Teil 2: Entzündungshemmende, antioxidative, feuchtigkeitsspendende und antimelanogene Wirkungen von Quercetin 3-O- -D-Glucuronid in menschlichen Keratinozyten und Melanomzellen über die Aktivierung von NF-κB- und AP-1-Signalwegen

Für weitere Einzelheiten wenden Sie sich bitte antina.xiang@wecistanche.com

Klicken Sie auf den Link, um Teil 1 zu lernen:https://www.xjcistanche.com/news/part-1-anti-inflammatory-antioxidant-moistu-55118257.html

3. Diskussion

In den zuvor veröffentlichten Studien wurde Q-3-G verwendet, um Ohrödeme, peritoneale Permeabilität und Lungenödeme zu hemmen [50] und wirkte als PotenzmittelAntioxidansim Blutplasma mit Low-Density-Lipoprotein [42], abnehmender Peroxynitrit-induzierter oxidativer Modifikation [51], Ausüben von anAntiphlogistikumWirkung durch Hemmung der JNK- und ERK-Signalwege unter LPS-Provokation [52] und besitzt Antikrebseigenschaften gegen Brustkrebszellen [56]. Im Gegensatz zu seiner weithin untersuchten Ausgangsverbindung,Quercetin, die pharmakologischen Vorteile und Mechanismen von Q-3-G müssen noch erforscht werden. Nach unserem besten Wissen ist die Rolle von Q-3-G auf die Hautschutzwirkung noch nicht vollständig aufgeklärt. In dieser Studie konzentrierten wir uns unter Verwendung verschiedener In-vitro-Bewertungen auf die Charakterisierung der hautschützenden Wirkung von Q-3-G gegen UVB oder H2O2, induzierten oxidativen Stress und Entzündungen, Hautfeuchtigkeit in HaCaT (einer menschlichen Keratinozyten-Zelllinie) undAntimelanogeneseAktivität in B16F10 (einer murinen Melanom-Zelllinie).

Die Lebensfähigkeit von HaCaT-, B16F10- und HEK293T-Zellen wurde nach Behandlung mit Q-3-G über einen Bereich von nicht zytotoxischen Konzentrationen bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass es keine signifikante Hemmung der Zelllebensfähigkeit in HaCaT-, B16F10- und HEK293T-Zellen über Konzentrationen von Q-3-G bis zu 20 μM gab (Abbildungen 2a, 3a und 4f). Es wurde festgestellt, dass die Zelllebensfähigkeit in HaCaT-, B16F10- und HEK293T-Zellen bei Konzentrationen von O-3-G bis zu 20 μM niedriger war als die Konzentration von Quercetin, wenn es zur Untersuchung der zytotoxischen Wirkungen bei SCC verwendet wurde{{18} } und HSC-6-Zellen （50 μM）【57】oder Lebensfähigkeit der Spermien （50-100μM）【58】. Es wurde jedoch gezeigt, dass Q-3-G im Vergleich zu seinem Aglykon viel weniger toxisch ist [59]. Das Fehlen einer freien OH-Gruppe an der Dreierposition kann zu der weniger toxischen Wirkung von Q-3-G beitragen [29].

UVB-Strahlen mit einer Wellenlänge von 280-315 nm dringen in die obere Hautschicht ein und sind wirksamer als UVA und UVC[60]. UVB-Strahlen sind der Grund für die meisten Hautkrebsarten und den Zelltod. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Zellschäden in HaCaT-Zellen durch UVB-Bestrahlung induziert werden [61]. Folglich untersuchten wir die Zelllebensfähigkeit von HaCaT-Zellen nach UVB-Bestrahlung im Vergleich zur Q-3-G-Behandlung. Wie in früheren Berichten gezeigt wurde, ist UVB-Exposition einer der Hauptfaktoren, die zu geschädigten Zellen, Geweben und Organen führen [62,63]. Q-3-G stellte die durch UVB-Bestrahlung induzierte verminderte Lebensfähigkeit der Zellen wieder her (Abbildung 2b-d). Es wird gezeigt, dass die Ergebnisse der vorherigen Studie über die Wirkung und den Mechanismus der UVB-induzierten Zytotoxizität von Quercetin in HaCaT ähneln [64].

Klicken Sie hier, um weitere Produktinformationen zu erhalten

Mehrere Studien haben beschrieben, dass UVB schwere Entzündungsreaktionen fördern kann, die zu Hautproblemen führen [1,2,4,27].UVB aktiviert wichtige entzündungsfördernde Enzyme wie COX-2 und Zytokine wie TNF- . COX-2 ist ein entzündungsassoziiertes Enzym, das durch entzündungsfördernde Zytokine und Mediatoren ausgelöst wird [65], was die Entzündungsreaktion stimuliert. Da COX-2 den Entzündungsmediator PGE-2 produziert, induziert es eine Entzündungsreaktion [66,67] und TNF- ist das wichtigste entzündungsfördernde Zytokin [68] bei den Entzündungsreaktionen. Diese Entzündungsreaktionen verursachen Hautschäden, die zur Hautalterung führen [69]. Die mRNA-Expressionsniveaus des Entzündungsenzyms COX-2 und der entzündungsfördernden Zytokine TNF- wurden durch Q-3-G gehemmt (Abbildung 2e,). Nach einem zuvor veröffentlichten Ergebnis verringerte Quercetin auch die Genexpression und Produktion von TNF- [70]. Im Hinblick auf die antioxidativen Eigenschaften sind die Radikalfänger-Assays DPPH und ABTS schnelle, zuverlässige und reproduzierbare Methoden zur Bewertung der in vitroantioxidative Aktivitätvon reinen Verbindungen und Pflanzenextrakten [54] und wurden in weit verbreiteten Methoden verwendet, um die Abfangaktivitäten von natürlichen Verbindungen oder Extrakten zu untersuchen [1,46,71,72]. Es wurde festgestellt, dass Q-3-G die Reaktivität von Radikalen sowohl in Assays als auch in der Durchflusszytometrie in konzentrationsabhängiger Weise verringert. Diese Ergebnisse stimmen mit einer zuvor berichteten Studie überein, in der Q-3-G die Bildung von ROS in Phäochromozytom-PC-12-Zellen signifikant hemmte [34]. Neben der chemischen Wirkung mit antioxidativer Wirkung haben wir gezeigt, dass Q-3-G den Spiegel von Nrf2 erhöht, einem der wichtigen Regulatoren von oxidativem Stress in Zellen. Es wurde berichtet, dass mehrere Verbindungen oder natürliche Extrakte durch Nrf2--abhängige ARE-Signalgebung antioxidative Eigenschaften besitzen [46,73,74]. Zusammengenommen weisen diese Befunde darauf hin, dass Q-3-G antioxidative Aktivität besitzt (Abbildung 2g-j). Melanosom aus der Melaninsynthese kommt in intrazellulären Organellen vor [75-77]. Eine Überproduktion von Melanin kann das Hautbild und Hautkrankheiten im Zusammenhang mit Hyperpigmentierung beeinträchtigen. Wir fanden heraus, dass die Behandlung mit O-3-G in c-MSH-induzierten B16F10-Zellen die Melaninsekretion hemmte. Wie in früheren Arbeiten wird die intrazelluläre Melanogenese auch durch Quercetin-Metaboliten und einige Quercetin-3-O- -D-Glucopyranoside kontrolliert [24,78,79].

Die Aufrechterhaltung einer gesunden Haut erfordert eine ausreichende Hautfeuchtigkeit, und NMFs und HA spielen in diesem Prozess eine wichtige Rolle [12]. FLG ist ein Bestandteil der Hautbarriere, daher kann die erhöhte FLG-Expression mit der Befeuchtung in Verbindung gebracht werden [80]. In unserer Studie wurde festgestellt, dass Q-3-G die Feuchtigkeitsspeicheraktivität der Haut beeinflusst, indem es FLG und TGM-1 erhöht (Abbildung 3c,d). Die Expressionsniveaus von FLG und TGM-1 wurden durch JNK-, IKK- und IkBa-Inhibitoren (SP600125 bzw. Bay11-7082) blockiert. Wir haben uns auf MAPK-verwandte Enzyme konzentriert, weil unsere Studien darauf abzielten, die molekularen Mechanismen zu bestimmen, durch die Q-3-Ge seine hautschützende Wirkung entfaltet. JNK spielt eine wichtige Rolle bei der durch oxidativen Stress induzierten Apoptose von Keratinozyten [81]. Die Phosphorylierung von c-Jun, TAK1, MKK4 und INK wurde durch Q-3-G erhöht. Darüber hinaus erhöhte Retinol die Phosphorylierung von c-Jun, TAK1, MKK4 oder JNK nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass es einige Unterschiede in den inhibitorischen Eigenschaften zwischen Q-3-G und Retinol in der AP-1-Signalgebung gibt Weg. Wie in zuvor veröffentlichten Ergebnissen korreliert der JNK-c-Jun/AP-1-Weg mit der antiapoptotischen Wirkung vonQuercetin[82]. Im Vergleich zur vorherigen Studie [83] wurde festgestellt, dass diese Signalwege durch die Regulierung der NF-kB- und AP-1-Signalwege auch am zugrunde liegenden Mechanismus von Quercetin beteiligt sind. In Übereinstimmung mit dem Mechanismus der Ausgangsverbindung zeigen unsere Ergebnisse, dass der NF-kB-Weg auch in die hautschützende Wirkung von Q-3-Gaby durch die Aktivierung von p50, p65, IKK , IkB , Akt und Src einbezogen war nach Behandlung mit Q-3-G in HaCaT-Zellen. Darüber hinaus regulierte Q-3-G die AP-1--vermittelte Luc- und NF-B-Luc-Aktivität hoch (Abbildung 4). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die MAPK-vermittelte AP-1- und NF-kB-Signalgebung zu den Q-3-G-vermittelten hautschützenden Eigenschaften beigetragen hat.

4. Materialien und Methoden

4.1. Materialien

Q-3-G wurde von Sigma Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen. HaCaT-, HEK293T- und B16F10-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) bezogen. ABTS-Diammoniumsalz, DPPH, Ascorbinsäure (AA), ABTS und Retinol wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) gekauft. Fötales Rinderserum (FBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurden von Gibco (Grand Island, NY, USA) gekauft.3-(4-5-Dimethylthiazol{{ 7}}yl)-25-diphenyltetranatriumbromid (MTT) wurde von Amresco (Brisbane, Australien) bezogen. TRILzol und PCR-Premix wurden von Bio-D Inc. (Seoul, Korea) gekauft. Die cDNA-Synthesekits wurden von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) gekauft. Vorwärts- und Rückwärts-Primer für die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) wurden von Macrogen, Inc. (Seoul, Korea) synthetisiert. Alle Antikörper, die mit den phosphorylierten oder vollständigen Formen des Zielproteins verwandt sind, wurden von Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) gekauft.

4.2.Zellkulturen

HaCaT- und B16F10-Zellen wurden in DMEM mit 10 Prozent FBS und 1 Prozent Antibiotika (Streptomycin und Penicillin) kultiviert. HEK293T-Zellen wurden in DMEM mit 5 Prozent FBS und 1 Prozent Antibiotika kultiviert. Diese Zelllinien wurden in 5 % CO bei 37 Grad inkubiert.

4.3. Zellviabilitätstests

B16F10-Zellen wurden mit 2 × 10-Grad-Zellen pro Vertiefung in 96--Well-Platten für 24 h ausgesät, ihnen wurden unterschiedliche Konzentrationen von Q-3-G（0-20 μM） zugesetzt, und dann wurden sie für 48 h inkubiert. HaCaT-Zellen wurden in 96--Well-Platten plattiert, und die Zellen wurden mit 6 × 10 Grad Zellen/ml ausgesät. Nach Inkubation über Nacht wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Q-3-G （0-20 μM） für 24 h inkubiert. HEK293T-Zellen wurden bei 6 × 10 Grad Zellen/ml in 96-Well-Platten für 24 Stunden ausgesät und dann mit Q-3-G （0-20 μM） behandelt. Inkubierte Zellen wurden mit 10 &mgr;l/Vertiefung MTT-Lösung behandelt und nach 3 h wurden sie mit 100 &mgr;l MTT-Stopplösung behandelt. Unter Verwendung des herkömmlichen MTT-Assays zur Messung der Zelllebensfähigkeit [84] wurde die Extinktion bei 570 nm unter Verwendung eines Lesegeräts (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) gemessen.

4.4. mRNA-Analyse durch semiquantitative RT-PCR und quantitative Real-Time-PCR

HaCaT-Zellen wurden mit Q-3-G（5-30 μM） oder Retinol (10 ug/ml) für 12 h behandelt. RNA wurde unter Verwendung von TRI-Reagens gefällt, wie zuvor berichtet [85]. Ein cDNA-Synthesekit wurde verwendet, um die komplementäre DNA zu synthetisieren. Die RT-PCR wurde unter Verwendung spezifischer Reverse- und Forward-Primer durchgeführt. Primer für RT-PCR und Echtzeit-PCR sind in Tabelle 1 aufgeführt.

4.5. DPPH-Assay

Ein DPPH-Assay wurde verwendet, um die Radikalfängerkapazität von Q-3-G zu bewerten. Methanol wurde verwendet, um DPPH auf eine Endkonzentration von 250 &mgr;M aufzulösen. Dann wurden 475 ml DPPH gegeben

mit 5 ml Q-3-G (0-40 μM) oder AA (500 mM) bei 37 Grad für 30 min umgesetzt. Die Positivkontrolle war AA. Die Bestimmung des DPPH-Scavenging-Effekts und die Berechnung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [86].

4.6. ABTS-Assay

Ein ABTS-Assay wurde wie zuvor berichtet durchgeführt [72]. Kurz gesagt wurden gleiche Volumina von 7,4 mM ABTS-Lösung und 2,4 mM Kaliumpersulfatlösung gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur gehalten, um ABTS-Radikalkationen zu erzeugen. ABTS-Lösungen wurden in jede Vertiefung von 96--Well-Platten gegeben, mit der Zugabe von Q-3-G (0-40 μM) oder AA (500 mM) pro Vertiefung. Die Mischungen wurden 30 Minuten lang bei 37 Grad inkubiert, und dann wurde ihre Extinktion bei 730 nm gemessen.

4.7. Zellulärer ROS-Assay durch Durchflusszytometrie

Um die Bildung von intrazellulärem ROS zu überprüfen, wurde ein oxidationsempfindlicher Farbstoff, 2',7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFDA), verwendet. HaCaT-Zellen wurden UV ausgesetzt, und dann wurden die Zellen geerntet und mit 300 &mgr;l PBS mit 20 &mgr;M DCFDA für 30 min bei 37 Grad im Dunkeln resuspendiert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen und die Fluoreszenz wurde bei 485/535 nm mit einem Beckman CytoFLEX Flow Cytometer (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) gemessen.

4.8. Western-Blot-Analyse

HaCaT-Zellen wurden mit einer Dichte von 6 × 10-Grad-Zellen/ml ausgesät. Nach Inkubation über Nacht wurden unterschiedliche Konzentrationen von Q-3-G (0-10 μM) oder Retinol (10 ug/mL) zugegeben und weitere 24 h inkubiert. Proteinpräparation und Ganzzelllysate wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [87]. Spezifische Antikörper wurden verwendet, um die Gesamtform und die phosphorylierte Form von Jun, JNK, MKK4, TAK1, p50, p65, IKK, IkB, Src und Akt nachzuweisen, die mit Chemilumineszenzreagenzien sichtbar gemacht wurden [88].

4.9. Analyse des Melaningehalts und der Sekretion

B16F10-Zellen wurden mit einer Dichte von 2 × 10 Grad Zellen/ml in Platten mit 12- Vertiefungen ausgesät und über Nacht inkubiert. Das Kulturmedium wurde durch frisches Medium ersetzt, das mit Q-3-G (10-20 μM) oder Arbutin (1 mM) ergänzt war. Die Melaninproduktion wurde mit a-MSH (100 nM) für 48 h stimuliert. Für den Melaninsekretionsassay wurde die optische Dichte bei 475 nm gemessen. Danach wurden die Zellen geerntet, um den intrazellulären Melaningehalt zu bestimmen, wobei ein Lysepuffer verwendet wurde, um die Zellen zu lysieren und sie durch Zentrifugation (12,000 rpm, 5 min) zu pelletieren. Die konzentrierten Zellpellets wurden in 100 ml Auflösungspuffer (1 M NaOH, 10 Prozent DMSO) gelöst und bei 55 Grad geschmolzen. Die Extinktion wurde bei 405 nm unter Verwendung eines optischen Dichtelesegeräts gemessen [89].

4.10.UVB-Bestrahlung

HaCaT-Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 10 5 Zellen/ml in 6--Well-Platten unter Verwendung von serumfreiem MEM ausgesät und einem 24-stündigen Aushungern unterzogen. HaCaT-Zellen wurden mit G-3-Q für 30 min und dann UVB-Bestrahlung vorbehandelt. Dann wurden die HaCaT-Zellen mit PBS gewaschen und einer UVB-Bestrahlung (UVBLamp BLX-312, Vilber Lourmat, Frankreich) ausgesetzt. Die Energie der UVB-Bestrahlung betrug 30 mJ/cm2²【90】.

4.11.H2O2-Behandlung

HaCaT-Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät und 24 Stunden lang unter Verwendung von serumfreiem MEM ausgehungert. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen Q-3-G（5-10 μM vorbehandelt und nach 30 min mit H2O2 （500 μM） für 12 h inkubiert.

4.12. Luciferase-Reportergen-Assay

HEK293T-Zellen wurden mit einer Dichte von 3 × 10 Grad Zellen/ml in 24--Well-Platten ausgesät. Die HEK293T-Zellen wurden mit 2 ug Plasmiden übertragen, die AP-1-Luc oder NF-kB-Luc und b-Galactosidase enthielten, wobei Polyethylenimin verwendet wurde[91]. Nach 24 h Inkubation wurden die Zellen weitere 24 h mit Q-3-G（5-10 μM） oder Retinol (10 ug/mL) behandelt. Der Luciferase-Assay wurde mit einem Luminometer durchgeführt, wobei die Extinktion jeder Probe bei 475 nm unter Verwendung eines Spectramax 250-Mikroplattenlesegeräts (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) gemessen wurde, wie zuvor berichtet [92].

4.13. Aufnahme der Zellmorphologie

HaCaT-Zellen wurden in 6--Well-Platten mit einer Zelldichte von 1 × 10 Grad-Zellen/ml ausgesät. Die HaCaT-Zellen wurden mit G-3-Q für 30 min und dann UVB-Bestrahlung behandelt. Nach 24 h wurden 4×-, 10×- und 20×-Mikroskopobjektivfotos aufgenommen (Olympus, Tokyo, Japan).

4.14. Statistische Analyse

Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Der Mann-Whitney-Test und der Student-t-Test wurden verwendet, um die statistischen Unterschiede zwischen den Gruppen zu vergleichen. Ein p-Wert<0.05 was="" regarded="" as="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" spss(ver.25,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

5. Schlussfolgerungen

Unsere Forschung hat gezeigt, dass die entzündungshemmenden und antioxidativen Aktivitäten von Q-3-G vor Faktoren von oxidativem Stress und Entzündungen unter UVB-Bestrahlung und HO,-Exposition schützen. Wir haben auch gezeigt, dass Q-3-G in HaCaT-Zellen eine feuchtigkeitsspendende Wirkung hat. Zusätzlich zu der Antitimelanogenese-Wirkung von Q-3-G wurde gezeigt, dass es die Melaninsekretion in -MSH-induziertem B16F10 hemmt. Schließlich wurde die Wirkung von Q-3-G durch die Aktivierung von AP-1- und NF-kB-Signalwegen vermittelt. Die hautschützenden Aktivitäten von Q-3-G in menschlichen HaCaT-Keratinozytenzellen und B16F10-Mäusemelanomzellen sind in Abbildung 5 zusammengefasst. Diese Studie ergab, dass Q-3-G aufgrund seiner entzündungshemmenden, antioxidative, feuchtigkeitsspendende und antimelanogene Eigenschaften in menschlichen Keratinozyten und Melanomzellen über die Aktivierung von NF-kB- und AP-1-Wegen. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse eindeutig darauf hin, dass dieser konjugierte Metabolit das Potenzial hat, Hautzellen zu schützen. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Wirkung von Q-3-G in verschiedenen In-vivo-Modellen zu validieren, insbesondere in Bezug auf Hautschutzmodelle.

Verweise

1. Kim, E.; Hwang, K.; Lee, J.; Han, SY; Kim, E.-M.; Park, J.; Cho, JY Hautschützende Wirkung von Epigallocatechingallat. Int. J.Mol. Wissenschaft. 2018, 19, 173. [Querverweis]

2. Draelos, ZD Neue Behandlungen zur Wiederherstellung der Durchlässigkeit der epidermalen Barriere: Reparaturcremes für die Hautbarriere. Klin. Dermatol. 2012, 30, 345–348. [Querverweis] [PubMed]

3. Slominski, AT; Zmijewski, MA; Zbytek, B.; Tobin, DJ; Theoharides, TC; Rivier, J. Schlüsselrolle von CNI im Stressreaktionssystem der Haut. Endokrin. Rev. 2013, 34, 827–884. [Querverweis] [PubMed]

4. D'Orazio, J.; Jarrett, S.; Amaro-Ortiz, A.; Scott, T. UV-Strahlung und die Haut. Int. J.Mol. Wissenschaft. 2013, 14, 12222–12248. [Querverweis]

5. Rittie, L.; Fisher, GJ UV-Licht-induzierte Signalkaskaden und Hautalterung. Alterungsres. Rev. 2002, 1, 705–720. [Querverweis]

6. Videira, IF; Moura, DF; Magina, S. Mechanismen zur Regulierung der Melanogenese. Ein. BHs. Dermatol. 2013, 88, 76–83. [Querverweis] [PubMed]

7. Che, DN; Xie, GH; Cho, BO; Shin, JY; Kang, HJ; Jang, SI Schutzwirkung von Traubenstammextrakt gegen UVB-induzierte Schäden in der Haut von C57BL-Mäusen. J. Photochem. Photobiol. B 2017, 173, 551–559. [Querverweis]

8. Jeong, D.; Lee, J.; Jeong, SG; Hong, YH; Yoo, S.; Han, SY; Kim, JH; Kim, S.; Kim, JS; Chung, YS; et al. Artemisia Asiatica-Ethanolextrakt weist eine Anti-Photo-Aging-Aktivität auf. J. Ethnopharmacol. 2018, 220, 57–66. [Querverweis]

9. McDaniel, D.; Farris, P.; Valacchi, G. Atmosphärische Hautalterung – Mitwirkende und Inhibitoren. J.Cosmet. Dermatol. 2018, 17, 124–137. [Querverweis]

10. Rao, Lebenslauf; Kumpel, S.; Mohammed, A.; Farooqui, M.; Döscher, MP; Asch, AS; Yamada, HY Biologische Wirkungen und epidemiologische Folgen der Arsenexposition und Reagenzien, die Arsenschäden in vivo lindern können. Oncotarget 2017, 8, 57605–57621.

11. Sinha, K.; Das, J.; Kumpel, PB; Sil, PC Oxidativer Stress: Die mitochondrienabhängigen und mitochondrienunabhängigen Wege der Apoptose. Bogen. Giftig. 2013, 87, 1157–1180. [Querverweis]