Teil 1: Der Magnesiumausfluss aus Drosophila-Kenyon-Zellen ist entscheidend für das normale und durch die Ernährung verbesserte Langzeitgedächtnis

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Yanying Wu1, Yosuke Funato2, Eleonora Meschi1, Kristijan D. Jovanoski1, Hiroaki Miki2, Scott Waddell1*

1 Centre for Neural Circuits and Behaviour, The University of Oxford, Tinsley Building, Oxford, Vereinigtes Königreich; 2Abteilung für Zellregulation, Forschungsinstitut für mikrobielle Erkrankungen, Universität Osaka, Suita, Japan

Zusammenfassung Nahrungsergänzung mit Magnesium (Mg2 plus ) kann dies verbessernErinnerungbei jungen und alten Ratten.Erinnerung-Verstärkungskapazität wurde größtenteils einer Zunahme der synaptischen Dichte im Hippocampus und einer erhöhten Expression der NR2B-Untereinheit des Glutamatrezeptors vom NMDA-Typ zugeschrieben. Hier zeigen wir, dass Mg2 plus Fütterung auch langfristig verbessertErinnerungbei Drosophila. Normal und Mg2 plus - verbesserte FliegeErinnerungscheint unabhängig von NMDA-Rezeptoren im Pilzkörper zu sein und erfordert stattdessen die Expression eines konservierten Mg2-plus-Efflux-Transporters vom CNNM-Typ, der durch das nicht verlängerte (uex)-Gen codiert wird. UEX enthält eine mutmaßliche zyklische Nukleotid-bindende Homologiedomäne und ihre Mutation trennt eine lebenswichtige Rolle für uex von einer Funktion inErinnerung. Darüber hinaus ist die UEX-Lokalisierung in Pilzkörper-Kenyon-Zellen (KCs) verändertErinnerung- defekte Fliegen, die Mutationen in cAMP-verwandten Genen beherbergen. Die funktionelle Bildgebung legt nahe, dass ein UEX-abhängiger Efflux für die langsame rhythmische Aufrechterhaltung von KC Mg2 plus erforderlich ist. Wir schlagen vor, dass ein regulierter neuronaler Mg2-plus-Ausfluss für normale und Mg2-plus-verstärkte Zellen entscheidend istErinnerung.

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Einführung

Magnesium (Mg2 plus ) spielt eine entscheidende Rolle im Zellstoffwechsel und gilt als essentieller Co-Faktor für mehr als 350 Enzyme (Romani und Scarpa, 2000; Vink und Nechifor, 2011). Infolgedessen sind Veränderungen von Mg2 plus Homöostase mit einem breiten Spektrum klinischer Zustände verbunden, einschließlich solcher, die das Nervensystem betreffen, wie Glaukom (DeToma et al., 2014), Parkinson-Krankheit (Hermosura et al., 2005; Hermosura und Garruto, 2007; Lin et al., 2014; Shindo et al., 2016), Alzheimer-Krankheit (Andra´si et al., 2000; Andra´si et al., 2005; Cilliler et al., 2007; Durlach et al ., 1997; Glick, 1990; Lemke, 1995; Chui et al., 2011; Vural et al., 2010), Angst (Sartori et al., 2012), Depression (Whittle et al., 2011; Murck, 2002; Murck, 2013; Rasmussen et al., 1990; Ghafari et al., 2015) und geistige Behinderung (Arjona et al., 2014).

Vielleicht überraschenderweise kann die Erhöhung des Mg2 plus im Gehirn durch die Ernährung die neuronale Plastizität und die neuronale Plastizität verbessernErinnerungLeistung von jungen und alten Nagetieren, gemessen an einer Vielzahl von Verhaltensaufgaben (Slutsky et al., 2010; Landfield und Morgan, 1984; Mickley et al., 2013; Abumaria et al., 2013). Darüber hinaus reduzierte erhöhtes Mg2 plus kognitive Defizite in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit (Li et al., 2013) und verstärkte das Aussterben von Angsterinnerungen (Abumaria et al., 2011). Diese offensichtlich vorteilhaften Wirkungen haben zu der Annahme geführt, dass diätetisches Mg2 plus für Patienten mit einer Vielzahl von therapeutischen Wert haben könnteErinnerung-bezogene Probleme (Billard, 2011).

Trotz einer großen Anzahl potenzieller Standorte von Mg2 plus-Aktion im Gehirn, dieErinnerung-verstärkende Eigenschaft bei Nagetieren wurde weitgehend der Erhöhung der synaptischen Dichte im Hippocampus und der Aktivität von N-Methyl-D-Aspartat-Glutamat-Rezeptoren (NMDARs) zugeschrieben. Extrazelluläres Mg2 plus blockiert die Kanalpore des NMDAR und hemmt dadurch den Durchgang anderer Ionen (Mayer et al., 1984; verdauen) körperliche Gesundheit. Wir wissen, dass Nahrungsmittel, die gut für das Herz sind, wie Nüsse, öliger Fisch und Beeren, auch gut für das Gehirn sind. Wir wissen auch, dass Vitamine und Mineralstoffe für die allgemeine Gesundheit unerlässlich sind. Aber gibt es Beweise dafür? dass eine erhöhte Aufnahme bestimmter Vitamine oder Mineralstoffe helfen könnte, Ihre Gehirnleistung zu steigern?

Auch wenn es fast zu gut klingt, um wahr zu sein, gibt es Hinweise darauf, dass dies bei mindestens einem Mineral, Magnesium, der Fall ist. Studien an Nagetieren haben gezeigt, dass die Zugabe von Magnesiumzusätzen zur Nahrung die Leistung der Tiere bei Gedächtnisaufgaben verbessert. Sowohl junge als auch alte Tiere profitieren von zusätzlichem Magnesium. Auch ältere Nagetiere mit einem der Alzheimer-Krankheit ähnlichen Zustand zeigen wenigerErinnerungVerlust, wenn Magnesiumergänzungen gegeben werden. Aber was ist mit anderen Arten?

Wu et al. zeigen nun, dass Magnesiumpräparate auch die Gedächtnisleistung bei Fruchtfliegen steigern. Eine Gruppe von Fliegen wurde mehrere Tage lang mit Standard-Maismehl gefüttert, während die andere Gruppe mit Magnesium angereichertes Maismehl erhielt. Beide Gruppen wurden dann darauf trainiert, einen Geruch mit einer Essensbelohnung in Verbindung zu bringen. Fliegen, die das zusätzliche Magnesium erhalten hatten, schnitten besser abErinnerungfür den Geruch, wenn er 24 Stunden nach dem Training getestet wird.

Wu et al. zeigen, dass Magnesium verbessertErinnerungin den Fliegen über einen anderen Mechanismus als zuvor für Nagetiere berichtet. Bei Nagetieren erhöhte Magnesium die Spiegel eines Rezeptorproteins für eine Gehirnchemikalie namens Glutamat. Bei Fruchtfliegen hingegen ist dieErinnerungBoost hing von einem Protein ab, das Magnesium aus Neuronen transportiert. Mutierte Fliegen, denen dieser Transporter fehlte, zeigten Gedächtnisstörungen. Im Gegensatz zu normalen Fliegen zeigten die ohne den Transporter keine Verbesserung des Gedächtnisses nach dem Verzehr von mit Magnesium angereicherter Nahrung. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Transporter dabei helfen könnte, den Magnesiumspiegel in Gehirnzellen als Reaktion auf neurale Aktivität anzupassen.

Der Mensch produziert vier Varianten dieses Magnesiumtransporters, die jeweils von einem anderen Gen kodiert werden. Einer dieser Transporter wurde bereits mit der Entwicklung des Gehirns in Verbindung gebracht. Die Ergebnisse von Wu et al. legen nahe, dass die Transporter auch im erwachsenen Gehirn wirken können, um die Kognition zu beeinflussen. Weitere Studien sind erforderlich, um zu testen, ob die Ausrichtung auf den Magnesiumtransporter letztendlich vielversprechend für die Behandlung sein könnteErinnerungBeeinträchtigungen.

Bekkers und Stevens, 1993; Jahr und Stevens, 1990; Nowak et al., 1984). Wichtig ist, dass eine vorherige neuronale Depolarisation, die von anderen Transmitterrezeptoren angetrieben wird, erforderlich ist, um die Mg2-Plus-Blockierung auf dem NMDAR freizusetzen und einen Glutamat-gesteuerten Ca2-Plus-Einstrom zu ermöglichen. Der NMDAR spielt daher eine wichtige Rolle bei der neuronalen Plastizität als potenzieller Hebbscher Koinzidenzdetektor. Eine akute Erhöhung der extrazellulären Mg2 plus-Konzentration ([Mg2 plus ]e) innerhalb des physiologischen Bereichs (0,8–1,2 mM) kann der Induktion einer NMDAR-abhängigen Langzeitpotenzierung entgegenwirken (Dunwiddie und Lynch, 1979; Malenka et al., 1992; Malenka und Nicoll, 1993; Slutsky et al., 2004). Im Gegensatz dazu führt die Erhöhung von [Mg2 plus ]e für mehrere Stunden in neuronalen Kulturen zu einer Verstärkung von NMDAR-vermittelten Strömen und einer Erleichterung der Expression von LTP (Slutsky et al., 2004). Die verstärkenden Wirkungen von erhöhtem [Mg2 plus ]e wurden auch in vivo im Gehirn von Ratten beobachtet, die mit Mg2 plus -L-Threonat gefüttert wurden (Slutsky et al., 2010). Hippocampale neuronale Schaltkreise unterliegen einer homöostatischen Plastizität (Turrigiano, 2008), um das erhöhte [Mg2 plus ]e durch Hochregulierung der Expression von NMDARs, die die NR2B-Untereinheit enthalten, auszugleichen (Slutsky et al., 2004; Slutsky et al., 2010). Es wird angenommen, dass die höhere Dichte von Hippocampus-Synapsen mit NR2B-enthaltenden NMDARs den chronischen Anstieg von [Mg2 plus ]e kompensiert, indem sie die NMDAR-Ströme während der Burst-Zündung verstärkt. Zur Unterstützung dieses Modells zeigen Mäuse, die genetisch manipuliert wurden, um NR2B zu überexprimieren, ein verbessertes hippocampales LTP und VerhaltenErinnerung(Tang et al., 1999).

OlfaktorischErinnerungin Drosophila beinhaltet einen heterosynaptischen Mechanismus, der durch die Verstärkung dopaminerger Neuronen angetrieben wird, was zu einer präsynaptischen Unterdrückung cholinerger Verbindungen zwischen geruchsaktivierten Pilzkörper (MB)-Kenyon-Zellen (KCs) und nachgeschalteten Pilzkörper-Ausgangsneuronen (MBONs) führt (Schwaerzel et al., 2003). ; Aso et al., 2010; Aso et al., 2012; Claridge-Chang et al., 2009; Burke et al., 2012; Liu et al., 2012; Plac¸ais et al., 2013; Owald et al ., 2015; Hige et al., 2015; Barnstedt et al., 2016; Parisse et al., 2016; Aso et al., 2014; Oswald und Waddell, 2015). Darüber hinaus werden olfaktorische Informationen durch cholinerge Übertragung von olfaktorischen Projektionsneuronen an KCs übermittelt (Yasuyama et al., 2002; Leiss et al., 2009). Obwohl es denkbar ist, dass Glutamat über einen noch zu identifizierenden Weg an das MB-Netzwerk geliefert wird, gibt es derzeit keinen offensichtlichen Ort für NMDAR-abhängige Plastizität in der bekannten Architektur der cholinergen Eingangs- oder Ausgangsschichten (Barnstedt et al., 2016 ). Die Fliege stellt daher ein potenzielles Modell dar, um andere Mechanismen zu untersuchen, durch die sich die Aufnahme von Mg2 plus aus der Nahrung verstärken könnteErinnerung.

Die verstärkende Wirkung von Dopamin hängt vom Dop1R-D1--Typ-Dopaminrezeptor ab (Kim et al., 2007; Qin et al., 2012; Handler et al., 2019), der positiv mit der cAMP-Produktion gekoppelt ist (Tomchik und Davis, 2009; Boto et al., 2014). Darüber hinaus identifizierten frühe Studien in Drosophila die Dunce- und Steckrüben-kodierte cAMP-Phosphodiesterase bzw. Typ I Ca2 plus-stimulierte Adenylatcyclase als essentiell für den GeruchssinnErinnerung(Dudai et al., 1976; Byers et al., 1981; Dudai und Zvi, 1984; Chen et al., 1986; Livingstone et al., 1984; Levin et al., 1992). Studien an Säugerzellen haben gezeigt, dass Hormone oder Wirkstoffe, die den zellulären cAMP-Spiegel erhöhen, oft eine signifikante Na+-abhängige Extrusion von Mg2+ in den extrazellulären Raum hervorrufen (Romani und Scarpa, 1990b; Romani und Scarpa, 1990a; Romani und Scarpa, 2000; Vink und Nechifor, 2011; Vormann und Günther, 1987). Es ist jedoch unklar, ob Mg2 plus Extrusion eine Rolle bei der In-Memory-Verarbeitung spielt.

Hier demonstrieren wir, dass Drosophila langfristigErinnerung(LTM) kann durch Nahrungsergänzung mit Mg2 plus ergänzt werden. Wir finden, dass das nicht verlängerte (uex) (Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010)-Gen, das für ein funktionelles Fliegen-Ortholog der Säuger-Cyclin M2 Mg2 plus -Efflux-Transporter (CNNM)-Proteine ​​kodiert, entscheidend für dieErinnerung-verbessernde Eigenschaft von Mg2 plus . Die UEX-Funktion in MB-KCs ist für LTM erforderlich, und die funktionelle Wiederherstellung von uex zeigt, dass MB die Schlüsselstelle der Mg2+-abhängigen Gedächtnisverbesserung ist. Die chronische Veränderung des cAMP-Stoffwechsels durch Einführung von Mutationen in die dnc- oder rut-Gene verändert die zelluläre Lokalisierung von UEX. Darüber hinaus entkoppelt die Mutation der konservierten cyclischen Nukleotid-bindenden Homologie(CNBH)-Domäne in UEX eine wesentliche Rolle für uex von seiner Funktion im Gedächtnis. Der UEX-gesteuerte Mg2-plus-Ausfluss ist für die langsame rhythmische Aufrechterhaltung der KC-Mg2-plus-Spiegel erforderlich, was auf eine potenzielle Rolle der Mg2-plus-Fluss-In-Memory-Verarbeitung hindeutet.

Ergebnisse

Die Fütterung mit Mg2 plus verbessert die LTM von Wildtyp-Fliegen

Frühere Studien berichteten, dass die Fütterung von Ratten mit Futter, das eine hohe Konzentration von Mg2 plus enthielt, ihre Lern- und Gedächtnisfähigkeit verbesserte (Slutsky et al., 2010; Landfield und Morgan, 1984; Abumaria et al., 2011; Mickley et al., 2013; Abumaria et al., 2013). Wir haben daher getestet, ob ähnliche Effekte bei Fliegen bestehen, indem wir sie vor dem Training mit Futter füttern, das eine hohe Konzentration von Mg2 plus enthält. Überraschenderweise zeigten Wildtyp-Fliegen, die 4 Tage vor dem Training mit Nahrung ergänzt mit zusätzlichem Magnesiumchlorid (MgCl2) gefüttert wurden, eine signifikant verbesserte 24-Stunden-Gedächtnisleistung. Die Verbesserung des Gedächtnisses hängt von der Konzentration ab und war maximal, wenn die Nahrung mit 80 mM MgCl2 ergänzt wurde (Abbildung 1A). Die Leistung des unmittelbaren Gedächtnisses wurde nicht offensichtlich verbessert (Abbildung 1B). Die verstärkende Wirkung von MgCl2 wurde auch bei Fliegen beobachtet, die mit Magnesiumsulfat (MgSO4), aber nicht mit Calciumchlorid (CaCl2) gefüttert wurden (Abbildung 1C). Darüber hinaus führte die 4-tägige Fütterung von Fliegen mit Futter, das zwischen 5 und 80 mM Strontiumchlorid (SrCl2) enthielt, zu hohen Sterblichkeitsraten, und Fliegen, die eine Fütterung mit 5 mM SrCl2 überlebten, zeigten keine verbesserte Sofort- oder 24-Stunden-Gedächtnisleistung (Daten nicht gezeigt). . Die gedächtnisfördernden Wirkungen können daher speziell auf die Nahrungsergänzung mit zweiwertigem Mg2 plus zurückgeführt werden.

Das durch Mg2 plus verstärkte Gedächtnis ist in den Pilzkörpern unabhängig von NMDAR

Da das durch Magnesium-L-Threonat verstärkte Gedächtnis bei Ratten mit einer Hochregulation von NMDARs, die die NR2B-Untereinheit des Hippocampus enthalten, korreliert war (Slutsky et al., 2010), testeten wir auf Veränderungen in der Glutamatrezeptorexpression in Fliegen, die mit MgCl2 gefüttert wurden. RT-qPCR-Analysen zeigten keinen signifikanten Unterschied in der Häufigkeit von mRNAs für die mutmaßlichen Rezeptoren NMDA (Nmdar1, Nmdar2), AMPA (GluRIA) oder Kainat-Typ (GluRIIA) in Köpfen von Fliegen, die 4 Tage lang mit 80 mM gefüttert wurden MgCl2 im Vergleich zu denen, die mit 1 mM MgCl2 gefüttert wurden (Abbildung 1D).

Als nächstes testeten wir direkt, ob Mg2 plus verbessertes Gedächtnis eine NMDAR-Funktion erforderte, indem wir die Expression der Nmdar1- oder Nmdar2-Gene unter Verwendung von transgener UAS-gesteuerter RNA-Interferenz niederschlugen

Abbildung 1. Nahrungsergänzung mit Mg2 plus verbessert das Langzeitgedächtnis von Drosophila. (A) Wildtyp-Fliegen wurden trainiert und auf ein 24-stündiges Appetitgedächtnis nach 1–5 Tagen ad libitum-Fütterung mit Nahrung, die mit Mg2 plus ergänzt wurde, getestet. Das Gedächtnis war bei Fliegen, die 4 Tage lang mit 80 mM MgCl2 gefüttert wurden, im Vergleich zu denen, die mit 1 mM gefüttert wurden, signifikant verbessert. 80 mM MgCl2 erzeugte eine geringfügig höhere Leistung als 50 mM oder 100 mM und wurde daher als optimal angesehen (Sternchen bezeichnen S<0.05, t-test="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" groups="" for="" each="" time="" point,="" n="6–8)." (b)="" 4="" days="" of="" 80="" mm="" mgcl2="" food="" did="" not="" enhance="" immediate="" memory.="" (c)="" appetitive="" 24="" hr="" memory="" was="" enhanced="" by="" feeding="" wild-type="" flies="" for="" 4="" days="" with="" mgcl2="" and="" mgso4,="" but="" not="" cacl2.="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05, anova,="" n="6)" between="" mg2+="" fed="" and="" plain="" groups.="" (d)="" rt-qpcr="" showed="" no="" significant="" differences="" in="" glutamate="" receptor="" mrna="" expression="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" fed="" flies="" (t-test,="" n="5)." (e)="" c739-gal4;="" uas-magfret-1="" flies="" were="" fed="" for="" 4="" days="" on="" food="" supplemented="" with="" mg2+.="" brains="" were="" dissected="" and="" fixed="" and="" a="" fluorescence="" emission="" ratio="" measurement="" (citrine/cerulean)="" was="" taken="" as="" an="" indicator="" of="" [mg2+]i.="" the="" magfret="" signal="" was="" significantly="" greater="" in="" the="" ab="" lobes="" of="" flies="" fed="" with="" 80="" mm="" mgcl2="" than="" those="" fed="" with="" 1="" mm="" mgcl2=""><0.05, t-test,="" n="52–60)." unless="" otherwise="" noted,="" all="" data="" are="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" the="" mean="" (sem).="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05), individual="" data="" points="" displayed="" as="" open="">

Die Online-Version dieses Artikels enthält die folgende(n) Abbildungsergänzung(en) für Abbildung 1:

Abbildungsergänzung 1. Knockdown des N-Methyl-D-Aspartat-Glutamat-Rezeptors (NMDAR) in Pilzkörpern beeinträchtigt nicht das durch Mg2 plus verbesserte Gedächtnis.

(RNAi)-Konstrukte (Dietzl et al., 2007; Perkins et al., 2015). Von den zwei unabhängigen UAS-Nmdar1RNAi- und vier UAS-Nmdar2RNAi-Linien, die wir getestet haben, zeigte nur eine Nmdar1RNAi (BDSC 25941)-Linie, wenn sie in allen Neuronen durch neuronales Synaptobrevin (nSyb)-GAL4 angetrieben wurde, eine signifikant verringerte 24-Stunden-Gedächtnisleistung, wie im Vergleich zu heterozygoten Kontrollfliegen (Abbildung 1 – Abbildungsergänzung 1A). Im Gegensatz dazu beeinträchtigte eine selektivere Expression dieser UAS-Nmdar1RNAi in LTM-relevanten ab-KCs unter Verwendung von c739-GAL4 die 24-Stunden-Gedächtnisleistung nicht signifikant (Abbildung 1 – Abbildungsergänzung 1B). Darüber hinaus behielten Fliegen, die Nmdar1RNAi in ab-Neuronen exprimierten, ein robustes Mg2 plus -verbessertes Gedächtnis (Abbildung 1 – Abbildungsergänzung 1C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Mg2 plus verbessertes Gedächtnis die Expression von Glutamatrezeptoren nicht verändert oder eine NMDAR-Funktion in ab KCs erfordert.

Die Mg2 plus-Konzentration in ab-Neuronen ist bei Fliegen erhöht, die mit viel Mg2 plus gefüttert wurden Plus ich). Wir konstruierten Fliegen, die ein UAS-MagFRET-1-Transgen beherbergen, und kombinierten es mit c739-GAL4, um MagFRET- 1 in ab KCs zu exprimieren. Wir verglichen die FRET-Signale in fixierten Gehirnen von c739; UAS-MagFRET-1-Fliegen, die 4 Tage lang entweder mit 1 mM oder 80 mM MgCl2-Nahrung gefüttert wurden. Das MagFRET-Signal war sowohl in den a- als auch in den b-Kollateralen von ab-KCs von Fliegen, die mit 80 mM gefüttert wurden, signifikant höher als in denen, die mit 1 mM gefüttert wurden (Abbildung 1E). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Zufuhr von Mg das neuronale [Mg2 plus ]i erhöht. Angesichts der Affinität von MagFRET-1 (Kd=148 mM) und der ~50-prozentigen Zunahme des FRET-Signals bei Mg2 plus Bindung (Lindenburg et al., 2013) schätzen wir, dass die ~8-prozentige Verstärkung von das bei Fliegen gemessene MagFRET-Signal, das mit 80 mM MgCl2 gefüttert wurde, entspricht etwa einem 50 mM Anstieg von ab KC [Mg2 plus ]i im Mittel.

Der nicht erweiterte kodierte CNNM-Typ Mg2 plus Transporter spielt eine Rolle im Gedächtnis

Unextended (uex; Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010) identifizierten wir als genverändernden, appetitanregenden olfaktorischen LTM, verstärkt durch eine Saccharose-Belohnung. Fliegen mit der MiMIC-Insertion uexMI01943 (Venken et al., 2011) zeigten einen starken Defekt im 24-Stunden-Gedächtnis, aber ihre Leistung unmittelbar nach dem Training war nicht von der der Wildtyp-Kontrollen zu unterscheiden. Eine detailliertere Analyse von uexMI01943-Fliegen ergab einen stetigen Gedächtnisverlust, der sich 12 Stunden nach dem Training erstmals signifikant von dem von Wildtyp-Fliegen unterschied (Abbildung 2A). Bei heterozygoten uexMI01943/plus-Fliegen war kein Gedächtnisdefekt erkennbar, was zeigt, dass dieses mutmaßliche Geschlechtsallel rezessiv ist.

uex erregte unsere Aufmerksamkeit, weil es das Einzelfliegen-Ortholog der vier menschlichen CNNM-Gene ist, die für Mg2-plus-Transporter kodieren (Ishii et al., 2016), und es außerdem eine mutmaßliche CNBH-Domäne enthält, die strukturell mit denen in cyclischer Nukleotid-gesteuerter Domäne verwandt ist Kanäle (Zagotta et al., 2003; Flynn et al., 2007; Kesters et al., 2015). Die Ausrichtung der 834 Aminosäuren umfassenden UEX-Sequenz mit CNNM1-4 zeigt eine besonders hohe Sequenzkonservierung mit CNNM2 und CNNM4 in den DUF21-, CBS-Paar- und CNBH-Domänen (Abbildung 2 – Abbildungsergänzung 1A–C). Wir stellten daher die Hypothese auf, dass UEX das Potenzial hatte, die gedächtnisverbessernden Wirkungen von diätetischem Mg2 plus mit cAMP-abhängiger neuronaler Plastizität zu verknüpfen.

Although uexMI01943 is assigned to the uex gene, the MiMIC element is annotated to lie 17 kb downstream of the uex coding region (Venken et al., 2011; Figure 2B). RYa (Yoon et al., 2016) is the next nearest gene to uexMI01943 but is >230 kb weiter weg. Wir haben zuerst die MiMIC-Position durch inverse PCR bestätigt (Attrill et al., 2016). Wichtig ist, dass bei diesen Fliegen keine zusätzliche MiMIC-Insertion festgestellt wurde. Als nächstes testeten wir, ob uexMI01943 für den Gedächtnisdefekt verantwortlich war, indem wir das MiMIC-Element präzise durch Minos-Transposase-vermittelte Exzision entfernten (Arca` et al., 1997; Abbildung 2 – Abbildungsergänzung 2A und B). Das Entfernen von MiMIC in uexMI01943.ex1- und uexMI01943.ex2-Fliegen stellte die normale 24-Stunden-Speicherleistung wieder her, was zeigt, dass die MiMIC-Einfügung für das uexMI01943 erforderlich istErinnerungDefekt (Abbildung 2C).

Sowohl die qRT-PCR von mRNA als auch die Western-Blot-Analyse von Proteinextrakten aus Fliegenköpfen zeigten keinen signifikanten Unterschied in der uex/UEX-Expression in uexMI01943-Fliegen. Wir verwendeten daher CRISPR, um ein Stoppcodon in das fünfte codierende Exon des uex-Lokus einzuführen (Abbildung 2B und Abbildung 2 – Abbildungsergänzung 2C). Fliegen, die für die resultierende uexD-Mutation homozygot waren, waren als Erwachsene nicht lebensfähig und starben im Larvenstadium. Im Gegensatz dazu waren heterozygote uexMI01943/uexD-Fliegen lebensfähig, aber ihre 24-Stunden-AppetenzErinnerungwar erheblich beeinträchtigt (Abbildung 2D). Diese Daten zeigen, dass uex ein essentielles Gen ist und dass uexMI01943 ein lebensfähiges hypomorphes Allel von uex ist.

Wir haben auch das Aversiv getestetErinnerungLeistung von uexMI01943-Mutantenfliegen. Homozygote uexMI01943-Fliegen zeigten sich sofortErinnerungdas war von heterozygoten und Wildtyp-Kontrollen nicht zu unterscheiden (Abbildung 2E). Ihr 24-Stunden-Gedächtnis, das sich entweder nach fünf Versuchen mit aversivem Abstandstraining (Tully et al., 1994; Jacob und Waddell, 2020) oder einem Versuch mit fastengestütztem Training (Hirano et al., 2013) gebildet hatte, war jedoch erheblich beeinträchtigt (Abbildung 2E). Diese Experimente legen nahe, dass uexMI01943-Fliegen allgemeiner in ihrer Fähigkeit, LTM zu bilden, beeinträchtigt sind. Sofern nicht anders angegeben, alle nachfolgenden Analysen vonErinnerungVerwenden Sie in dieser Studie eine appetitive zuckerbelohnte Konditionierung.

Abbildung 2. uexMI01943-Mutantenfliegen sind langfristig defektErinnerung(LTM). (A) Die Beibehaltung des Appetitgedächtnisses wurde zu verschiedenen Zeiten nach dem Training getestet. Fliegen, die homozygot für uexMI01943 waren, zeigten ab 12 Stunden nach dem Training einen signifikanten Gedächtnisdefekt, verglichen mit der Leistung von heterozygoten uexMI01943/plus- und Wildtyp-Kontrollfliegen (S<0.05, anova,="" n="6–10)." (b)="" the="" uex="" locus="" lies="" on="" chromosome="" 2r="" between="" 3,900,285="" and="" 3,949,425="" (light="" blue="" bar).="" the="" four="" alternate="" uex="" transcripts,="" uex-re,="" uex-rg,="" uex-rh,="" and="" uex-rf,="" all="" encode="" the="" same="" protein.="" the="" uexmi01943="" mimic="" (blue="" triangle)="" resides="" ~17="" kb="" downstream="" of="" the="" uex="" coding="" region.="" the="" crispr/cas9="" edited="" uexd="" allele="" replaces="" a="" 3047="" bp="" fragment,="" including="" exon="" 7="" of="" uex="" with="" a="" stop="" signal="" (termination="" codon="" in="" all="" three="" reading="" frames)="" and="" a="" gfp="" cassette,="" truncating="" the="" uex="" reading="" frame="" (dark="" blue="" bar).="" (c)="" precise="" excision="" of="" the="" uexmi01943="" mimic="" restores="" normal="" 24="" hr="" memory="" to="" uexmi01943.ex1="" and="" uexmi01943.ex2="" flies=""><0.05, anova,="" n="8–11)." (d)="" uexd="" fails="" to="" complement="" the="" 24="" hr="">ErinnerungDefekt von uexMI01943 (S<0.05, anova,="" n="6–8)." (e)="" flies="" homozygous="" for="" uexmi01943="" showed="" a="" significant="" defect="" in="" aversive="" ltm,="" as="" figure="" 2="" continued="" on="">

Abbildung 2 fortgesetzt

verglichen mit der Leistung von heterozygoten uexMI01943/plus- und Wildtyp-Kontrollfliegen (S<0.05, anova,="" n="8–12)." an="" ltm="" defect="" was="" also="" observed="" following="" five="" cycles="" of="" aversive="" spaced="" training="" and="" a="" 16="" hr="" fasting="" facilitated="" one-cycle="" training="" protocol.="" immediate="" aversive="">Erinnerungwar in uexMI01943-homozygoten Mutantenfliegen nicht betroffen.

Die Online-Version dieses Artikels enthält die folgenden Quelldaten und Abbildungsergänzung(en) für Abbildung 2:

Quelldaten 1. Tabelle der Zucker- und Geruchssinnesschärfekontrollen für alle Verhaltensexperimente in diesem Manuskript.

Abbildungsergänzung 1. Erhaltung von UEX mit seinen Orthologen.

Abbildungsergänzung 2. Konstruktionsschemata für die Exzision von uex Mino und die Erzeugung des uexD-Allels.