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Cistanche hat eine sehr gute neuroprotektive Wirkung

Gabriel Gonzalez 1,2 , Jiˇrí Grz 1, Cosimo Walter D'Acunto 1, Petr Ka ˇnovsk2 und Miroslav Strnad1,2,*

1. Labor für Wachstumsregulatoren, Institut für experimentelle Botanik der Tschechischen Akademie der Wissenschaften,

und Naturwissenschaftliche Fakultät, Palacký University, Šlechtitel ˚u 27, CZ-78371 Olomouc, Tschechische Republik;

Gonzalez.gabriel@seznam.cz (GG); jiri.gruz@upol.cz (JG); waldacun@gmail.com (CWD)

2. Abteilung für Neurologie, Universitätsklinikum Olomouc und Fakultät für Medizin und Zahnmedizin,

Palacký University Olomouc, CZ-775 20 Olomouc, Tschechische Republik; Petr.Kanovsky@fnol.cz

* Korrespondenz: miroslav.strnad@upol.cz; Tel.: plus 420-585-634-850

Abstrakt: Cytokininesind Phytohormone auf Adeninbasis, die Schlüsselprozesse in Pflanzen regulieren, wie Zellteilung und -differenzierung, Wurzel- und Sprosswachstum, apikale Dominanz, Verzweigung und Samenkeimung. In vorläufigen Studien haben sie auch schützende Wirkungen gegen menschliche neurodegenerative Erkrankungen gezeigt. Um das Wissen über den Schutz (schützende Aktivität), den sie bieten, zu erweitern, untersuchten wir die Aktivitäten natürlicherCytokininegegen Salsolinol (SAL)-induzierte Toxizität (aParkinson-KrankheitModell) und Glutamat (Glu)-induzierter Tod vonNeuron-ähnliche dopaminerge SH-SY5Y-Zellen. Wir fanden heraus, dass Kinetin-3--Glucosid, cis-Zeatin-Ribosid und N6--Isopentenyladenosin im SAL-induzierten PD-Modell aktiv waren. Darüber hinaus reduzierten trans-, cis-Zeatin und Kinetin zusammen mit dem Eisenchelator Deferoxamin (DFO) und dem Nekroptose-Inhibitor Necrostatin 1 (NEC-1) die Zelltodraten im Glu-induzierten Modell signifikant. Laktatdehydrogenase-Assays ergaben, dass dieCytokinineniedriger vorgesehenneuroprotektivAktivität als DFO und NEC-1. Darüber hinaus reduzierten sie die Aktivitäten der apoptotischen Caspase-3/7 weniger stark als DFO. Allerdings ist dieCytokininehatte sehr ähnliche Wirkungen wie DFO und NEC-1 auf die Produktion von Superoxidradikalen. Insgesamt zeigten sie im SAL-induzierten Modell eine schützende WirkungParkinsonneuronalZelltod und das Glu-induzierte Modell des oxidativen Schadens hauptsächlich durch Reduktion von oxidativem Stress.

Schlüsselwörter: Cytokinin; Phytohormon; Neuroprotektion; neuronenähnliche SH-SY5Y-Zellen; Zytotoxizität; Salolinol; Glutamat; oxidativen Stress; Parkinson-Krankheit

Cistanche-Pflanzeauf die Auswirkungen aufNeuroprotektion

1. Einleitung

Parkinson-Krankheit(PD) ist die zweithäufigste motorbedingte neurodegenerative Erkrankung, und die Zahl der weltweit diagnostizierten Fälle wird voraussichtlich von 6 Millionen im Jahr 2015 auf mehr als 12 Millionen bis 2040 steigen [1]. Es ist gekennzeichnet durch motorische Symptome in Verbindung mit einer spezifischen Degeneration und einem Verlust von etwa 30–70 Prozent der dopaminergen (DA)Neuronenin der Substantia nigra pars compacta und ihren Vorsprüngen zum Striatum [2,3]. Einige der vielen bekannten molekularen Kennzeichen von Parkinson sind verstärkter oxidativer und nitrosativer Stress, mitochondriale Dysfunktion [4–7], Exzitotoxizität [8], Ubiquitin/Proteasom-System-Dysfunktion [9] und Neuroinflammation [10]. Gegenwärtige Behandlungen haben verschiedene unerwünschte Nebenwirkungen und bieten nur eine symptomatische Linderung [11], daher gibt es intensive Bemühungen, Medikamente mit wirksamen heilenden Wirkungen auf degenerierende DA zu entwickelnNeuronen. Zu den Ressourcen, die solche Bemühungen unterstützen können, gehören natürliche Verbindungen, die tendenziell weniger Nebenwirkungen haben. Unter anderem haben Substanzen aus Ginkgo biloba (Ginkgetin, Ginkgolid, Bilobalid), Ginseng (Ginsenoside) und Flavonoiden (Baicalein, Kämpferol, Rutin und Luteolin) in mehreren In-vitro-Modellen (einschließlich der menschlichen Neuroblastom-Zelllinie SH) eine breite Schutzwirkung gezeigt -SY5Y) und In-vivo-Modelle von PD, induziert durch 1,1'-Dimethyl-4,4'-Bipyridiniumdichlorid (Paraquat), 1-Methyl- 4-phenyl-1, 2,3,6-Tetrahydropyridin (MPTP), 1-Methyl-4-phenylpyridinium (MPP plus ) und 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) [12].

Die hier vorgestellte Studie konzentrierte sich auf die Wirkungen einer Klasse natürlicher Phytohormone, die als Phytohormone bezeichnet werdenCytokinine(CKs) und ihre Metaboliten, die bekannte Regulatoren der Zellteilung, des Wachstums, der Differenzierung und der Blattalterung in Pflanzen sind [13]. Strukturell sind CKs Adeninderivate, die an der N6--Position entweder mit einer Prenyl- (Isopentenyl-) oder einer aromatischen Seitenkette substituiert sind. Zu den natürlichen Formen gehören 6-(E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylaminopurin (trans-zeatin, tZ), sein 6-(Z)-Isomer ( cis-Zeatin, cZ), N6-Isopentenyladenin (iP), 6-Benzylaminopurin (BAP), 6-Furfurylaminopurin (Kinetin, K) und ortho-, meta-, und para-hydroxylierte oder methoxylierte Derivate von BAP, sogenannte Topoline (oT, mT, pT, MeoT, MemT, MepT). Verschiedene 9--Riboside, 9--Nukleotide sowie 7--, 9- und O-Glucoside dieser Formen kommen ebenfalls häufig vor, wie in Tabelle 1 gezeigt. Zusätzlich zu ihren nativen Rollen in Pflanzen haben CKs eine starke antioxidative Aktivität gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) gezeigt, die in mehreren In-vitro-Stressmodellen von altersbedingten Erkrankungen Schutz bietet [14].

Tabelle 1. Strukturen vonCytokinineund die Positivkontrollmittel.

Insbesondere haben CKs Berichten zufolge eine zytoprotektive Aktivität in Modellen wie H2O2--induziertem Zelltod menschlicher Fibroblasten [15] und D-Galactose-induziertem glyoxidativem Stress in Ratten-Astrozyten [16]. Noch wichtiger ist, dass sie in diesem Zusammenhang gezeigt habenneuroprotektivEffekte in Modellen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wie familiärer Parkinson, Proteasom-Inhibitor MG 132-induzierte oder H2O2--induzierte Toxizität in SH-SY5Y-Zellen [17], Glu-induzierte oxidative Schädigung des HT22-Hippocampus der MausneuronalZellen [18] und das PC12-Zellmodell der Huntington-Krankheit [19]. Andere Studien weisen darauf hin, dass die Schutzaktivitäten von CKs sowohl eine direkte [20,21] als auch eine indirekte [15,16,22] Modulation zellulärer Redoxsysteme beinhalten. Zusätzlich zu den charakteristischen antioxidativen Aktivitäten von CKs haben sie Berichten zufolge regulatorische Wirkungen in Mitochondrien, die sich verstärkenneuronalLebensfähigkeit [17]. Darüber hinaus kann K das mitochondriale Membranpotential stabilisieren und die ATP-Produktion erhöhen, wodurch der Glu-induzierte Tod von HT22-Zellen gemildert wird [18]. Trotz Erkenntnissen zu ihren Wirkungen in mehreren Modellen gibt es jedoch nur begrenztes Wissen über die Schutzwirkung von CKs bei der häufigsten (sporadischen) Form von PD.

Um die oben beschriebene Wissenslücke zu schließen, haben wir die Auswirkungen natürlicher CKs und ihrer Metaboliten in zwei In-vitro-Modellen systematisch bewertet: Ein Salsolinol (SAL)-induziertes Modell von PD und ein Glutamat (Glu)-induziertes Modell von oxidativen Schäden inNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen. Diese Linie wurde wegen ihres dopaminergen Phänotyps, ihrer Empfindlichkeit gegenüber dopaminergen Toxinen wie SAL und der bequemen Bildung von relativ stabilen Populationen von differenzierten verwendetneuronalZellen mit reduzierter Proliferationsrate nach 48-stündiger Exposition gegenüber 10 μM all-trans-Retinsäure (ATRA) [23–25].

Neuron-ähnliche Zellen wurden dem Endo/Exotoxin SAL ausgesetzt, um eine PD-Pathologie über eine Dysfunktion des zellulären Redoxsystems nachzuahmen: Abbau des Glutathions (GSH) und Hemmung sowohl der antioxidativen Enzymaktivitäten (Cu/Zn-Superoxiddismutase und Katalase) als auch der mitochondrialen Aktivitäten Komplexe (I und II), die zu Apoptose und Nekrose führen [26]. In dem anderen Modell induziert Glu potenziell tödliche oxidative Schäden durch Störung des Redoxsystems. Beide Modelle in der SH-SY5Y-Zelllinie wurden zuvor in Neuroprotektionsstudien verwendet [26,27].

Zytoprotektive und/oder antioxidative Aktivitäten im Zusammenhang mit degenerativen Erkrankungen von K, iP, BAP, iPR, tZR und ihren freien Basen wurden getestet, und (wie oben beschrieben) wurde bei einigen CKs eine schützende Aktivität festgestelltneuronalZellen. Bisher veröffentlichte Studien haben jedoch die Struktur nicht untersucht.neuroprotektivAktivitätsbeziehung (SAR) von natürlichen CKs (Tabelle 1). Daher wurde diese Studie zur Überprüfung durchgeführtneuroprotektiv(Anti-Parkinson) Aktivitäten fast aller bekannten natürlich vorkommenden CKs in den ausgewählten SAL- und Glu-induzierten Modellen der Neurodegeneration. Zuerst bewerteten wir die Sauerstoffradikalabsorptionskapazität (ORAC) und (in Sicherheitstests) der Zytotoxizität jedes CKsNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen. Dann bewerteten wir die neuroprotektiven Wirkungen und den Einfluss der Verbindungen auf oxidativen Stress, indem wir die Produktion von Superoxid (O 2 .) (Dihydroethidium, DHE-Assay) und apoptotische Caspase-3,7-Aktivitäten maßen. Die Ergebnisse liefern die ersten veröffentlichten systematischen Hinweise auf die Beziehungen zwischen den Strukturen natürlicher CKs undneuroprotektivAktivitäten.

Cistanche herbahat eine sehr guteneuroprotektivWirkung

2. Ergebnisse und Diskussion

2.1. Sauerstoffradikal-Absorptionskapazität von Cytokininen (ORAC)

Da neurodegenerative Erkrankungen mit erhöhtem oxidativem Stress einhergehen, spielt die antioxidative Aktivität eine Schlüsselrolle bei der Abwehr vonneuronalZellen. Um das biologische Potenzial von CKs in dieser Hinsicht zu beurteilen, wurde die antioxidative Kapazität durch ORAC bestimmt, das üblicherweise zur Bestimmung der antioxidativen Kapazität von Substanzen verwendet wird [28]. Die antioxidative Kapazität wurde als Trolox-Äquivalente (TE) ausgedrückt, die die Wirksamkeit (niedriger bis höher) von Verbindungen als Trolox auf äquimolarer Basis bestimmen. Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Topoline (oT, mT und pT) und ihre Riboside (oTR, mTR, pTR) hohe antioxidative Aktivitäten aufweisen, die wahrscheinlich eng mit dem elektronenreichen System ihres C{{ 3}}Hydroxybenzylaminosubstituent. Trotz ihrer hohen ORAC-Werte waren die Topoline nicht hochneuroprotektivAktivität. Mehrere heteroaromatische CKs, darunter K (N6--Furfurylaminopurin) und nichtaromatisches cis-Zeatin-O-Glucosid (cZOG), das ein 4-Hydroxy-3-methylbut{{7} }en-1-yl)amino-Substituent, zeigte ebenfalls eine hohe antioxidative Kapazität (Tabelle 2). Andere CK-Metaboliten – einschließlich Kinetin-3-glucosid (K3G), Kinetinribosid 5<-monophosphate (kmp),="" kinetin-9-glucoside="" (k9g),="" and="" trans-zeatin=""><- monophosphate="" (tzmp)—had="" moderate="" antioxidant="" activity.="" all="" the="" others="" had="" detectable="" capacity="" except="" bap.="" these="" results="" confirm="" previous="" findings="" that="" ip,="" pt,="" k="" can="" act="" as="" direct="" radical="" scavengers,="" but="" conflict="" with="" the="" previously="" reported="" activity="" of="" bap="" in="" the="" orac="" test="" [20,21].="" to="" conclude,="" these="" compounds="" have="" potential="" in="" the="" treatment="" of="" neurodegenerative="" diseases="" associated="" with="" increased="" oxidative="" stress="">

Cistanche Stamm VorteileanAnti-Alzheimer-Krankheit

2.2. Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen

Um CKs zu studierenneuroprotektivWirkungen wurden SH-SY5Y-Neuroblastomzellen (aus bereits beschriebenen Gründen ausgewählt [23]) durch Exposition gegenüber 10 uM ATRA für 48 h wie zuvor beschrieben differenziert [23,24]. Sie wurden dann unter Verwendung eines Membranfärbekits gefärbt, um morphologische Unterschiede zwischen undifferenzierten und differenzierten Zellen zu untersuchen. Wie in Abbildung 1A gezeigt, dieNeuron-artig differenzierte Zellen wuchsen weniger dicht, waren verlängerter und produzierten mehr Neuriten (in der Abbildung durch gelbe Pfeile angedeutet) als die undifferenzierten Zellen. Diese morphologischen Veränderungen im Zusammenhang mit der Differenzierung wurden zuvor sogar nach kürzerer Exposition (24 h) gegenüber ATRA beobachtet [24,30]. Noch wichtiger ist, dass die Anzahl der Neuriten dramatisch auf ein Niveau ansteigt, bei dem sie ein Neuritennetzwerk bilden können. Aus diesem Grund wurde die Zelllebensfähigkeit gemessen, um die Proliferationsrate von undifferenzierten und differenzierten SH-SY5Y-Zellen zu vergleichen. Die Lebensfähigkeit von undifferenziertem SH-SY5Y wurde als maximale Proliferationsrate angenommen. Die Ergebnisse liegen in

Abbildung 1B zeigt, dass die Proliferationsrate (bewertet durch Calcein-AM-Viabilitätsassay) von SH-SY5Y nach 48 h ATRA-Behandlung um 23 Prozent reduziert war.

Abbildung 1. (A) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von SH-SY5Y-Zellen mit Membranen, die mit einem Neurite Outgrowth Kit (Invitrogen™) gefärbt wurden: Kontrolle, undifferenzierte Zellen (einer Scheinbehandlungslösung ausgesetzt:<0.1% dmso);="" cells="" differentiated="" by="" exposure="" to="" 10="" um="" all-trans="" retinoic="" acid="" (atra)="" for="" 48="" h.="" bars="50" um.="" (b)="" proliferation="" rates="" of="" undifferentiated="" and="" differentiated="" sh-sy5y="" cells:="" numbers="" of="" viable="" cells="" after="" 48="" h="" exposure="" to=""><0.1% dmso="" and="" 10="" um="" atra,="" respectively.="" data="" were="" obtained="" from="" five="" independent="" experiments="" with="" triplicate="" cultures:="" asterisks="" show="" the="" significance="" of="" differences="" in="" numbers="" of="" viable="" cells="" (as="" percentages="" of="" numbers="" of="" undifferentiated="" cells)="" between="" the="" cultures:="" *="" p="" <="">

Tabelle 2. Sauerstoffradikalabsorptionskapazität (ORAC) der getestetenCytokinine(CKs) ausgedrückt als Trolox-Äquivalente (TE) auf äquimolarer Basis. Namen, Abkürzungen und Strukturen der CKs sind in Abbildung 1 dargestellt.

2.3. Zytotoxizität von Cytokininen gegenüber neuronenähnlichen SH-SY5Y-Zellen

In Tests der potenziellen Zytotoxizität der CKs mit dem Calcein-AM-Viabilitätsassay [31] zeigten die meisten eine geringe Toxizität gegenüber denNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen. Die Abnahme der Lebensfähigkeit unter 90 Prozent wurde als Schwellenwert für eine neurotoxische Wirkung angesehen. Die einzigen beiden Ausnahmen waren KR (11,9 Prozent) und pTR (10,5 Prozent), die nach bisherigen Erkenntnissen einigeCytokininMetaboliten, insbesondere Riboside, können zytotoxisch wirken [32]. Andere Riboside, wie z. B. cZR, iPR, oTR, mTR, verursachten keine offensichtliche Reduktion derNeuron-wie die Lebensfähigkeit von SH-SY5Y-Zellen (Tabelle 3). DFO [33,34] und NEC-1 [35,36], die als positive Kontrollen in unserem In-vitro-Modell verwendet wurden, erwiesen sich auch durch andere Studien an SH-SY5Y-Zellen als nicht toxisch. Zusammenfassend zeigten hauptsächlich die Derivate KR und pTR eine geringere Lebensfähigkeit als 90 Prozent und wurden daher als weniger interessant für die weitere Bewertung in beiden In-vitro-Modellen der Neurodegeneration angesehen.

Tabelle 3. Zelllebensfähigkeit vonNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen nach Exposition gegenüberCytokininefür 24 Std. Die Lebensfähigkeit wird als Prozentsatz der DMSO-Kontrolle ausgedrückt.

2.4. Identifizierung von neuroprotektiven Cytokininen im SAL-induzierten Modell von PD

Für diese PrüfungenneuronalSH-SY5Y-Zellen wurden 48 h lang differenziert und dann mit 5 00 µM SAL und jeweils CK in drei Konzentrationen (0,1, 1, 10 µM) co-behandelt. Wie durch die gepunktete Linie in Abbildung 2A gezeigt, verringerte die Anwendung des Neurotoxins SAL bei 500 uM die Lebensfähigkeit von differenzierten SH-SY5Y-Zellen gemäß dem Calcein-AM-Assay um 30 Prozent. N-Acetylcystein (NAC) wurde in diesen Tests aufgrund seiner zuvor berichteten neuroprotektiven Wirkung in demselben auf SH-SY5Y-Zellen basierenden In-vitro-Modell als Positivkontrolle verwendet [37]. Konzentrationen von 10, 100 und 1000 uM NAC wurden verwendet, um eine teilweise oder fast vollständige Wiederherstellung im SAL-Modell zu induzieren. NAC war in der Lage, die Zelllebensfähigkeit bei einer Konzentration von 100 uM und 1 mM zu erhöhen, was 83,39 ± 1,74 Prozent bzw. 89,21 ± 2,89 Prozent entspricht. Die Schutzaktivität von NAC bei 100 uM (angezeigt durch die gestrichelte Linie in 2A ) wurde als Potenzschwelle für die Auswahl von CKs für weitere Tests verwendet. Gemäß diesem Setup wurden die biologisch signifikanten neuroprotektiven Aktivitäten mit K3G bei 10 μM (81,84 ± 2,36 Prozent), cZR bei 0,1 μM (81,14 ± 2,30 Prozent) und 1 μM (81,53 ± 2,24 Prozent) und iPR bei 1 beobachtet uM (82,43 ± 2,51 Prozent). Somit waren iPR und cZR wirksame Neuroprotektiva bei niedrigeren mikro- oder submikromolaren Konzentrationen als NAC. DasCytokininDas Screening ergab auch, dass viele andere Metaboliten die Lebensfähigkeit differenzierter SH-SY5Y-Zellen, die SAL ausgesetzt sind, moderat erhöhen können. Einige getestete CKs (einschließlich tZR, tZMP, mT, mTR, pT und pTR) hatten jedoch eine sehr geringe Schutzwirkung.

Abbildung 2. (A)NeuroprotektivTätigkeit vonCytokinineund N-Acetylcystein (NAC) im SAL-induzierten Modell von PD anNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen. Die gestrichelte Linie zeigt die NAC-Wirkungsschwelle, bei derCytokininewurden für weitere Tests ausgewählt; die gepunktete Linie zählt dann die Anzahl der lebenden Zellen im Calcein-AM-Test nach der Behandlung der Zellen mit 500 uM SAL; gesunde Kontrollzellen (CTR, DMSO < 0,1="" prozent).="" verdreifacht="" sich="" an="" mindestens="" drei="" getrennten="" tagen.="" (b)="" normalisierter="" sh-sy5y-zelltod="" nach="" propidiumiodid-färbung.="" verdreifacht="" sich="" in="" mindestens="" fünf="" unabhängigen="" tagen.="" *="" p="" verglichen="" mit="" dem="" fahrzeug="" mit="" 500="" µm="" sal,="" #="" p="" verglichen="" mit="" dem="" fahrzeug="" ohne="" 500="" µm="">

Um die Anti-PD-Aktivitäten der aktivsten natürlichen CKs zu bestätigen, wurden die gesamten Zelltodraten durch Propidiumiodid (PI)-Färbung quantifiziert, die (im Gegensatz zu Zellstoffwechsel-basierten Lebensfähigkeitstests) nur Zellen mit beeinträchtigter Membranintegrität, sterbende Zellen, markiert , und bereits abgestorbene Zellen [38]. Die Ergebnisse wurden in Bezug auf die Zelltodrate nach der Behandlung mit SAL allein (auf 100 Prozent gesetzt) ​​normalisiert. Wie in Abbildung 2B gezeigt, verringerte die NAC-Positivkontrollsubstanz die Zelltodraten sowohl bei 100 als auch bei 1000 uM signifikant (auf 77,3 ± 2,21 Prozent bzw. 77,5 ± 4,44 Prozent). Insgesamt erwies sich NAC als einneuroprotektivMittel mit vergleichbaren Aktivitäten wie in anderen Studien in dosisabhängiger Weise (im Bereich von 50–500 µM) für SH-SY5Y-Zellen [37]. Der PI-Assay zeigte auch, dass die CKs cZR, K3G und iPR schützende Aktivitäten haben, insbesondere cZR, was die Zelltodrate auf 71,6 ± 5,08 Prozent bei 0,1 uM reduzierte. Im Gegensatz zu cZR hatte K3G umgekehrte dosisabhängige Wirkungen, mit einer maximalen Aktivität bei 10 uM (Reduzierung der Zelltodrate auf 75,0 ± 3,69 Prozent) und der Aktivität von NPR bei 1 uM (Reduzierung der Rate auf 73,9 ± 4,99 Prozent). Zusammengenommen, wie in Abbildung 2 gezeigt, lieferten CKs ein VergleichbaresneuroprotektivAktivität auf 100 &mgr;M NAC gemäß sowohl dem Lebensfähigkeits- als auch dem Zytotoxizitätsassay. Darüber hinaus waren die effektiven Konzentrationen von CKs wie cZR und iPR im submikromolaren und mikromolaren Bereich viel niedriger als die von NAC. Frühere Beobachtungen nach Doppelfärbung mit PI und Annexin V/PI deuten darauf hin, dass K die Apoptose reduzieren kann [39], daher untersuchten wir auch die Auswirkungen von CKs und NAC auf oxidativen Stress und Caspase-3,7-Aktivierung (eine gut bekannter Apoptosemarker).

2.5. Cytokinine verringern die SAL-induzierte Bildung von Superoxid-Radikalen

Oxidativer Stress (OS) ist ein wesentlicher pathologischer Faktor für mehrere neurodegenerative Erkrankungen, und sowohl SAL (bei > 100 µM) als auch Tetrahydroisochinoline sind starke OS-Induktoren [26,40]. Daher haben wir auch die Bildung von Superoxid (einem ROS- und wichtigen OS-Marker) in Gegenwart von SAL mit und ohne ausgewählte CKs oder NAC gemessen. Um sicherzustellen, dass SAL in SH-SY5Y-Zellen einen ausreichenden OS-Schaden verursachte, um Reaktionen nachzuweisen, wurden die Zellen 24 Stunden lang 500 μM SAL ausgesetzt, wie in früheren Arbeiten [37] und in Übereinstimmung mit den oben präsentierten Ergebnissen. Die Zellen wurden dann mit Dihydroethidium (DHE) gefärbt, um die Bildung von Superoxidradikalen nachzuweisen [41,42]. Wie in 3A zu sehen ist, wurden die Zellen nach der Markierung mit DHE (das nach der Reaktion mit Superoxid rote Fluoreszenzsignale liefert) visuell beobachtet. SAL induzierte einen deutlichen Anstieg der DHE-Fluoreszenz relativ zu den Konzentrationen in Kontroll- und NAC-behandelten Zellen. Darüber hinaus hatten drei CKs (cZR, K3G und iPR) ähnliche visuelle Effekte wie NAC (100 uM) auf die DHE-Fluoreszenz. Darüber hinaus stimmte die spektrophotometrische Quantifizierung in Bezug auf die Konzentrationen, die in Zellen nachgewiesen wurden, die nur mit SAL behandelt wurden (als 100 Prozent festgelegt), mit der mikroskopischen Beobachtung überein. Wie in Abbildung 3B gezeigt, betrug der normalisierte Superoxidspiegel in gesunden Kontrollzellen (CTR) weniger als 39 Prozent, und die positive Kontrollsubstanz NAC führte zu einer moderaten bis vollständigen Reduktion der SAL-induzierten ROS-Produktion bei 100 und 1000 uM (auf 76,3 ± 4,33 und 44,3 ± 5,12 Prozent), was darauf hindeutet, dass die Glutathion (GSH)-Verarmung eine Schlüsselrolle in dem Modell spielt [26]. Interessanterweise induzierte SAL eine dramatische Verringerung des GSH-Gehalts von SH-SY5Y-Zellen, begleitet von einer Erhöhung des OS, auf ähnliche Werte wie zuvor in einer Studie beobachtet, in der auch NAC-vermittelte Wirkungen auf die Zelllebensfähigkeit, den Zelltod und den Glutathiongehalt aufgezeichnet wurden [43]. . Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass NAC auch die Bildung von Superoxid-Radikalen auf basale Niveaus reduzierte (dh Niveaus in DMSO-behandelten Kontrollen). CK-Riboside wurden in aktiven Konzentrationen (0,1–1 μM) zusammen mit K3G getestet und reduzierten den Gehalt an Superoxidradikalen der Zellen signifikant auf die folgenden Werte (relativ zu denen von Zellen, die nur mit SAL behandelt wurden): cZR 80,34 ± 5,99 Prozent bei 0,1 μM ; K3G 77,1 ± 4,89 Prozent bei 10 uM; iPR 79,2 ± 5,91 Prozent bei 1 µM, vergleichbar mit den Wirkungen von 100 µM NAC. Insgesamt weisen die orthogonalen Demonstrationen stark darauf hin, dass eine starke Anti-OS-Aktivität eine Schlüsselrolle bei den Schutzwirkungen von NAC und CKs im SAL-induzierten PD-Modell spielt. Eine Korrelation zwischen OS-Verbesserung und Neuroprotektion wurde auch von anderen Autoren festgestellt [29], und mehrere Studien haben herausgefunden, dass K und BAP OS-Aktivitäten direkt verbessern können [44] durch die Bildung von Komplexen mit Cu2 plus Ionen, was zu Superoxid-Dismutase- wie Aktivität [45,46]. CKs wurden jedoch auch als indirekte Antioxidantien mit Wirkungen beschrieben, die durch die Induktion des mit dem Kernfaktor Erythroid 2- verwandten Faktors 2 (NRF2) Antioxidans Response Pathway (iPR) [22] oder die teilweise Wiederherstellung der Glutathionperoxidase- und SOD-Aktivitäten vermittelt werden ( K) [16]. Darüber hinaus hat K Berichten zufolgeneuroprotektivAktivitäten gegen durch H2O2 induzierte OS-Schädigung in SH-SY5Y-Zellen [17]. Beide Arten der berichteten Anti-ROS-Aktivität von CKs könnten möglicherweise die Wirkungen von cZR, K3G und iPR bei der Reduktion von Superoxidradikalen im SAL-induzierten SH-SY5Y-Zell-PD-Modell erklären [47–50].

Abbildung 3. (A) Mikrofotografien, die SAL-induzierten oxidativen Stress und oxidativen Stress reduzierende Aktivitäten von zeigenCytokinineim Menschen differenziertNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen, sichtbar gemacht durch Fluoreszenzmikroskopie nach Markierung mit Dihydroethidium (DHE). Balken=50 ähm. Die Bilder zeigen Zellen, die mit DMSO-Lösung (Kontrollen), 500 uM Salsolinol (SAL) allein und Kombinationen aus 500 uM SAL und 1000 uM NAC (plus NAC), 0,1 uM cZR (plus cZR) behandelt wurden; 10 uM K3G (plus K3G), 1 uM iPR (plus iPR) für 24 h vor dem Färben mit DHE. (B) SAL-induzierte Bildung von Superoxidradikalen undCytokininoder N-Acetylcystein (NAC)-Schutzaktivität. Die Grafik zeigt die Quantifizierung von DHE-gefärbten Zellen mit dem Infinite M200 Pro Mikroplatten-Reader (Tecan, Österreich). Verdreifacht sich in mindestens fünf unabhängigen Tagen. * P verglichen mit dem Fahrzeug mit 500 µM SAL, # P verglichen mit dem Fahrzeug ohne 500 µM SAL.