Abstrakt

Die Regenerative Medizin hat aufgrund der Knappheit von Behandlungen für Nierenerkrankungen zunehmende Aufmerksamkeit als neuer Therapieansatz erhalten. Bemerkenswert sind die jüngsten Fortschritte bei der Nierenregeneration unter Verwendung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs). Basierend auf dem Wissen über die Nierenentwicklung differenzieren hiPSCs gerichtet in zwei Arten von embryonalen Nierenvorläuferzellen, Nephron-metabolische Vorläuferzellen (NPCs) und Ureterknospen (UB), die in der Lage sind, Nephrone zu erzeugen und kanalartige Organe zu sammeln. Außerdem kann aus diesen hiPSC-abgeleiteten Vorläuferzellen menschliches Nierengewebe erzeugt werden, in dem NPC-abgeleitete Glomeruli und Tubuli und UB-abgeleitete Sammelrohre miteinander verbunden sind. Das induzierte Nierengewebe wird nach der Transplantation in immundefiziente Mäuse weiter vaskularisiert. Zusätzlich zur Nierenrekonstruktion für die Transplantation hat sich gezeigt, dass die Zelltherapie mit hiPSC-abgeleiteten NPC die akute Nierenschädigung (AKI) bei Mäusen verbessert. Krankheitsmodellierung und Arzneimittelentdeckungsstudien mit krankheitsspezifischen hiPSCs wurden auch stark bei refraktären Nierenerkrankungen wie der autosomal dominanten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) eingesetzt. Um die mit Nierenerkrankungen verbundenen Komplikationen anzugehen, wurden von hiPSC abgeleitete Erythropoietin (EPO)-produzierende Zellen erfolgreich für die Wirkstoffforschung und Entwicklung von Zelltherapien für renale Anämie erzeugt. Dieser Artikel gibt einen Überblick über die aktuellen und zukünftigen Perspektiven der renalen Entwicklungsbiologie und der regenerativen Medizin für Nierenerkrankungen auf der Grundlage der iPSC-Technologie.

Schlüsselwörter

iPSC ;Nierenregeneration ;Nephron-Vorläuferzelle;Harnleiterknospe;Zelltherapie ; Krankheitsmodellierung;Cistanche tubulosa

Einführung

Nierenerkrankungen stellen weltweit ein enormes medizinisches Problem und eine wirtschaftliche Belastung dar, aber aufgrund des gravierenden Mangels an Spenderorganen gibt es außer der Nierentransplantation nur wenige Behandlungsoptionen. Eine Lösung besteht in der Entwicklung regenerativer Medizinstrategien unter Verwendung humaner pluripotenter Stammzellen (hPSCs), wie z. B. embryonaler Stammzellen (hESCs) und induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs). Da hPSCs das Potenzial haben, sich unbegrenzt zu vermehren und sich in jeden Zelltyp, einschließlich Nierenzellen, zu differenzieren, werden sie voraussichtlich als Zellquelle für die regenerative Medizin, wie z. B. Nierenrekonstruktion und Zelltherapie, dienen. Darüber hinaus können krankheitsspezifische hPSCs mit genetischer Anfälligkeit, bestimmte Krankheiten zu verursachen, verwendet werden, um pathologische Analysen und Modelle zur Arzneimittelentdeckung zu entwickeln, in denen beschädigte Zelltypen, die sich von hPSCs unterscheiden, Krankheitsphänotypen in vitro replizieren. In diesem Artikel fasse ich die jüngsten Fortschritte in der entwicklungsbiologischen Forschung zur Nierenregeneration zusammen und beschreibe die Zukunftsaussichten für die regenerative Medizin und die Modellierung von Krankheiten bei Nierenerkrankungen.

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Nierenentwicklung

Die Niere stammt aus dem frühen embryonalen Blastoderm, dem intermediären Mesoderm (IM) (Abbildung 1a). Bei Wirbeltieren entstehen aus dem IM drei aufeinanderfolgende Nieren, die primäre, die mittlere und die hintere Niere (Abbildung 1b). Die mittlere Niere ist die erwachsene Niere von Fischen und Amphibien, und die hintere Niere ist die erwachsene Niere von Reptilien, Vögeln und Säugetieren. Obwohl diese drei Nieren ähnlich sind, weil sie aus Nephronen bestehen, die die funktionellen Einheiten der Niere sind, haben sie eine unterschiedliche Anzahl von Nephronen. Die Postnephronniere der erwachsenen Säugetierniere besteht aus zwei embryonalen Geweben, dem postnephrischen Mesenchym (MM) und der Ureterknospe (UB; Abbildung 1 c). Das MM bildet das Nephron und das Mesenchym der erwachsenen Niere, und das UB differenziert sich, um den unteren Harntrakt vom Sammelrohr bis zu einem Teil der Blase zu bilden.

Abbildung 1: Gerichtete Differenzierung von Zellen der Nierenlinie. ac Schematische Zeichnungen, die die Spezifikation des Mesoderms (a), die Bildung von drei Nieren (b) und die Metanephros-Entwicklung (c) zeigen. IM: intermediäres Mesoderm; MM: metanephrisches Mesenchym; UB: Harnleiterknospe.

Durch die Generierung eines neuen klonogenen Assays haben wir zum ersten Mal gezeigt, dass MM multipotente Vorläuferzellen enthält, die sich in die multiplen Epithelzelltypen differenzieren können, aus denen das Nephron besteht, wie z. B. glomeruläre Fußzellen und tubuläre Epithelzellen. Später ergaben genealogische Suchversuche, dass diese Vorläuferzellen mit dem Transkriptionsfaktor Six2 markiert sind. Diese Vorläuferzellen werden heute als renale metabolische Vorläuferzellen (NPC) bezeichnet. Taguchiet al. zeigten, dass IM in anteriore und posteriore Domänen unterteilt ist, die jeweils zu UB und MM führen. Basierend auf diesen Erkenntnissen in der Nierenentwicklung wurden Anstrengungen zur Regenerierung renaler Genealogiezellen aus hPSCs unternommen.

Gezielte Differenzierung von hPSCs in Nierenlinien

Als vorläufige Maßnahme zur direkten Differenzierung von hiPSCs in Nierenlinien durch Nachahmung der Nierenentwicklung konzentrierte sich unsere Gruppe auf die Generierung von IM-Zellen und generierte Reporter-hiPSC-Linien mit dem OSR1-Gen, einem spezifischen Marker für IM, durch Genbearbeitung. Unter Verwendung eines quantitativen Bewertungssystems und Reporter-hiPSC-Linien haben wir ein effizientes Differenzierungsschema entwickelt, um hiPSCs in IM-Zellen zu induzieren, die osr1 exprimieren. Diese induzierten IM-Zellen zeigten ein Entwicklungspotential für die weitere Differenzierung in adulte Nierenzelltypen, wie glomeruläre Podozyten und tubuläre Zellen, und bildeten dreidimensionale (3D) tubuläre Strukturen durch Kokultur mit hinteren Nierenzellen der Maus.

Vorteile von Cistanche-Extrakt

Taguchiet al. entwickelten die erste Methode zur selektiven Differenzierung von Maus-ESCs (mESCs) und hiPSCs über posteriore IM, um NPCs zu induzieren, und erzeugten Niereneinheit-ähnliche Organe, die Glomeruli und Tubuli aus induzierten NPCs in vitro enthalten. Takasatoet al. berichteten über die Erzeugung von nierenähnlichen Organen, die mehrere Nierenzelltypen enthalten, wie Glomeruli, Tubuli, Sammelrohre, interstitielle Zellen und Gefäßzellen. Durch die Entwicklung eines 2D-Kultursystems konnten Morizane et al. effizient generierte NPC aus hiPSCs und generierte dann Nierenstoffwechsel-Organoide aus NPC. Kürzlich hat unsere Gruppe eine schrittweise Differenzierungsmethode entwickelt, die hiPSCs effizient in NPC induziert, die ein Differenzierungspotential haben, um Organe ähnlich einer Niereneinheit zu bilden (Abbildung 2 d, e). Unsere Differenzierungsmethode besteht aus sechs Schritten und fasst den natürlichen Entwicklungsprozess von NPC besser zusammen als die von Takasato et al. und Morizane et al. und generiert NPC im 2D-Differenzierungsformat effizienter als die Methode mit 3D-Kultur von Taguchi et al.

In Bezug auf die gerichtete Differenzierung der UB-Linie differenzierten Taguchi und Nishinakamura mESCs und hiPSCs durch den vorderen IM und die Nierentubuli (ND) in UB-ähnliche Strukturen. ND-Epithelzellen wurden jedoch mit geringer Effizienz induziert, und die anschließende Analyse erforderte die Reinigung von ND-Zellen durch Durchflusszytometrie. Wir haben eine effizientere 2D-Differenzierungsmethode entwickelt, die ND-Epithelzellen aus hiPSCs durch Prä-IM generiert und einen anschließenden Differenzierungsschritt ohne Reinigung beinhaltet (Abbildung 2 f, g). In 3D-Kultur bildeten induzierte ND-Zellen UB-ähnliche Strukturen mit RET(plus)-Spitzen und CK8(plus)-Stammstrukturdomänen. Die erzeugten UB-ähnlichen Strukturen beider Gruppen zeigten jedoch ein begrenztes Verzweigungspotential.

Abbildung 2: d: Immunfärbung von hiPSC-abgeleiteten Nephron-Vorläuferzellen (NPCs) für OSR1, SIX2 und HOXD11.e: Immunfärbung eines Nephron-Organoids, gebildet aus hiPSC-abgeleiteten NPCs nach 10 Tagen Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur. PODXL: Podocalyxin (Podozytenmarker; weiß); LTL: Lotus tetragonolobus Lektin (proximaler Tubulusmarker; rot); CDH1: CADHERIN 1 (distale Tubulusmarkierung; grün).f, g: Immunfärbung von anterioren IM-Zellen für OSR1 (grün) und GATA3 (rot; f) und ein Nephrikgang-Zellaggregat für E-CADHERIN (grün), GATA3 (rot) und Zellkerne (blau; g).h: Morphologische Veränderung während der Rekonstruktion von sich verzweigenden iUB-Organoiden für 7 Tage.

Kürzlich haben wir durch Modifikation unserer UB-Differenzierungsmethode erfolgreich induzierte UB (iUB)-ähnliche Organe mit epithelialer Polarität, röhrenförmigem Lumen und repetitiver Verzweigungsmorphogenese erzeugt (Abbildung 2,3 hj). Darüber hinaus haben wir erfolgreich die Differenzierung dieser iUB-ähnlichen Organe in ihre In-vivo-Gegenstücke induziert, indem wir in der 7. Schwangerschaftswoche gangartige Organe in menschlichen Embryonen gesammelt haben (Abbildung 3k).

Abbildung 3:i: Immunfärbung eines iUB-Organoids für RET (grün), CK8 (rot) und PAX2 (blau).j Toluidinblau-Färbung eines iUB-Organoids mit röhrenförmigen Lumen.k: Hellfeld- (links) und Immunfärbungsbilder (Mitte und rechts) von Sammelrohr-ähnlichen röhrenförmigen Strukturen, die von einem iUB-Organoid für FOXA1 (weiß), AQP2 (rot) und GATA3 (grün) stammen. Maßstabsbalken, 100 μm. (d) und (e) sind angepasst von Tsujimoto et al. [12], (f) und (g)–(k) sind adaptiert von Mae et al. bzw.

Expansion von Nierenvorläufern

Um eine große Zahl von Nierenzellen für die Grundlagen- und klinische Forschung bereitzustellen, wurden Verfahren zur in vitro-Vermehrung embryonaler Nierenvorläuferzellen in Kultur untersucht. Brownet al. und Tanigawaet al. berichteten über die In-vitro-Expansion von NPC in Mausembryos. NPC aus Maus- und menschlichen Embryonen wurden expandiert und in vitro für 17 bzw. 7 Monate unter Verwendung einer 3D-Zellaggregationskultur von Li et al. Die Gruppe verwendete auch die gleiche Methode, um NPC zu erweitern, die von hiPSCs in vitro für 2 Monate differenziert wurden. Obwohl alle drei Methoden knochenmorphogenetisches Protein (BMP) verwenden, bleibt die Rolle von BMP7 bei der Expansion von NPCs unbekannt. Durch Screening von Verbindungen identifizierten wir einen JAK3-Inhibitor, TCS21311, als Alternative zu BMP7 in der von Li et al. entwickelten bb0-Expansionskultur. und zeigten die hemmende Wirkung von BMP7 auf die Ausbreitung des Nasopharynxkarzinoms im JAK3- stat3-Signalweg. Darüber hinaus verbesserte die Zugabe von TCS21311 zur Expansionskultur die Proliferationsrate von Mausembryos und von hiPSC abgeleiteten NPC.

Vor kurzem haben wir eine Expansionskultur von hiPSC-abgeleiteten UB-Zellen entwickelt, in der einzelne Zellen, die aus iUB-ähnlichen Organen isoliert wurden, proliferierten, um Kolonien zu bilden, die UB-Spitzenmarker exprimieren. Diese Spitzenkolonien können iUB-ähnliche Organe in einem sich wiederholenden Verzweigungspotential rekonstituieren, und dieser Rekonstitutionsprozess kann mindestens dreimal wiederholt werden.

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Nierenrekonstruktion

Frühe Arbeiten zur Rekonstruktion von Nierenstrukturen verwendeten die vermeintliche ektodermale Region mit Amphibien befruchteten Eizellen, die als Tierkappe bezeichnet wird und eine pluripotente Zellmasse darstellt (Abbildung 4 a). Moriya et al. berichteten, dass eine Kombination aus einer Behandlung mit Aktivin A und Retinsäure (RA) die Differenzierung der tierischen Kappe in prorenale Tubuli in vitro induzierte. Brennanet al. induzierte auch prorenale Angiospermen in Exosomen. Wir haben gezeigt, dass die induzierten Exosomen prärenale Tubuli enthalten und prärenales Gewebe aus pluripotenten Amphibienzellen in vitro regenerieren können (Abbildung 4 bd). Obwohl das In-vitro-Regenerationssystem der Prärenale nicht direkt auf klinische Studien übertragen werden kann, kann es als einfaches und nützliches System zur Untersuchung der Nierenentwicklung dienen.

Figur 4: Rekonstruktion von Nierenstrukturen. a: Ein Schema, das die Erzeugung von Pronephros-Strukturen aus der Tierkappe von Xenopus-Embryonen zeigt. b–d: Doppelte Immunfärbungsbilder des ganzen Präparats (b) und des Schnitts (c, d): eines äquivalenten Xenopus-Explantats im Stadium 42 (b, c) und einer Larve im Stadium 40 (d) unter Verwendung eines pronephrischen Tubulus-spezifischen Antikörpers (3G8, rot ) und einen für den Ductus pronephricus spezifischen Antikörper (4A6, blau).

Im Gegensatz zur Generierung nierenähnlicher Organe aus mESC- und hPSC-abgeleiteten NPCs und zum Sammeln gangartiger Organe aus hPSC-abgeleiteten UB-Zellen, Taguchi et al. erzeugten nierenähnliche Organe der Maus durch Kombinieren von mESC-abgeleiteten NPC und UBs und mesenchymalen Vorläuferzellen, die aus Mausembryos entfernt wurden, die Glomeruli, Tubuli und Sammelrohre enthalten, wie oben beschrieben. Wir erzeugten menschliche nierenähnliche Organe in vitro durch Co-Kultur von NPC- und UB-Zellen, induziert durch hiPSCs, in denen NPC-abgeleitete Glomeruli und Tubuli und UB-abgeleitete Sammelrohre miteinander verbunden waren (Abbildung 5 e, f). Bei der Transplantation in den subepithelialen Raum von immungeschwächten Mäusen integrierten sich diese von hiPSCs abgeleiteten nierenähnlichen Organe in das Gefäßsystem der Wirtsmäuse (Abbildung 5gi).

Abbildung 5:e: Ein Schema, das die In-vitro-Rekonstruktion von Nierenstrukturen aus hiPSCs zeigt. f: Dreifache Immunfärbung von Tag-20-Nierenorganoiden für Marker von Podozyten (PODXL), proximalen Tubuli (LTL) und distalen Tubuli und Sammelrohren (CDH1; links) und für PODXL und Marker von distalen Tubuli und Sammelrohren (AVPR2) und Sammeln nur Kanäle (CALB1; rechts). Beachten Sie, dass schwache CDH1-Signale auch in Teilen des LTL plus der proximalen Tubuli im linken Feld gefunden wurden. g: Ein Schema, das die In-vivo-Rekonstruktion von Nierenstrukturen aus hiPSCs zeigt. h: Ein Bild mit geringerer Vergrößerung, das die gesamte Wirtsniere und das von hiPSC stammende Nierentransplantat (grün) nach Verabreichung von Rhodamin-B-konjugiertem Dextran durch die Schwanzvene der Wirtsmaus zeigt. i: Ein intravitales Multiphotonen-Mikroskopbild nach Schwanzveneninjektion von Rhodamin-B-konjugiertem Dextran, das zeigt, wie die Gefäßlumen von Wirtsmäusen in die hiPSC-abgeleitete glomerulusähnliche Struktur eindringen (grün). Maßstabsbalken, 100 μm in (b)–(d) und (f), 500 μm in (h) und 40 μm in (i). (b)–(d) und (e)–(i) sind adaptiert von Osafune et al. bzw. Tsujimoto et al

Für die Transplantation von Nierenorganen mit Harnwegen wurden Methoden untersucht, die experimentelle Tierkörper verwenden, wie z. Gotoet al. injizierten Wildtyp-mESCs in Blastozysten von anämischen Sall1(-/-)-Ratten und generierten erfolgreich Mausnieren in den Wirtsratten. Fujimotoet al. entwickelten eine Zelltransplantationsmethode, bei der hiPSC-abgeleitete NPCs in die sich entwickelnde Nierenregion (d. h. Organökoton) von Maus-Uterusembryos transplantiert wurden und die transplantierten NPCs zusammen mit Wirts-NPCs, die an der Wirtsmaus UB befestigt waren, ein chimäres Kappenmesenchym bildeten. Obwohl von mm abgeleitete Glomeruli und Tubuli von injizierten PSCs oder NPCs abgeleitet wurden, wurden die verbleibenden Zelltypen der Nierenbestandteile, wie beispielsweise von UB abgeleitete Sammelrohre und untere Harnröhren- und Gefäßzellen, in beiden Strategien vom Wirtstier abgeleitet.

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