassifikators wurde verwendet, um die OTUs mit der Greengene-Datenbank Version 13.5 abzugleichen und die Artannotation durchzuführen. * Die Alpha-Diversität der Darmmikrobiota wurde unter Verwendung der Shannon- und Simpson-Indizes berechnet, und die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch lineare Diskriminanzanalyse Effffect Size (LEfSe) analysiert. *e Beta-Diversität wurde durch Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) von Brady-Curtis-Unähnlichkeiten analysiert. PICRUSt2 wurde verwendet, um die mikrobielle Stoffwechselkapazität des Darmmikrobioms abzuschätzen [42].2.7. Statistische Datenanalyse. SPSS 20 wurde für die einfache ANOVA verwendet, und die experimentellen Daten wurden als X ± S ausgedrückt; X gibt den Durchschnittswert an und S gibt die Standardabweichung an.

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3. Ergebnisse

3.1. 8 Wirkung des wässrigen CT-Extrakts auf die Dickdarmmorphologie.* Die repräsentativen Verbindungen (Echinacosid und Acetonid) und ihre Konzentrationen des CT-Extrakts wurden durch HPLC validiert (Abbildung S1). Um die Wirkung des wässrigen Extrakts auf den Darm zu bestimmen, untersuchten wir die Länge der Dickdarmzotten und die Tiefe der Vertiefungen nach der Behandlung mit dem wässrigen Extrakt. * Die Dickdarmzotten in den Normal- und Hochdosisgruppen (A, B und D) waren länger und fingerartig, während die Dickdarmzotten in den Modell- und Niedrigdosisgruppen (C und F) kurz waren und die Spitzen der Dickdarmzotten wurden gebrochen (Abbildung 1). Dementsprechend erhöhte hochdosierter wässriger CT-Extrakt signifikant die Länge der Dickdarmzotten und verringerte die Vertiefungstiefe bei Mäusen mit Darmerkrankungen im Vergleich zu den Mäusen in der Modellgruppe (P < 0.01).="" im="" gegensatz="" dazu="" unterschied="" sich="" die="" vertiefungstiefe="" nicht="" signifikant="" zwischen="" der="" hochdosisgruppe="" und="" der="" normalgruppe="" (p=""> 0,05) (Tabelle S1). *Diese Ergebnisse zeigten, dass die hohe Dosis des wässrigen CT-Extrakts die Morphologie im Dickdarm von Mäusen mit Darmerkrankungen verbessern kann.3.2. 8e Wirkung des wässrigen CT-Extrakts auf die Diversität der Darmmikrobiota. Wir führten eine 16s-rRNA-Gensequenzierung durch, um die mögliche Ursache der morphologischen Veränderungen im Dickdarm und die Veränderungen der Darmmikrobiota nach der Behandlung mit dem wässrigen CT-Extrakt zu untersuchen. Aus den Rohdaten wurden durchschnittlich 100.553 effektive Tags im Bereich von 77.734 bis 125.144 erhalten (Tabelle S2). *Hirsche wurden in 4932 OTUs geclustert (Tabelle S3). Anschließend analysierten wir die Diversität der Darmmikrobiota basierend auf Theseus. *e Shannon- und Simpson-Indizes zeigten keinen Unterschied zwischen der A-Gruppe (normal mit dem wässrigen CT-Extrakt) und der B-Gruppe (normal ohne den wässrigen CT-Extrakt) (Abbildung 2(a)). *wird darauf hingewiesen, dass der wässrige CT-Extrakt bei den Mäusen ohne Cefixim-Behandlung möglicherweise keine zusätzlichen positiven oder schädlichen Auswirkungen auf die Vielfalt der Darmmikrobiota hatte. Allerdings zeigte die -Diversität in der Modellgruppe (C) im Vergleich zu den Normalgruppen einen abnehmenden Trend. *e Mäuse, die mit wässrigen CT-Extrakten in hoher und mittlerer Dosis behandelt wurden, zeigten Anzeichen einer Wiederherstellung der Diversität, während ein solches Phänomen bei Mäusen, die mit wässrigen CT-Extrakten in niedriger Dosis behandelt wurden, nicht beobachtet wurde ( 2(a) ). Unterdessen zeigte die PCoA, dass die normalen Gruppen (A und B) und die Gruppen mit Darmerkrankungen, denen hochdosierte (D) und mitteldosierte (E) CTawässrige Extrakte verabreicht wurden, tendenziell kürzere Abstände zwischen den Proben aufwiesen als diejenigen in der Modellgruppe und in der niedrigen -Dosis CWasserextrakt-Ergänzungsgruppe (F) (Abbildung 2(b)). *Die Ergebnisse zeigten, dass der wässrige CT-Extrakt dazu beitragen könnte, die Diversität der Darmmikrobiota bei Mäusen mit Darmerkrankungen zu verbessern.

3.3. Änderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota, die mit dem wässrigen CT-Extrakt behandelt wurden. * Die Zusammensetzungsprofile der Mikrobiota wurden zwischen verschiedenen Gruppen verglichen. Auf Stammebene war die relative Häufigkeit von Proteobakterien in der Modellgruppe höher als in den anderen Gruppen.

Abbildung 1: *e Wirkung des wässrigen Cistanche tubulosa (CT)-Extrakts auf die Dickdarmmorphologie: A, eine normale Gruppe mit zugesetztem wässrigem Cistanche tubulosa (CT)-Extrakt in mittlerer Dosis; B, normale Gruppe; C, Modellgruppe; D, die Modellgruppe mit hinzugefügtem wässrigem CT-Extrakt in hoher Dosis; E, eine Modellgruppe mit hinzugefügtem wässrigem CT-Extrakt in mittlerer Dosis; F, eine Modellgruppe mit niedrig dosiertem wässrigem CT-Extrakt hinzugefügt. (a) GruppeA. (b) Gruppe B. (c) Gruppe C. (d) Gruppe D. (e) Gruppe E. (f) Gruppe F.

(Abbildung 3(a)). * Die Zunahme von Proteobakterien legte nahe, dass das Mikrobiom von Modellmäusen durch Cefixim verändert wurde und dass der wässrige CT-Extrakt der Darmmikrobiota zugute kommen könnte, da die erhöhte Prävalenz von Proteobakterien ein zentraler Marker für eine gestörte Darmflora ist [43–45]. Darüber hinaus nahm auf Gattungsebene die relative Häufigkeit von Lactobacillus in der Modellgruppe im Vergleich zu der in den Gruppen mit normaler und hoher Dosis ab; sie stieg jedoch im Vergleich zu der Gruppe mit mittlerer und niedriger Dosis an (Abbildung 3(b)). *Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der hochdosierte CTaqueous-Extrakt das Wachstum einiger Bakterien der Gattung Lactobacillus fördern könnte. Die unterschiedliche Mikrobiota zwischen den untersuchten Gruppen wurde weiter gemäß der LEfSe-Analyse bestimmt. *Analyse zeigte, dass nach der Behandlung mit Cefixim die relative Häufigkeit von Turicibacter, Alphaproteobacteria, Acidobacteria, Betaproteobacteriales und Chloroflflexi signifikant zunahm, während die relative Häufigkeit von Lactobacillus, Eubacterium_nodatum_-Gruppe, Pseudono cardiales und Christensenellaceae_R-7_-Gruppe im Vergleich zu denen in der normalen Gruppe signifikant abgenommen (Abbildung 4(a)). Wenn die Modellgruppe mit dem hochdosierten wässrigen CT-Extrakt ergänzt wurde, waren die relativen Häufigkeiten von Muribaculaceae, Lactobacillus, Kin eosporiaceae, Eubacterium no datum-Gruppe und Pedobacter bemerkenswerterweise im Vergleich zu denen in der Modellgruppe signifikant erhöht. Unterdessen nahmen die relativen Häufigkeiten von Rhodobacter, Ruminococcaceae UCG_013, Roseburia, Ruminiclostridium_9 und Candidatus Stoquefifichus im Vergleich zu denen in der Modellgruppe signifikant ab (Abbildung 4(b)).

Abbildung 2: Diversitätsanalyse der Darmmikrobiota von Mäusekot. (a) - Diversität von Bakteriengemeinschaften gemessen durch den Shannon-Index (A) und den Simpson-Index (B); (b) das Diagramm der Hauptkoordinatenanalyse (PCoA), das die Daten basierend auf Bray-Curtis-Unterschieden visualisiert. A, normale Gruppe mit hinzugefügtem wässrigem Cistanche tubulosa (CT)-Extrakt in mittlerer Dosis; B, normale Gruppe; C, Modellgruppe; D, Modellgruppe mit hinzugefügtem hochdosiertem wässrigen CT-Extrakt; E, Modellgruppe mit hinzugefügtem wässrigem CT-Extrakt mittlerer Dosis; F, Modellgruppe mit hinzugefügtem niedrig dosiertem wässrigen CT-Extrakt.