Teil 2 Chemische und genetische Diskriminierung von Cistanches Herba basierend auf UPLC-QTOF/MS und DNA-Barcoding

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OPLS-DA und Markeridentifikation Um potentielle chemische Marker zur Unterscheidung der zwei Arten zu identifizieren, wurde der S-Plot von OPLS-DA erstellt (Fig. 3). Im S-Diagramm repräsentiert jeder Punkt ein tR–m/z-Ionenpaar. Die X- und Y-Achsen stellen den Beitrag bzw. das Vertrauen des Ions dar; Je weiter die Punkte des Ionenpaars tR–m/z von Null entfernt sind, desto größer ist der Beitrag/das Vertrauen dieses Symbols zum Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Somit repräsentiert das tR–m/z-Ion, das auf die beiden Enden des „S“ zeigt, die charakteristischen Marker mit dem höchsten Vertrauen in jeder Gruppe. Die OPLS-DA-Ergebnisse zeigten, dass UPLC-QTOF/MS zur Unterscheidung verwendet werden konnteCistanche DeserticolaausCistanche tubulosa(Abb. 3). Insgesamt wurden sechs glaubwürdige und signifikante Marker bestimmt, um die Unterscheidung dieser Gruppen zu erleichtern (Tabelle 3). Die Identitäten von drei potentiellen Markern wurden vorläufig zugeordnet. Die mit diesen drei Ionen korrelierten Komponenten wurden vorläufig als Isomere von Campneosid II, Cistanosid C und Cistanosid A identifiziert. Die Markerverbindungen a, b und c könnten verwendet werden, um die beiden Pflanzenarten zu unterscheiden, da die Ionenintensitäten von a und b inCistanche Deserticolawar höher als inCistanche tubulosa(Abb. 4A, 4B), und Marker c konnte darin nachgewiesen werdenCistanche tubulosa, aber nicht drinCistanche Deserticola(Abb. 4C).

DNA-Barcoding: Sequenzinformationen und Identifizierungseffizienz

Sequenzinformationen sind in Tabelle 4 gezeigt. Die durchschnittliche genetische Distanz von psbA-trnH (0.1732) war größer als die der anderen beiden Regionen (0.0740 , 0,1197) deutlich. Der durchschnittliche GC-Gehalt von psbA-trnH (20,64 Prozent) war geringer als in den anderen beiden Regionen (55,00 Prozent, 55,00 Prozent). Obwohl die Erfolgsrate von ITS und ITS2 in dieser Studie nicht erhalten wurde, schnitt die psbA-trnH-Region bei der PCR-Amplifikation und -Sequenzierung gut ab (100 Prozent, 87,23 Prozent). Die Identifikationseffizienz wurde durch die BLAST1-Analyse und die Nearest-Distance-Methode erreicht und spiegelte hauptsächlich die Erfolgsrate der Barcodes wider. Die psbA-trnH-Region war deutlich höher als die anderen zwei Barcodes in der Identifizierungseffizienz basierend auf zwei Methoden. Der Mangel an Sequenzen ist höchstwahrscheinlich der Grund dafür, dass die ITS-Region basierend auf der BLAST1-Methode eine Identifizierungseffizienz von 100 Prozent und basierend auf der Nearest-Distance-Methode 0 Prozent aufwies.

Analyse der genetischen Divergenz anhand von sechs Parametern

Sechs Parameter wurden verwendet, um die intraspezifische Variation und die interspezifische Divergenz unter Verwendung von drei Strichcodes zu analysieren (Tabelle 5). Der signifikante Unterschied zwischen inter- und intraspezifischen Variationen war ein Hinweis auf die Nützlichkeit der DNA-Barcodes. Hier war der minimale interspezifische Abstand von drei Barcodes alle größer als der maximale intraspezifische Abstand. Darüber hinaus hatte die psbA-trnH-Region einen größeren maximalen intraspezifischen Abstand und einen größeren durchschnittlichen interspezifischen Abstand als die anderen beiden Strichcodes, was darauf hinweist, dass die psbA-trnH-Region bei der Unterscheidung von zwei Ursprüngen von Cistanches Herba gut abschneidet.

Analyse der Barcode-Lücke zur Identifizierung

Cistanche DeserticolaundCistanche TubulusDie Barcode-Lücke stellt die bemerkenswerte Variation von Inter- und Intra-Arten dar und zeigt getrennte, nicht überlappende Verteilungen zwischen intra- und interspezifischen Proben. In dieser Studie (Abb. 5) wurde der Abstandsbereich auf 0–0.45 eingestellt, da der größte K2P-Abstand von psbA-trnH zwischenCistanche DeserticolaundCistanche Tubuluslag nahe bei 0,45. Die drei Barcodes zeigten deutliche Lücken in der Verteilung der intra- und interspezifischen Variation. Darüber hinaus war die Lücke von psbA-trnH signifikant größer als die der anderen beiden Barcodes. Daher könnte die psbA-trnH-Region ein idealer Barcode zur Unterscheidung zweier Ursprünge seinCistanchenKräuter.

Neighbor-Joining (NJ)-Baum

Ein NJ-Baum veranschaulicht die Beziehung zwischen Arten und erleichtert die Bestimmung ihrer Häufung. In dieser Studie wurde ein NJ-Baum aus drei Barcodes basierend auf dem K2P-Modell erstellt (Abb. 6). Die Ergebnisse zeigten, dass sich zwei Ursprünge von Cistanches Herba separat in zwei Kladen gruppierten. Somit unterscheidet sich der NJ-Baum deutlich voneinanderCistanche DeserticolaundCistanche Tubulus.

Diskussion und zusammenfassung

Cistanches Herba ist ein wichtiges medizinisches Material, das üblicherweise zur Ernährung der asiatischen Gemeinschaft verwendet wird [38]. Allerdings sind die beiden Ursprünge vonCistanchenKräuter, Cistanche DeserticolaundCistanche Tubulus, haben unterschiedliche chemische Zusammensetzungen bzw. pharmakologische Aktivitäten. Gleichzeitig unterscheiden sich die beiden Ursprünge in der klinischen Anwendung und dem Rohstoffmarkt. Die Klassifizierung von Cistanche ist verworren und massive Ersatzstoffe und Fälschungen überschwemmen den Markt aufgrund der Ressourcenknappheit und des besonderen Wachstumsumfelds für Cistanche Herba. Es wird angenommen, dass die Gattung der Cistanche vier Arten und eine Variante umfasst:Cistanche Deserticola, Cistanche Tubulus, Cistanche sinensis, Cistanche Salsa, undCistancheSalsaVar. Albiflora [39]. Forscher in Japan betrachteten den Ursprung vonCistanchenHerba alsCistanche Salsa[40–43], während es als identifiziert wurdeCistanche Deserticolavon Tu [44–46]. Daher ist die Klassifizierung von Cistanche verwirrt, und es ist schwierig, die beiden Ursprünge von Cistanches Herba zu unterscheiden. Traditionelle Methoden zur Qualitätskontrolle von Cistanches Herba sind morphologische Identifizierung [47,48], mikroskopische Identifizierung [49] und TLC (Dünnschichtchromatographie) [50,51], FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) [14], HPLC (High Leistungsflüssigkeitschromatographie) [52,53]. Die morphologische und mikroskopische Methode kann leicht Arten aus verschiedenen Gattungen oder Familien unterscheiden, die große Unterschiede in morphologischen und mikroskopischen Merkmalen aufweisen, während es schwierig ist, Geschwisterarten zu unterscheiden. TLC und FTIR können Arten mit unterschiedlichen chemischen Zusammensetzungen eindeutig unterscheiden, während es schwierig ist, die chemische Komponente und den Gehalt zu bestimmen. HPLC wird hauptsächlich zur Differenzierung von Spezies mit unterschiedlichen Gehalten an chemischen Elementen verwendet, jedoch ist die Analysezeit länger und die Empfindlichkeit im Vergleich zur UPLC relativ geringer. Dementsprechend war die UPLC-QTOF/MS-Technologie bei der Bestimmung der chemischen Zusammensetzung schneller und genauer als andere chemische Methoden. Molekulare Identifizierungsmethoden zeigen eine gute Unterscheidung basierend auf der genetischen Variation, wie SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) [54], AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [55,56]. Diese molekularen Methoden sind jedoch nicht einfach zu handhaben und nicht universell. Dementsprechend könnte DNA-Barcoding Arten universeller, schneller und genauer unterscheiden als andere molekulare Methoden. Bei Arten derselben Gattung und engen genetischen Verwandtschaft sind diese Methoden allein möglicherweise nicht gut bei der Identifizierung.

Hier haben wir UPLC-QTOF/MS und DNA-Barcoding bei der Identifizierung kombiniertCistanche DeserticolaundCistanche Tubulusund bewertete die chemischen und molekularen Marker, die eine Diskriminierung ermöglichen würden. 23 qualifizierte Massenpeaks wurden detektiert und 16 wurden durch Verwendung von UPLC-QTOF/MS identifiziert, und drei potenzielle Markerverbindungen wurden zuerst gefunden, um die Unterscheidung von zwei Ursprüngen durch PCA- und OPLS-DA-Analyse zu erleichtern. Darüber hinaus wurden vier Indikatoren mittels DNA-Barcoding-Technologie hinsichtlich ihrer Fähigkeit, zwei Ursprünge zu unterscheiden, bewertet: Identifizierungseffizienz, genetische Effizienz, Barcoding-Lücke und NJ-Baumanalyse. Als geeigneter DNA-Barcode zur Unterscheidung wurde die psbA-trnH-Region unterstütztCistanche DeserticolaundCistanche Tubulus. Zusammenfassend haben wir zunächst eine neue kombinierte Molekular- und chemische Analysemethode zur Unterscheidung und Qualitätskontrolle in zwei Ursprüngen von Cistanches Herba etabliert. DNA-Barcoding kann zwei Ursprünge in der genetischen Variation unterscheiden und Arten universell und genau authentifizieren; Die UPLC-QTOF/MS-Technologie kann die chemische Zusammensetzung analysieren, um die Qualität medizinischer Materialien schnell und genau zu bewerten. Die kombinierte Methode aus DNA-Barcoding und UPLC-QTOF/MS-Technologie garantiert eine genauere und wissenschaftlichere Identifizierung in mehreren Quellen von medizinischem Material und kann als Methode zur Identifizierung anderer verwirrender Arten oder Gattungen bei der Klassifizierung dienen.

Autorenbeiträge

Konzeption und Gestaltung der Experimente: LFH SHZ LBW. Durchgeführt die Versuche: SHZ LBW. Analysiert die Daten: SHZ LBW. Beigesteuerte Reagenzien/Materialien/Analysewerkzeuge: LFH. Schrieb die Arbeit: SHZ XJ LBW. Überprüfen Sie das Manuskript: ZHW.

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