Teil 2: Carbamyliertes Sortilin im Zusammenhang mit kardiovaskulärer Verkalkung bei Patienten mit chronischen Nierenerkrankungen

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Carbamyliertes Sortilin verändert die Ligandenbindung

Sortilin ist ein Korezeptor für mehrere Liganden.8 Die Carbamylierung von Lysin verändert die Eigenschaften der Lysin-Seitenkette erheblich, wodurch die positiv geladene Aminogruppe durch eine voluminöse polare Gruppe ersetzt wird, was möglicherweise die Ligandenbindung beeinflusst. Wir untersuchten die Wechselwirkungen der am häufigsten modifizierten Sortilin-Lysin-Seitenketten, die in gefunden wurdenchronisch NiereErkrankung(Aminosäuresequenz [Kristallstruktursequenz]), Lys95(62), Lys205(172), Lys260(227) und Lys294(261), durch In-silico-Modellierung, um mögliche Struktur-Funktions-Folgen der Lysin-Carbamylierung vorherzusagen. Wir verwendeten die vorhandene Sortilin-Ektodomänen-Kristallstruktur sowohl aus der Neurotensin-gebundenen Form bei neutralem pH (PDB Q24-Datei: 4PO7; Abbildung 3a) als auch aus der Liganden-freien Form bei saurem pH (PDB-Datei: 6EHO; Ergänzungstabelle S5).

Bei neutralem pH bildet Lys95(62) eine Salzbrücke mit Glu609(576) und eine Wasserstoffbrücke mit der Hauptketten-Carbonylgruppe von Arg90(57). Bei saurem pH ist die Wechselwirkung mit Glu609(576) enger, da der Abstand zwischen der Aminogruppe von Lys95(62) und der Carboxylgruppe von Glu609(576) nun die Bildung einer Wasserstoffbrücke ermöglicht, während die Wechselwirkung mit Arg90(57 ) ist nicht hier. Daher kann die Carbamylierung an Lys95(62) beide Sortilin-Konformationen destabilisieren. Somit würde die Carbamylierung an Lys205 möglicherweise die saure pH-Konformation von Sortilin begünstigen. Lys294(261) zeigt keine Wechselwirkungen sowohl bei neutralem als auch bei saurem pH.

Wirkungen von Cistanche: Behandlung von Nierenerkrankungen

Schließlich interagiert Lys260(227) bei neutralem pH-Wert mit Neurotensin-Tyr11 in der Ligandenbindungsstelle im b-Propeller-Tunnel von Sortilin. Da die Säure-pH-Sortilinstruktur keine Ligandenaffinität aufweist, finden wir in dieser Struktur keine Wechselwirkungen der Lys260(227)-Seitenkette. Die Wechselwirkung mit Neurotensin Tyr11 wird durch die Carbamylierung beeinflusst und könnte zu einer geringeren Affinität für Neurotensin führen. Interleukin 6 (IL-6), ein bekannter Sortilin-Ligand,20 bindet Sortilin über seinen C-terminalen Schwanz, der ein Arginin an der äquivalenten Position von Neurotensin-Tyr11 enthält. Daher könnte die Carbamylierung von Lys260(227) wahrscheinlich die Affinität für IL-6 erhöhen, ein potentieller Beitrag zur Gefäßverkalkung.

Nachfolgende Bindungsstudien unter Verwendung von Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie und SortCo oder SortCarb zeigten eine effizientere Bindung von IL-6 an SortCarb (KD ¼ 23 nM) im Vergleich zu Q25 mit nicht modifiziertem SortCo (KD ¼ 141 nM), was auf carbamyliertes Sortilin als potenzielles IL hindeutet -6-Bindungspartner (Abbildung 3b und c). Progranulin, ein weiterer bekannter Sortilin-Ligand,22 band an SortCo, aber eine Bindung an SortCarb konnte nicht nachgewiesen werden (ergänzende Abbildungen S7A und B). Sowohl SortCo als auch SortCarb sind an ein humanes Rezeptor-assoziiertes Protein gebunden, das mit einem GST-Tag fusioniert ist,23 aber nicht mit GST allein, was die strukturelle Q26-Integrität von Sortilin unabhängig von seinem Carbamylierungsstatus unterstützt und die Spezifität unseres Versuchsaufbaus demonstriert (ergänzende Abbildung S7C– F).

Als nächstes untersuchten wir, ob die veränderte Affinität zu IL-6 Signalwege beeinflussen könnte, die an der Gefäßverkalkung beteiligt sind. Bei kalzifizierenden hSMCs förderte die Zugabe von IL-6 zu SortCarb die ALPL- und RUNX2-mRNA-Expression (Abbildung 3d und e) sowie die TNAP-Aktivität (Abbildung 3f), während es in Kombination mit SortCo keine Wirkung hatte. Diese Daten zeigen, dass die Sortilin-Carbamylierung die Fähigkeit zur Ligandenbindung an IL-6 erhöht, was eine erhöhte Verkalkung glatter Muskelzellen verursacht.

Sortilin-Carbamylierung ist mit Gefäßverkalkung verbundenchronischNiereErkrankungPatienten Auf der Grundlage unserer Daten, bei denen eine Assoziation mit carbamylierten Sortilin-Rückständen festgestellt wurdechronischNiereErkrankungund Verkalkung untersuchten wir als nächsteschronischNiereErkrankungTeilnehmer der CARVIDA-Studie, bei denen computertomographische Scans CAC quantifizierten. Wie die Teilnehmer der CARE FOR HOME-Studie hatten die meisten CARVIDA-Teilnehmer 2 und 3 PTMs, wobei die Lysinreste 95 und 26 0 häufig betroffen waren (ergänzende Abbildung S8A). Verglichen mit Patienten ohne carbamylierte Reste waren Patienten mit 1 Sortilin-Carbamyl-Lysin-Resten älter (P ¼ 0.002), hatten eine niedrigere eGFR (P ¼ 0,008), waren höher häufig (ehemalige) Raucher (P=0,023) und hatten ein signifikant höheres CAC-Volumen (P <0,001; abbildung="" 4a="" und="" ergänzungstabelle="">

Ln-(CAC plus 1) zu Studienbeginn korrelierte mit dem Vorhandensein und Anstieg von posttranslational carbamyliertem Sortilin (Ergänzungstabelle S7). Darüber hinaus war Ln-(CAC þ 1) auch mit männlichem Geschlecht, Diabetes mellitus, antidiabetischen und lipidsenkenden Medikamenten, höherem Alter, Serum-IL -6 und Hämoglobin A1c sowie niedrigerer eGFR und Serum-Lipoprotein hoher Dichte ( Ergänzende Tabelle S7). Nichtsdestotrotz blieb die Assoziation zwischen carbamylierten Sortilin-Resten und Ln-(CAC ≥ 1)-Grundlinie nach Anpassung für alle oben erwähnten Variablen signifikant (P ¼ 0.029; Tabelle 3).

Wirkungen von Cistanche: Behandlung von Nierenerkrankungen

Als nächstes bewerteten wir, ob das Vorhandensein von carbamylierten Resten einen Einfluss auf die CAC-Progression hat. Das Vorhandensein von carbamyliertem Sortilin (gegenüber keiner Carbamylierung) erhöhte das Fortschreiten von CAC (P ¼ 0.047). Im Detail,chronischNiereErkrankungPatienten mit carbamyliertem Sortilin (n ¼ 33) zeigten eine signifikant erhöhte CAC-Progression über eine mediane Nachbeobachtungszeit von 4,4 Jahren (Abbildung 4b), mit einem jährlichen Anstieg des medianen CAC-Volumens von 30.32 Q27 (Interquartil Bereich ¼ 84,0) (Abbildung 4C). Im Gegensatz,chronischNiereErkrankungPatienten ohne Sortilin-Carbamylierung (n=8) zeigten eine jährliche Veränderung des medianen CAC-Volumens von 1,63 (Interquartilsabstand=8,54) und keine signifikante CAC-Progression während des Nachbeobachtungszeitraums (Abbildung 4b und c). Nach Bereinigung um die mit der CAC-Progression assoziierten Kovariaten (CAC-Ausgangsvolumen, Alter, Geschlecht, Body-Mass-Index, eGFR, Diabetes mellitus, Serum-IL-6, Serum-Lipoprotein hoher Dichte und lipidsenkende Medikation) war der Carbamylierungsstatus nicht mehr mit CAC-Progression assoziiert (P ¼ 0.286).

Patienten mit Carbamyl-Lysin-Rest 260 zeigten den höchsten Anstieg des CAC-Volumens als Patienten ohne carbamylierten Rest oder andere Carbamyl-Lysin-Reste als 260 (ergänzende Abbildung S8B).

Insgesamt weisen die Daten darauf hin, dass posttranslationales carbamyliertes Sortilin mit dem CAC-Volumen und seiner Progression bei Patienten mit assoziiert istchronischNiereErkrankung.

DISKUSSION

In verschiedenen experimentellen In-vitro- und In-vivo-Studien und 2 unabhängigen prospektiven Kohorten zeigen wir, dass Patienten mitchronischNiereErkrankungweisen in der Zirkulation ein spezifisches Muster von posttranslational carbamylierten Sortilin-Lysin-Resten auf, das auch in der Gefäßwand nachweisbar ist. Darüber hinaus war die Sortilin-Carbamylierung mit CAC in assoziiertchronischNiereErkrankungPatienten, unabhängig vom Alter,NiereFunktion und andere Risikofaktoren für Verkalkung. Mechanistisch konnten wir zeigen, dass die Carbamylierung von Sortilin seine Fähigkeit zur Bindung von IL-6 erhöht und direkt auf Gefäßzellen einwirkt, um die Gefäßverkalkung zu fördern (Abbildung 4d). Zusammengenommen enthüllte diese Studie einen neuen, nicht-traditionellen Risikofaktor für Verkalkung, der möglicherweise zu der hohen Belastung durch die Verkalkung beiträgtHerz-KreislaufKrankheiten einchronischNiereErkrankung.

Proteincarbamylierung kann durch Cyanat vermittelt werden, das während der spontanen Zersetzung von Harnstoff entsteht oder durch Myeloperoxidase-katalysierte Thiocyanat-Oxidation an Entzündungsstellen erzeugt wird.24 Wir haben das gezeigtchronisch NiereErkrankungPatienten mit höheren Harnstoffspiegeln aufgrund reduziertNiereFunktion wiesen mehr Sortilin-Carbamylierungsreste auf als gesunde Kontrollen. Wir fanden jedoch keinen Zusammenhang zwischen den Gesamtspiegeln und der Aktivität von Myeloperoxidase und der Sortilin-Carbamylierung, was darauf hindeutet, dass Urämie ein Hauptgrund für die Sortilin-Carbamylierung istchronischNiereErkrankung. Darüber hinaus zeigen unsere Daten, dass Alter, NT-proBNP und eine geringere Einnahme von Aldosteronantagonisten mit mehr carbamylierten Resten assoziiert sind. Unsere Daten stimmen mit früheren Berichten überein, die das Altern als signifikanten Vermittler der Proteincarbamylierung identifizierten.25 Es wurde gezeigt, dass die blutdrucksenkenden Medikamente Hydrochlorothiazid und Amlodipin den Homocitrullinspiegel, eine mit dem Harnstoffzyklus zusammenhängende Aminosäure und ein von der Carbamylierung abgeleitetes Produkt, beeinflussen.26 Ob die Einnahme von Aldosteron-Antagonisten Homocitrullin senkt und somit carbamylierte Rückstände reduziertchronischNiereErkrankungPatienten, ist unbekannt. Drechsleret al. zeigten eine Korrelation zwischen carbamyliertem Albumin im Serum und NT proBNP, was mit Herzinsuffizienz bei Dialyseabhängigen assoziiert warchronischNiereErkrankungPatienten.27 Ob die Carbamylierung von Sortilin auch als Risikofaktor für Herzinsuffizienz dienen kann, ist nicht bekannt, aber eine erhöhte Koronarverkalkung mit möglicherweise nachfolgenden schädlichen Auswirkungen auf die Herzfunktion könnte in unserer Studie den Zusammenhang zwischen carbamylierten Sortilin-Resten und NT-proBNP-Spiegeln erklären.

Auswirkungen von Cistanche-Ergänzungsmitteln: Behandlung von Nierenerkrankungen und Verbesserung der Immunität

Jüngste Studien identifizierten die Rolle von Sortilin bei der Pathogenese von Gefäß- und Stoffwechselerkrankungen, konzentrierten sich jedoch hauptsächlich auf die Gewebeexpression von Sortilin und nicht auf die Erforschung der Funktion der löslichen Form.7 Zirkulierendes Sortilin kann aus der zellulären Ablösung ihrer luminalen Domäne stammen, wie in vitro gezeigt wurde , 28–30, und aus sezernierten, mit Sortilin gepackten extrazellulären Vesikeln.9,31 Die Carbamylierung führt zu Veränderungen der Ladung, der strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Proteinen, was zu einem Funktionsverlust und möglicherweise zu pathophysiologischen zellulären und molekularen Reaktionen führt.5 Wir haben für die erste etabliert Zeit ein spezifisches Lysinrest-Carbamylierungsmuster von zirkulierendem Sortilin einchronischNiereErkrankung, unter Verwendung eines gezielten MS-Ansatzes, und prognostizierte funktionelle und strukturelle Veränderungen durch In-Silico-Modellierung. Wir schlagen vor, dass die Lysin-Carbamylierung die saure pH-Konformation von Sortilin begünstigt, was die pH-abhängige Ligandenaffinität von Sortilin beeinflusst. Frühere Kristallstrukturstudien zeigten, dass Sortilin bei pH 5,5, was eine Umgebung darstellt, die der von späten Endosomen ähnlich ist, Konformationsänderungen und Dimerbildung erfährt, wodurch bekannte Bindungsstellen für die Ligandenbindung nicht verfügbar sind.32,33

Lysin 260 bildet eine Wasserstoffbrücke zu einem Tyrosin von Neurotensin innerhalb des B-Propeller-Tunnels, was darauf hindeutet, dass andere Liganden, die ähnlich wie Neurotensin binden, ebenfalls betroffen wären. Unsere Untersuchung ergab eine erhöhte Affinität von IL-6 zu carbamyliertem Sortilin, was auf eine Beteiligung an IL-6-Signalwegen hindeutet. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass IL-6 zur Gefäßverkalkung beitragen kannchronischNiereErkrankung.22,34,35 funktionelle Rolle in der kalzifizierten Gefäßpathologie. Lösliches carbamyliertes Sortilin förderte die Gefäßverkalkung in vitro und ex vivo durch Erhöhung der osteogenen Zielgene, der TNAP-Aktivität und der Matrixmineralisierung. Darüber hinaus erhöhte die Zugabe von IL-6 zu carbamyliertem Sortilin die osteogenen Zielgene und die TNAP-Aktivität weiter.

Die Carbamylierung wurde mit Veränderungen der extrazellulären Matrix,36 oxidativem Stress,25 endothelialen Dysfunktionen37 und Atherosklerose38 in Verbindung gebracht, die alle an der Initiierung und Progression der Verkalkung beteiligt sind. Obwohl Mori et al. berichteten, dass die Proteincarbamylierung die Gefäßverkalkung durch die Carbamylierung von mitochondrialen Proteinen fördert,6 es wurden keine spezifischen Zielproteine ​​identifiziert. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass die Carbamylierung von Uromodulin in vitro zu einem Verlust seiner kalzifizierungshemmenden Eigenschaften führt. 39 Beide Studien verwendeten Western Blot, um die Carbamylierung im Allgemeinen nachzuweisen. Wir haben gezeigt, dass in vitro carbamyliertes Sortilin das spezifische in vivo-Modifikationsmuster von Lysin nachahmt, das in gefunden wirdchronischNiereErkrankungPatienten mit MS. Somit liefert unsere Studie Hinweise auf spezifische VerbindungsmechanismenchronischNiereErkrankung, Proteincarbamylierung, IL-6 und Verkalkung.

Zuvor waren hohe Sortilinspiegel im Serum sowohl mit abdominaler Aortenverkalkung als auch mitHerz-Kreislaufevents independent of traditional Framingham risk factors in a community-dwelling cohort of men aged >50 Jahre.10 Bei Brustschmerzpatienten mit niedrigem bis mittlerem Risiko waren die Sortilinspiegel nicht mit der Schwere der koronaren Herzkrankheit assoziiert.40 In dieser Studie konnten wir zeigen, dass Patienten mitchronischNiereErkrankunghaben höhere Sortilin-Spiegel als Kontrollen mit NormalNiereFunktion. Die Sortilin-Spiegel stiegen nicht an, wenn sie abnahmenNiereFunktion einmal hatte ein Patient achronischNiereErkrankungmit eGFR<60 ml/min="" per="" 1.73="" m2.="" however,="" we="" observed="" an="" increase="" of="" carbamylated="" sortilin="" residues="" with="" decreased="">NiereFunktion. In ähnlicher Weise haben Kalim et al. berichteten keinen Zusammenhang zwischen Gesamt- und carbamyliertem Albuminspiegel inchronischNiereErkrankungPatienten.41 Sortilin-Carbamylierung, die aus einer Beeinträchtigung resultiertNiereFunktion, könnte die vaskuläre Verkalkung im Zusammenhang mit weiter verstärkenchronischNiereErkrankung-assoziierte mineralische Störungen. Unsere Studie hat mehrere Stärken und Einschränkungen. Zu den Stärken gehört die Analyse von Daten, die in vitro, ex vivo und bei Patienten mit unterschiedlichen experimentellen Ansätzen gewonnen wurden. Die sorgfältige Charakterisierung von Patienten mitchronischNiereErkrankung, einschließlich standardisierter Fragebögen zur Erfassung der Teilnehmercharakteristika, persönlicher Studienbesuche durch ausgebildete Study Nurses und Messungen vieler Laborwerte und Verkalkungen, ist eine besondere Stärke der Studie. Die kleine Kohorte scheint unsere Studie einzuschränken; Wir haben jedoch unabhängig verwendetchronischNiereErkrankungKohorten mit Follow-up-Daten zur Verkalkung, um den Carbamylierungsstatus von Sortilin durch mühsame gezielte MS zu validieren. Die klinischen Befunde wurden in deutscher Sprache erstelltchronischNiereErkrankungPatienten und kann somit die Verallgemeinerbarkeit der Ergebnisse auf andere Länder oder Ethnien einschränken. Obwohl das Studiendesign eine Anpassung für viele wichtige Confounder erlaubte, kann schließlich, wie bei jeder Beobachtungsstudie, eine Restverzerrung nicht vollständig ausgeschlossen werden.

Wirkungen von Cistanche: Nierenversagen vorbeugen

Fazit

Zusammenfassend ist dies die erste Studie, die spezifische Aminosäuren zeigt, die in zirkulierendem Sortilin posttranslational modifiziert sind. Unsere Daten deuten darauf hin, dass das Vorhandensein vonchronischNiereErkrankungdie Carbamylierung von zirkulierendem Sortilin fördert und dass carbamyliertes Sortilin prokalzifizierende Eigenschaften aufweist, wie in vitro, ex vivo und durch die Anwesenheit in kalzifiziertem Gewebe gezeigt wurde. Sortilin-Carbamylierung war mit CAC assoziiert, auch nach Anpassung an das Alter,NiereFunktion und mehrere andere Risikofaktoren, was darauf hindeutet, dass die Verhinderung der Sortilin-Carbamylierung das Risiko für verringern könnteHerz-KreislaufVerkalkung und damitHerz-KreislaufKomplikationen bei Patienten mitchronischNiereErkrankung. Somit deuten unsere Ergebnisse auf carbamyliertes Sortilin als einen Beitrag zu derHerz-KreislaufKrankheitslast beichronischNiereErkrankungPatienten.

Zistanche

VERWEISE

Diese Quelle stammt von Vera Jankowski, IMCAR, Medizinische Fakultät, RWTH Aachen, Aachen, Deutschland usw.