Teil 2 Nachweis von Cistanches Herba (Rou Cong Rong) Arzneimitteln anhand artspezifischer Nukleotidsignaturen

Bei der Suche nach den in dieser Studie entwickelten Nukleotidsignaturen fanden wir heraus, dass 15 von 31 chinesischen Patentarzneimitteln als enthaltend gekennzeichnet warenCistanches Herbaenthielt stattdessen Verfälschungsmittel, darunter acht gefälschte Zutaten und sieben Verfälschungsmittel (Tabelle 2). Beispielsweise wurden sechs Chargen durch Cy ersetzt. Songaricum, darunter drei Chargen Shihu Yeguang-Pillen, eine Charge Kangguzhi Zengsheng-Pillen, eine Charge Sanbao-Kapseln und eine Charge Wenweishu-Partikel.

Darüber hinaus führten verschiedene Chargen desselben Herstellers zu etwas unterschiedlichen Ergebnissen. Beispielsweise umfasste von drei Chargen eines Herstellers (ZCY16, ZCY69 und ZCY71) eine Charge eine Mischung aus Ci.Deserticolaund Cy. songaricum, eine Charge bestand aus einer Mischung vonCi. DeserticolaundCi. Tubulusund nur eine Charge enthaltenCi. Tubulus. Zwei Chargen eines anderen Herstellers (ZCY44 und ZCY70) unterschieden sich ebenfalls: Eine Charge enthielt Cy. songaricum, während die andere Charge enthieltCi. DeserticolaundCi. Tubulus.

Cistanches Herbawurde in 23 der 31 getesteten chinesischen Patentarzneimittel nachgewiesen (Tabelle 2), und nur 16 Proben waren authentisch, z. B. ohne Verfälschungen oder gefälschte Inhaltsstoffe.Ci. Tubuluswurde in 16 Chargen chinesischer Patentarzneimittel nachgewiesen, und Ci. Deserticola wurde in 10 Chargen nachgewiesen. O. coerulescens wurde in keinem der Produkte nachgewiesen (Tabelle 2).

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DISKUSSION

Die Notwendigkeit, eine neue Methode zur Überwachung von im Handel erhältlichen Arzneimitteln zu entwickeln, die enthaltenCistanchenKräuter

Cistanches Herbaist ein Tonikum, das in restaurativen chinesischen Patentarzneimitteln und anderen Arzneimitteln weit verbreitet ist. Die Qualitätskontrolle chinesischer Patentarzneimittel stellt jedoch aufgrund der Vielfalt und Komplexität der Inhaltsstoffe eine große Herausforderung dar. Aufgrund der fehlenden behördlichen Aufsicht besteht eine beträchtliche Möglichkeit zur Produktverfälschung oder -fälschung. Darüber hinaus sollten alle Produkte gemäß Arzneibuch oder anderen Standards verarbeitet werden; Verfälschungen oder Fälschungen sind bei der Verarbeitung nicht gestattet. Daher wurden verschiedene Qualitätskontrollmethoden etabliert, wie z. B. zweidimensionale Multi-Heart-Cutting-Flüssigkeitschromatographie (Yao et al., 2015), Nahinfrarot-Reflexionsspektroskopie (Zhang und Su, 2014; Zhang et al., 2015). ) und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (Wang et al., 2016b). Die derzeit in der Chinesischen Arzneibuchkommission (2015) enthaltenen analytischen chemischen Methoden können jedoch nicht verwendet werden, um alle Inhaltsstoffe in chinesischen Patentarzneimitteln zu authentifizieren oder das Vorhandensein von verfälschenden Inhaltsstoffen nachzuweisen. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass gezielte Metaboliten in Pflanzen während der Produktverarbeitung verändert werden, was zu erheblichen Schwankungen der Testergebnisse oder zum vollständigen Versagen von Testmethoden führt (Ananingsih et al., 2013). Daher sind molekulare Werkzeuge wie artspezifische Nukleotidsignaturen bereit, Qualitätskontrollsysteme gegen das Risiko einer betrügerischen Produktsubstitution und -verfälschung sowie des Einschlusses nicht gekennzeichneter Inhaltsstoffe zu stärken.

Obwohl ITS/ITS2 als hocheffizientes Werkzeug zur Identifizierung von pflanzlichen Arzneimitteln gilt, können diese Sequenzen nicht aus stark verarbeiteten Proben amplifiziert werden (Newmaster et al., 2013; de Boer et al., 2015). Wanget al. berichteten, dass ITS2 aus Angelicae Sinensis Radix-Extrakt oder Dekokten, die länger als 120 Minuten gekocht wurden, nicht amplifiziert werden konnte (Wang et al., 2016a). Gemäß traditionellen Technologien und der Chinesischen Arzneibuchkommission (2015) wird Cistanches Herba immer stark verarbeitet, um seine medizinische Wirksamkeit zu erhöhen; Zu diesen Prozessen gehören Ofentrocknung, Salzen und Dämpfen mit Wein (Zou et al., 2017), die zum DNA-Abbau führen. Darüber hinaus werden während der Verarbeitung verschiedene Hilfsstoffe wie Honig, Stärke und Dextrin hinzugefügt. Wenn diese Hilfsstoffe nicht vollständig entfernt werden, wird die Reinheit der DNA beeinträchtigt. Zum Beispiel wird der folgende Herstellungsprozess verwendet, um Cistanches Herba-haltige Sanbao-Kapseln herzustellen: „Kochen Sie die medizinischen Scheiben zweimal für 1,5 h, kombinieren Sie die Abkochungen und filtern Sie die Mischung. Konzentrieren Sie das Filtrat auf eine relative Dichte von 1,20–1,25 (bei 80 ◦C).Füge andere gemahlene Pulver hinzu und kombiniere sie, um eine homogene Mischung zu erhalten.Trockne die Mischung anschließend bei 60◦C und mahle sie dann zu einem feinen

Pulver.“ Allerdings könnte es nach dem oben beschriebenen Herstellungsprozess zu Schwierigkeiten bei der DNA-Extraktion chinesischer Patentarzneimittel kommen, und lange Fragmente könnten aus der degradierten DNA nicht amplifiziert werden, was die Identifizierung von Verfälschern verhindern würde Qualität und Reinheit der DNA haben wir vor der genomischen DNA-Extraktion zusätzliche Schritte hinzugefügt, darunter das Waschen mit Vorwaschpuffer und das Eluieren von zehn parallelen Röhrchen in ein Röhrchen für jede Charge.

Obwohl alle in der vorliegenden Studie verwendeten chinesischen Patentarzneimittel 6–25 Inhaltsstoffe enthielten, konnten die entwickelten Primerpaare die Sequenzen der Verfälschungsmittel in diesen chinesischen Patentarzneimitteln spezifisch amplifizieren. Die direkte Sequenzierung der PCR-Produkte zeigte saubere Trace-Dateien. Somit ist diese Nukleotid-Signaturmethode in der Lage, sowohl authentische Arteninhaltsstoffe als auch Verfälschungsmittel zu identifizieren, und sollte die Anwendung von DNA-basierten molekulardiagnostischen Werkzeugen für die Marktüberwachung erweitern.

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Nukleotidsignaturen zur effektiven Identifizierung von Cistanches Herba-Produkten

Molekulare Werkzeuge, die die PCR-Technologie verwenden, sind sehr vielversprechend für die Authentifizierung von Arzneimitteln in Qualitätskontrollsystemen. Die erfolgreiche Anwendung der Primer zur Identifizierung von DNA-abgebauten Verfälschungsmitteln aus Cistanches Herba legt nahe, dass ein PCR-basiertes Nachweisverfahren weit verbreitet sein könnte. Auf dem Markt für chinesische Kräutermedizin ist der Preis für authentische Inhaltsstoffe der Art Cistanches Herba mehr als fünfmal höher als der Preis für seine Verfälschungsmittel. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Cy. songaricum ist das am weitesten verbreitete Verfälschungsmittel von Cistanches Herba auf dem Markt, gefolgt von Ci. Sinensis. Cy. songaricum wurde hinzugefügt, da diese Arzneimittel ähnliche morphologische Merkmale aufweisen. Außerdem ist die chemische Zusammensetzung von Ci. sinensis ähnelt der von Cistanches Herba. Als Qualitätskontrollmarker zCistanches HerbaExtrakte, Echinacosid und Acteosid können kostengünstig aus Ci extrahiert werden. sinensis. Daher verwenden einige pharmazeutische Fabriken Ci. sinensis als Ersatzstoff bei der Herstellung von Cistanches Herba-Extrakten. Zusammengenommen weisen die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass es auf dem Markt für Arzneimittel erhebliche Betrugsfälle gibt.

Die Verfälschung in der chinesischen Patentmedizin ähnelt der in anderen Ländern. Ähnliche Verfälschungen wurden in Nordamerika (Newmaster et al., 2013), Europa (Raclariu et al., 2017) und Asien (Cheng et al., 2014; Shanmughanandhan et al., 2016; Gao et al. , 2017). In dieser Studie betrug die Verfälschungsrate chinesischer Patentarzneimittel etwa 48,4 Prozent, wobei nur 16 der 31 Proben authentisches Cistanches Herba waren. Darüber hinaus spekulierten wir, dass die unterschiedlichen Ergebnisse, die mit Produkten desselben Herstellers erzielt wurden, auf Unterschiede in der Qualität der verschiedenen Chargen von Materialien für chinesische Medizin zurückzuführen sein könnten. Um die Qualität chinesischer Patentarzneimittel zu kontrollieren, sollten die Rohstoffe daher authentifiziert werden, bevor sie zu Produkten verarbeitet werden.

Verfälschung vonCistanches Herbawird traditionell mit Fragen von Angebot und Nachfrage von Rohstoffen in Verbindung gebracht.Ci. DeserticolaundCi. Tubulussind die beiden ursprünglichen Pflanzen, die derzeit zur Formulierung verwendet werdenCistanches Herba. Allerdings Ci. Deserticola ist die einzige ursprüngliche Art in traditionellen authentischen Cistanches Herba, die in der Chinesischen Arzneibuchkommission (2000) aufgeführt ist, in der Ci. tubulosa wird als Verfälschungsmittel identifiziert. Aufgrund des Mangels an Ci. Deserticola-Ressourcen,Ci. Tubulusist seit 2005 als Ergänzung im Chinesischen Arzneibuch aufgeführt (Jiang und Tu, 2009). Bis vor kurzem haben sich die Preise dieser Kräuter deutlich unterschieden; Ci. tubulosa war viel billiger als Ci. deserticola, weil es ein viel größeres Angebot an ersteren gibt. Hier zeigten unsere Ergebnisse, dass Ci. tubulosa wird häufiger in kommerziell erhältlichen Cistanches Herba-Produkten verwendet.

Abschließend die Nukleotidsignaturen und PCR-basiert

Methoden, die in dieser Studie entwickelt wurden, können als nützliche Werkzeuge für die Arzneimittelindustrie dienen, um Inhaltsstoffe zu authentifizieren und Verfälschungen darin zu erkennenCistanchenHerba-Produkte. Selbst wenn der Anteil des Verfälschungsmittels eins zu zehntausend betrug, kann es gemäß dem Sensitivitätsergebnis mittels qRT-PCR nachgewiesen werden. Dies bedeutet, dass sobald eine Nukleotidsignatur erkannt wirdCistanchenHerba-haltige funktionelle Produkte könnten als verfälschende oder gefälschte Inhaltsstoffe identifiziert werden. Eine neuartige Lösung zum Nachweis gefälschter Inhaltsstoffe oder verfälschter Cistanches Herba wurde bereitgestellt, die zuvor nicht über chemische Nachweisverfahren im chinesischen Arzneibuch verfügbar war. Darüber hinaus könnte diese Methode verwendet werden, um immer mehr Arten von Arzneimitteln zu validieren und die Anwendungen von DNA-basierten molekulardiagnostischen Werkzeugen für die Marktüberwachung zu erweitern.

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AUTORENBEITRÄGE

JH konzipierte die Studie und war an ihrer Gestaltung beteiligt. XW, RX und JC steuerten Proben bei und führten die Experimente durch. XW analysierte die Daten. XW, JH, ZZ, S-GN, JS und SC haben das Manuskript entworfen. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

FINANZIERUNG

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China [Fördernummer 81673552], der CAMS Innovation, unterstützt

Fund for Medical Sciences [Fördernummer 2016-I2 M- 3-016] und United Fund Key Project der National Natural Science Foundation of China [Fördernummer U1403224].

DANKSAGUNGEN

Wir möchten unseren Kollegen danken, die bei der Probenentnahme, Identifizierung, Laborarbeit und Manuskripterstellung geholfen haben, darunter Chaokui Sun, Dianyun Hou und Piao Zhang.

ERGÄNZUNGSMATERIAL

Das ergänzende Material zu diesem Artikel finden Sie online unter: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018. 01643/full#ergänzungsmaterial

Ergänzende Abbildung S1|Das Alignment-Ergebnis der ITS2-Sequenz von sechs Arten.

Ergänzende Abbildung S2|Agarose-Gelelektrophorese aller Proben.

Ergänzungstabelle S1|Informationen zur Probenahme von Cistanches Herba und seinen Verfälschungsmitteln.

Ergänzungstabelle S2|Sequenzinformationen verwandter Arten, heruntergeladen von GenBank.

Ergänzungstabelle S3|Die deklarierten Zusammensetzungen verschiedener chinesischer Patentmedizinproben.

Zusatzdatenblatt S1|Alle in dieser Studie erhaltenen Sequenzen.

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Erklärung zu Interessenkonflikten: Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Copyright © 2018 Wang, Xu, Chen, Song, Newmaster, Han, Zhang und Chen. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License (CC BY) verbreitet wird. Die Verwendung, Verbreitung oder Vervielfältigung in anderen Foren ist gestattet, sofern der/die Originalautor(en) und der/die Urheberrechtsinhaber genannt werden und die Originalveröffentlichung in dieser Zeitschrift gemäß anerkannter wissenschaftlicher Praxis zitiert wird. Eine Nutzung, Verbreitung oder Vervielfältigung, die diesen Bedingungen nicht entspricht, ist nicht gestattet.