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Angesichts dieser Ergebnisse untersuchten wir als nächstes, ob die hippocampale miR-466f-3p-Expression bei Mäusen beim räumlichen Lernen hochreguliert wurde undErinnerungBildung beeinflusste auch die neuronale Morphologie in vivo. Bedeutsamerweise fanden wir heraus, dass die durchschnittliche Wirbelsäulendichte der Hippocampus-Neuronen von GLN-Mäusen höher war als die von PLN-Mäusen, wie durch Golgi-Imprägnierung der Pyramide gezeigt wurde

Abbildung 3. Auswirkungen der Veränderung der miR-466f-3p-Expressionsniveaus im Hippocampus auf die MWM-Leistung der Maus

(A) Experimentelle Zeitachse der MWM-Aufgabe, Expressionsanalyse oder elektrophysiologische Messung des Mausgehirns nach Lentivirus-Injektion.

(B) Linke Tafeln: Expression von dsRed im Hippocampus der Maus. Repräsentative IF-Bilder mit niedriger und hoher Vergrößerung des Hippocampus von Mäusen, die mit rekombinanten Lentiviren infiziert sind, die nur dsRed als Kontrolle (linke Bildspalte) oder miR-466f-3p plus dsRed (rechts) exprimieren Bildspalte). Die eingerahmten Bereiche der oberen beiden Bilder sind vergrößert und unten dargestellt. Maßstabsleisten, 100 mm. Die gepunkteten Linien zeigen die Grenzen von DG an. Kerne wurden mit DAPI gefärbt. GCL, Körnerzellschicht; ML, Molekularschicht. Rechtes Histogramm, relative Expressionsniveaus von miR-466f-3p im Hippocampus der Maus, infiziert mit Lentiviren, die die Kontrolle oder miR-466f-3p exprimieren, wie durch RT-qPCR getestet ( n=16 pro Gruppe).

(C) MWM-Leistungen von Mäusen, die mit verschiedenen rekombinanten Lentiviren infiziert wurden, verpackt unter Verwendung von fünf verschiedenen Plasmiden, die nur dsRed, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ exprimieren {5}}p- bzw. miR/SCR-Schwämme in ihren Hippocampus (n=13, 26, 16, 19 bzw. 11 pro Gruppe). Linkes Feld: Fluchtlatenz während des Trainings. Rechtes Feld: individuelle Fluchtlatenz bei der 6. Sitzung.

Die in (B) gezeigten Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt, und die in (C) gezeigten Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde durch den ungepaarten t-Test (B), zweifache ANOVA mit Post-hoc-Vergleich nach Bonferroni (C, linkes Feld) oder einfache ANOVA mit Post-hoc-Test nach Tukey (C, rechtes Feld) bewertet. Statistische Unterschiede: #p < 0,05,="" **/##p="">< 0,01="" und="" ****p="">< 0,0001;="" *mir-466f-3p="" im="" vergleich="" zu="" anderen;="" #mir-schwamm="" versus="">

Neuronen im GLN- und PLN-Hippocampus der Maus (Abbildung S3). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Hochregulierung von miR-466f-3p im Hippocampus das Neuritenwachstum und die Bildung dendritischer Stacheln fördert, was der Induktion der Stacheldichte ähnelt, die im Hippocampus von GLN-Mäusen im Vergleich zu PLN-Mäusen beobachtet wird.

miR-466f-3p moduliert positiv das räumliche Lernen der Maus undErinnerungLeistung sowie synaptische Plastizität

Es sollte untersucht werden, ob miR-466f-3p das räumliche Lernen der Maus positiv reguliert undErinnerungFormation verwendeten wir einen rekombinanten Lentivirus-Infektionsansatz, um die miRNA im Hippocampus der Maus zu überexprimieren. Die Mäuse wurden 7 Tage nach der Lentivirus-Injektion in das DG analysiert (Abbildung 3A). Repräsentative Bilder der Hüftexpressionsniveaus von miR-466f-3p waren tatsächlich in der Gruppe mit miR-466f-3p-Überexpression im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht (rechtes Histogramm in Abbildung 3B). Wir fanden heraus, dass Mäuse mit Hippocampus-Überexpression von miR-466f- 3p und der MWM-Aufgabe unterzogen wurden, Escape-Latenzen von 88 ± 5 s in der 1. Sitzung und 19 ± 1 s in der 6. Sitzung aufwiesen (rot Punktlinie, Abbildung 3C), die besser waren als bei Vektorkontrollmäusen (schwarze Linie) oder mutierten Kontrollmäusen (rote Kreislinie) und ähnlich den Fluchtlatenzen von GLN-Mäusen, die in Abbildung 1A beschrieben sind. Parallel dazu untersuchten wir die Wirkung des miR-466f-3p-Funktionsverlusts auf das räumliche Lernen undErinnerungdurch Hemmung von miR-466f-3p mit miR-Schwamm. Bemerkenswerterweise war die MWM-Leistung von Mäusen, bei denen miR-466f-3p aus dem Hippocampus durch den miR-Schwamm eingefangen wurde, ähnlich der von PLN-Mäusen, dh sie lernten nicht einmal dadurch, die Plattform zu finden die letzte Sitzung (durchgezogene grüne quadratische Linie,

Abbildung 3C). Darüber hinaus schienen Mäuse, denen Lentivirus injiziert wurde, die homöostatische Plastizität nicht gestört zu haben, da einige Mäuse in jeder Gruppe während der letzten Sitzung gelernt hatten oder zumindest dabei waren, zu lernen (Abbildung 3C, rechtes Histogramm).

Angesichts der Tatsache, dass die Überexpression von miR-466f-3p im Maushippocampus ihr Lernen verbessert undErinnerunghaben wir die vergleichende Elektrophysiologie kultivierter Hippocampus-Neuronen analysiert, die unterschiedliche Niveaus von miR-466f-3p exprimieren. Der exzitatorische postsynaptische Miniaturstrom (mEPSC) von DIV14 Hippocampus-Neuronen, die miR-466f-3p oder mut-miR-466f-3p, miR-Schwamm oder Kontrolle überexprimieren, war aufgezeichnet mit Whole-Cell-Patch-Clamps. Während es keine signifikanten Unterschiede in der mEPSC-Amplitude, dem Anstieg von Tau oder dem Abfall von Tau zwischen den vier Probensätzen gab, war die mEPSC-Frequenz von Neuronen, die miR-466f-3p überexprimierten, signifikant höher im Vergleich zu anderen Gruppen (Abbildung 4A), was darauf hindeutet, dass postsynaptische Glutamin-Rezeptoren bei miR-466f- 3p-Überexpression stärker aktiviert wurden.

Anschließend haben wir die Langzeitpotenzierung (LTP) gemessen, um die Rolle von miR-466f-3p bei der synaptischen Plastizität in vivo direkt zu bestimmen. Wein injizierte den Hippocampus von Mäusen mit rekombinantem Lentivirus, wie in Abbildung 3 beschrieben, und induzierte dann LTP in Hippocampus-Schnitten durch tetanische Stimulation (drei Hochfrequenz-Stimulationszüge [3xHFS]) des Schaffer-Kollateralwegs. Wir fanden heraus, dass unser Protokoll LTP in allen Gruppen induzierte, wie durch den anhaltenden Anstieg der feldexzitatorischen postsynaptischen Potenziale (fEPSPs) in der Region Cornu Ammonis 1 (CA1) belegt (Abbildung 4B, linkes Feld). Das LTP war stärker in miR-466f-3p-überexprimierenden Schnitten (188 % ± 2 % der Grundlinie 40–50 min nach der Stimulation, Mittelwert ± SEM) im Vergleich zu Mutanten (169 % ± 1 %). des Ausgangswerts), SCR-Schwamm (173 % ± 3 % des Ausgangswerts) und Kontrollvirus-infizierte Schnitte (159 % ± 2 % des Ausgangswerts) als miR-466f-3p-Hemmung durch miR-Schwamm reduzierte die LTP (128 Prozent ± 1 Prozent der Grundlinie) im Vergleich zu Kontrollen (Abbildung 4B, rechtes Feld). Wir haben auch den LTP der GLN- und PLN-Gruppen nach dem Training gemessen. Die jeweiligen Daten zeigten auch signifikante Unterschiede in der fEPSP-Steigung in der CA1-Region zwischen den GLN- und PLN-Gruppen (Abbildung 4C). Somit verbessert ein erhöhtes miR-466f-3p-Niveau die LTP und die synaptische Plastizität, was wiederum das Lernen fördern kann undErinnerungFähigkeit von Mäusen. Zusammen zeigen die in den Abbildungen 2, 3 und 4 dargestellten Daten, dass miR-466f-3p eine entscheidende positive Rolle beim räumlichen Lernen spielt undErinnerungBildung, wahrscheinlich durch Verbesserung der Wirbelsäulenbildung, LTP und der Stärke der synaptischen Plastizität.

Mef2a-mRNA ist ein regulatorisches Ziel von miR-466f-3p

Wir führten eine bioinformatische Analyse durch, um potenzielle Ziel-mRNAs zu identifizieren, die durch die Bindung von miR-466f-3p an ihre 30 UTRs reguliert werden. Unter den von uns identifizierten Kandidaten war die Mef2a-mRNA, die für MEF2A kodiert. Interessanterweise wurde zuvor festgestellt, dass die MEF2A-Expression nach dem MWM-Training herunterreguliert war, und eine Überexpression dieses Faktors wirkte sich negativ auf die Leistung von Mäusen aus (Cole et al., 2012). Daher haben wir einen Luciferase-Reporter-Assay verwendet, um zu untersuchen, ob miR-466f-3p die Translation von Mef2a-mRNA durch Bindung an seine 30 UTR reguliert. Wir fügten Wildtyp- oder mutante Mef2a 30 UTR-Sequenzen stromabwärts einer SV40--Promotor-gesteuerten Luciferase-cDNA (Luc) ein, was zum Reporterplasmid psiCHECK2-MEF2A 30 UTR oder psiCHECK2- führte. mut-MEF2A 30 UTR (Fig. 5A). Wie im linken Histogramm von Abbildung 5B gezeigt, schwächte die Co-Expression von miR-466f-3p die von Mef2a 30 UTR gesteuerte Expression von Luciferase ab. Dieser Effekt schien von der Wechselwirkung zwischen miR-466f-3p und Mef2a 30 UTR abhängig zu sein, da entweder die vorhergesagte Bindungsstelle von miR-466f-3p an mutiert war die Mef2a 30 UTR (50-UGU-GUAU-30) oder die Saatregion von miR-466f-3p (50-AUACACA-30) die Erkennung von Mef2a 30 UTR hob die hemmende Wirkung von miR-466f-3p auf die Luciferase-Aktivität auf (Abbildung 5B, mittleres Histogramm). Darüber hinaus beseitigte die Co-Expression des miR-Schwamms, aber nicht des CR-Schwamms, auch die repressive Wirkung von miR-466f-3p auf die Luciferase-Aktivität (Abbildung 5B, rechtes Histogramm). Bemerkenswerterweise hatte weder die Überexpression von miR-466f-3p noch von miR-sponge irgendeine Auswirkung auf die Spiegel von Mef2a-mRNA in primären Hippocampus-Neuronen (Abbildung 5C), aber sie verringerten bzw. erhöhten die Spiegel des MEF2A-Proteins (Abbildung 5D). Wir fanden auch heraus, dass die Überexpression von miR-466f-3p bzw. miR-Schwamm den mRNA-Spiegel des aktivitätsregulierten Zytoskelett-assoziierten Proteins (Arc) in primären Neuronen des Hippocampus herunterregulierte oder heraufregulierte (Abbildung 5C). , das ein bekanntes nachgelagertes Ziel war, das durch MEF2A positiv reguliert wurde (Flavell et al., 2006)

Wir führten auch eine Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) durch, um miR-466f-3p nachzuweisen, und kombinierten sie mit IF-Markierung von MEF2A in DIV14-primären Hippocampus-Neuronen ohne oder mit Forskolin-Behandlung. Forskolin ist dafür bekannt, chemisches LTP zu induzieren und Adenylylcyclase zu aktivieren, wodurch die intrazellulären cAMP-Spiegel erhöht werden. Wir beobachteten eine nukleare Kolokalisation von MEF2A mit miR-466f- 3p, wie die repräsentativen Bilder in Abbildung 5E veranschaulichen. Nach der Forskolin-Stimulation stieg jedoch das miR-466f-3p-Signal sowohl in Soma als auch in Dendriten an, während das MEF2A-Signal in den

Zellkern verringert, wie durch die reziproken Änderungen der Intensitäten der MEF2A- bzw. Fast Red-Signale der einzelnen neuronalen Zellen gezeigt wird (Abbildung 5E). Zusammenfassend zeigen die Daten in den Abbildungen 5A–5E, dass miR-466f-3p die Expression des MEF2A-Proteins negativ reguliert, indem es an die 30 UTR der Mef2a-mRNA bindet und folglich dessen Translation unterdrückt.

In Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Ergebnissen stellten wir fest, dass die Hippocampus-Spiegel des MEF2A-Proteins bei GLN-Mäusen nach dem MWM-Training herunterreguliert waren, nicht jedoch bei PLN-Mäusen (Abbildung 5F). Darüber hinaus waren die relativen Spiegel von MEF2A in einzelnen GLN-Mäusen (Punkte) und PLN-Mäusen (Quadrate) umgekehrt korreliert mit den Spiegeln von miR-466f-3p (R=0.60, Abbildung 5G). So werden heterogene Muster des räumlichen Lernens uErinnerungFähigkeit werden durch stochastische Anstiege von miR- 466f-3p im Hippocampus bei einzelnen Mäusen und daraus folgende Abnahmen von MEF2A bei Stimulierung neuronaler Aktivität moduliert.

Stochastische Aktivierung des hippocampalen CREB und daraus folgende transkriptionelle Hochregulierung des miR- 466-669-Clusters während des MWM-Trainings

Wir untersuchten die Mechanismen, durch die miR-466f-3p im Hippocampus der Maus stochastisch durch die MWM-Aufgabe hochreguliert werden könnte. Es gibt drei miRNA-Vorläufer, die für miR-466f-3p kodieren, die alle zum Nagetier-spezifischen miR-466-669-Cluster gehören, der sich in Intron 10 seines Wirtsgens mSfmbt2 befindet (Inoue et al ., 2017) (Abbildung 6A). Interessanterweise gab es im Gegensatz zu miR-466f-3p keinen signifikanten Unterschied in den Expressionsniveaus von mSfmbt2 zwischen den GLN- und PLN-Gruppen (Abbildung 6B), was darauf hindeutet, dass der miR-466-669-Cluster ein separates Transkript kodieren könnte anstatt Teil des primären Transkripts von mSfmbt2 zu sein. Dementsprechend haben wir mehrere Sätze von Primern entwickelt, um das mutmaßliche primäre Transkript des miR-466-669-Clusters durch RT-qPCR zu identifizieren. Wie in Abbildung 6A dargestellt, ein langes PCR-Fragment (plus 282 bis 2.381), zusammen mit einer Reihe überlappender qPCR-Banden, nämlich A (plus 282 bis 115), B (131 bis 406), C (388 bis 686), D (662 bis 1.028), E (1.004 bis 1.299), F (1.242 bis 1.629), G (1.605 bis 2.029) und H (2.005 bis 2.381), konnten im Hippocampus der Maus nachgewiesen werden, aber nicht in Teil I (2.306 bis 2.776). ) (Daten nicht gezeigt). Diese Daten stützen, dass der miR-466-669-Cluster ein langes Transkript in der Nähe von etwa 2.388 bp stromaufwärts des ersten miRNA-Vorläufers codierte (dh Prä-Mir-466m, in Abbildung 6A mit Plus 1 bezeichnet). Bemerkenswerterweise war ähnlich wie bei miR-466f-3p die durchschnittliche Menge dieses Transkripts im Hippocampus von GLN-Mäusen höher als bei PLN-Mäusen (Abbildung 6C). So verbessertes Lernen undErinnerungFähigkeit von GLN-Mäusen ist auf die transkriptionelle Aktivierung des miR-466-669-Clusters zurückzuführen.

Die Aktivierung von nuklearem CREB durch Phosphorylierung während MWM-Aufgaben oder in anderen Formen des Lernens ist ein entscheidender Schritt, um kurzfristig in langfristig umzuwandelnErinnerung(Lisman et al., 2018; Rogerson et al., 2014). Daher haben wir untersucht, ob die unterschiedlichen Spiegel von miR-466f-3p bei einzelnen Mäusen, die sich der MWM-Aufgabe unterzogen haben, mit dem Aktivierungsstatus von CREB korreliert sein könnten. Um diese Idee zu untersuchen, untersuchten wir zunächst die Phosphorylierungsgrade von Hippocampus-CREB bei einzelnen Mäusen. Wie in 6D gezeigt, war die CREB-Aktivierung (durch Phosphorylierung am Rest S-133) bei GLN-Mäusen im Vergleich zu PLN- und HC-Mäusen verstärkt. Wir bestätigten auch, dass miR-466f-3p tatsächlich mit pCREB in Neuronen koexprimiert wurde, indem wir miRNA ISH in Kombination mit IF-Färbung von pCREB und MAP2 in primären hippocampalen Neuronen durchführten (Abbildung S2A). Darüber hinaus korrelierten die primären Transkriptspiegel des miR- 466-669-Clusters positiv mit pCREB in GLN-Mäusen (R=0.52), während sie negativ mit pCREB in PLN-Mäusen korrelierten (R=0 .71) (Abbildung 6E). Wir prüften auf eine Korrelation zwischen den Spiegeln eines anderen aktiven Faktors, der phosphorextrazellulären signalregulierten Kinase (pERK), und den primären Transkriptspiegeln des miR-466-669-Clusters. Wir fanden heraus, dass beide Arten von MWM-trainierten Mäusen positive Korrelationen zwischen dem miR-466-669-Clustersignal und pERK aufwiesen (R {= 0}.59 bzw. 0,48; Abbildung S4A), und es gab keinen Unterschied in pERK/ tERK-Expression zwischen diesen beiden Gruppen (Abbildung S4B). Um den Einfluss der CREB-Aktivierung auf die transkriptionelle Hochregulierung des miR-466-669-Clusters und folglich

Induktion von miR-466f-3p, wir verwendeten einen spezifischen CREB-Inhibitor, 666- 15 (Xie et al., 2015), in Kombination mit einer Forskolin-Behandlung von DIV14-primären Hippocampus-Neuronen. Forskolin ist dafür bekannt, die CREB-Phosphorylierung zu aktivieren (Malhotra et al., 2015). Wir fanden heraus, dass die Vorbehandlung von primären Hippocampus-Neuronen mit 666-15 die Forskolin-induzierte CREB-Aktivierung blockierte (Abbildung 6F) und die Spiegel von miR-466f-3p und miR-466-669-Cluster reduzierte Transkript (Figuren 6G und 6H). Gleichzeitig wurden auch die mRNA-Spiegel der bekannten pCREB-Zielgene nurr1 und homer1a (Bridi et al., 2017; Jensen et al., 2017) bei der 666-15-Behandlung reduziert (Abbildung 6H). Zusammengenommen zeigt Abbildung 6, dass die stochastische Aktivierung von CREB im Hippocampus einer Subpopulation von Inzuchtmäusen, die sich einer MWM-Aufgabe unterziehen, die Transkription des miR-466-669-Clusters und folglich die Induktion von miR-466f{{23) induziert }}p, wodurch ihr räumliches Lernen verbessert undErinnerungFähigkeit, die Aufgabe besser zu erfüllen.

DISKUSSION

Wir haben die mögliche Rolle von miRNAs bei der Modulation der unterschiedlichen Fähigkeiten des räumlichen Lernens und untersuchtErinnerungunter Inzucht-C57BL/6J-Mäusen. Wir schlagen vor, dass die stochastische Aktivierung von CREB und die daraus resultierende Hochregulierung des hippocampalen miR-466f-3p für das größere räumliche Lernen verantwortlich sind undErinnerungFähigkeit einer Untergruppe unserer Testmäuse, wahrscheinlich aufgrund der miR-466f-3p-vermittelnden translationalen Hemmung der Mef2a-mRNA, die für dieErinnerungNegativregulator MEF2A. Unsere Ergebnisse liefern ein Szenario, das die funktionelle und evolutionäre Rolle einer spezifischen miRNA bei der Regulierung der Kognition durch stochastische Induktion einer CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A-Achse durch Umweltreize demonstriert.

Die MWM-Aufgabe wurde häufig verwendet, um die unterschiedliche Fähigkeit des räumlichen Lernens zu untersuchen undErinnerungfür Nagetiere. Unter normalen Bedingungen verwenden Nagetiere distale Hinweise, um sich zu orientieren, wodurch sie die Position der versteckten Plattform in der Aufgabe lernen und sich merken können. Die meisten unserer ingezüchteten C57BL/6J-Testmäuse (62 Prozent) wiesen ein normales Muster der Fluchtlatenz auf und fanden die Plattform innerhalb von 3 0 s nach der 3. -6 Sitzung (Abbildung 1A, GLN). Im Gegensatz dazu lernte eine Gruppe von Mäusen (38 Prozent) die Aufgabe nicht einmal in der 6. Sitzung (PLN). Bemerkenswerterweise haben wir die Mäuse auch zwei weiteren Erkennungstests unterzogen. Der erste war der Novel Object Recognition (NOR)-Test, der ein einzelner Versuch ist, der auf angeborener Erforschung ohne Verstärkung oder Stress basiert, um das Verhalten zu motivieren (Leger et al., 2013). Die Korrelation zwischen den NOR- und MWM-Aufgaben in Bezug auf die Mausleistungen ist schlecht (R {{1{{20}}}}}, was der Korrelation zwischen NOR-Leistungen und den Hippocampus-Expressionsniveaus ähnlich ist von miR-466f-3p (R=0.01; Daten nicht gezeigt). Der NOR-Test zeigte auch keine Unterschiede im Diskriminierungsindex zwischen den MWM GLN- und PLN-Gruppen (0,36 ± 0,25 gegenüber 0,29 ± 0,18; Abbildung S1B). Das andere räumliche Lernen undErinnerung-abhängige Aufgabe, die wir angewendet haben, ist das Barnes-Labyrinth (BM), das dem MWM ähnlich ist. Es basiert auf der Annahme, dass Nagetiere, die in eine aversive Umgebung gebracht werden, lernen und sich die Position einer Fluchtbox merken sollten, die sich unter der Oberfläche der Plattform befindet. Wie in Abbildung S1C gezeigt, haben wir festgestellt, dass die Mausleistungen in den BM-Sondenversuchen auch positiv mit den Hippocampus-Expressionsniveaus von miR-466f-3p korrelieren. Somit ist die Induktion der CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A-Achse im Hippocampus während des Lernens undErinnerungBildung ist räumlich kontextabhängig.