Teil 2: Verbascosid schützt Pankreaszellen vor ER-Stress
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 und Carla Perego 1,*
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3.4 Verbascosid moduliert -Zellen mitochondriale Aktivität und Dynamik
MTT-Viabilitätstests deuten auf eine mögliche Auswirkung von hinverbascosiddirekt auf Mitochondrien, was die Kopplung der Insulinsekretion an den Ernährungszustand und das Zellüberleben in diesem Zelltyp sicherstellt. Form und Membranpotential sind Marker der mitochondrialen Gesundheit [42]. Wir haben zuerst das mitochondriale Membranpotential bewertet, indem wir die Zellen mit MitoSpyw Orange CMTMRos markiert haben, einem durchlässigen Farbstoff, dessen Konzentration vom inneren mitochondrialen Membranpotential abhängt, während MitoSpyw Green FM verwendet wurde, um Daten auf die mitochondriale Masse zu normalisieren (Abbildung 4A, B). Das Membranpotential der Mitochondrien inverbascosid-behandelten Zellen war im Vergleich zur Kontrolle sowohl unter Grund- als auch unter Stressbedingungen erhöht. Interessant,verbascosidMetaboliten übten unterschiedliche Wirkungen aus. Kaffeesäure verbesserte das mitochondriale Potenzial nicht, während Hydroxytyrosol eine dosisabhängige Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktion verursachte, in Übereinstimmung mit Daten zur Zelllebensfähigkeit, ein solcher Effekt war nach H2O2-Exposition deutlicher (Abbildung S3).
Da die Funktion eng mit der Morphologie zusammenhängt, haben wir den Durchmesser, die Fläche und die Rundheit der Mitochondrien des Feret gemessen. Akuter oxidativer Stress fördert eine umfangreiche Mitochondrienspaltung, was zu kleineren, kreisförmigen Mitochondrien führt [42]. Unter H2O2-Stressbedingungen waren die Mitochondrien von mit Verbascosid behandelten Zellen länger und zeigten eine vergrößerte Oberfläche als Kontrollzellen (Abbildung 4C, D und Abbildung S4). Die Zirkularität der Mitochondrien war bei mit Verbascosid behandelten Zellen geringer als bei Kontrollen, und die Unterschiede waren bei mit H2O2 behandelten Zellen deutlicher (Abbildung S3), was wiederum die schützende Rolle des Polyphenols bestätigt.
Die Fähigkeit dieser Organellen, ihre Form als Reaktion auf Ernährungszustände oder Stressbedingungen zu verändern, unterliegt der Kontrolle von Fusions- und Spaltungsereignissen und erfordert mitochondriale Motilität [39]. Die Verfolgung der Mitochondrienbewegungen veranlasste uns, die kumulierte zurückgelegte Strecke zu berechnen, und die Analyse ergab eine signifikante Zunahme der Mitochondriendynamik in den mit Verbascosid behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle, bereits unter Grundbedingungen (Abbildung 4E, F und Videos S1–S4). Die Wirkung war nach der H2O2-Behandlung ausgeprägter, tatsächlich kehrte die Vorbehandlung mit Verbascosid den Einfluss von oxidativem Stress auf die mitochondriale Dynamik fast vollständig um.
Zusammengenommen unterstützen diese Daten nachdrücklich eine Schlüsselrolle von Verbascosid bei der Sicherstellung der Mitochondriendynamik, die entscheidend ist, um die schnelle Anpassung dieser Organelle an Stressbedingungen zu fördern.
3.5 Auswirkungen von Verbascosid auf das Überleben und die Funktion von Langerhans-Menschen
In Anbetracht des Übersetzungspotentials vonverbascosidAnwendung in der menschlichen Gesundheit verifizierten wir seine Wirkung auf menschliche isolierte Langerhans-Inseln, ein relevanteres Modell für physiopathologische und pharmakologische Studien an -Zellen. Isolierte Inseln wurden mit 16 &mgr;M Verbascosid für 5 Tage behandelt und das mitochondriale Membranpotential wurde bewertet. Wie in Abbildung 5A dargestellt, nahm das Potential der Mitochondrien der Mitochondrien in mit Verbascosid vorbehandelten Inseln nicht signifikant ab, während das Potential der Organellen nach H2O2-Exposition in menschlichen Kontrollinseln beeinträchtigt war, was die Hypothese einer schützenden Rolle von Verbascosid gegen ROS-induzierte - Zellfunktionsstörung. Die Analyse der Expression von ER-Stressmarkern zeigte eine deutliche Verringerung der P-eIF2-Fraktion in den beiden unterschiedlichen Inselpräparaten, die in 16 μM Verbascosid gehalten wurden, was die Herunterregulierung dieses Signalwegs auch in menschlichen Proben bestätigt (Abbildung 5D). Die vorteilhaften Wirkungen der Polyphenolbehandlung wurden durch den erhöhten Insulingehalt bestätigt, der bei mit Verbascosid behandelten Inseln im Vergleich zu Kontrollen beobachtet wurde (Abbildung 5B). Die Datenstreuung in unseren Experimenten erlaubte es nicht, irgendeinen signifikanten Unterschied der Glukose-stimulierten Insulinsekretion (GSIS) in mit Verbascosid behandelten Inseln nachzuweisen, obwohl ein positiver Trend sowohl unter Grund- als auch unter Stressbedingungen offensichtlich zu sein scheint ( 5C ).
4. Diskussion
Oxidativer Stress und Entzündungen sind die Grundlage für Zelldysfunktionen, die während T2D auftreten [43,44], daher wurden funktionelle Lebensmittel, Nutrazeutika und sekundäre Pflanzenstoffe als Mittel zur Vorbeugung von Typ-2-Diabetes untersucht [45]. In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf Verbascosid, von dem bekannt ist, dass es entzündungshemmende und antioxidative Aktivitäten in Neuronen ausübt [18]. Trotz der hohen strukturellen Komplexität wurden Verbascosid und Isoverbascosid zusammen mit einigen Metaboliten im Blutplasma von Ratten gefunden, die mit Lippia citriodora-Extrakt gefüttert wurden [20]. Darüber hinaus wurde eine Zellakkumulation von Verbascosid und Verbascosid in einer Brustkrebszelllinie SKBR3 nachgewiesen [23] und an Caco-2-Zellen durchgeführte Studien zeigen, dass moderate Mengen an Verbascosid und Isoverbascosid nach einer In-vitro-Verdauung intakt und bioverfügbar bleiben Prozess. Darüber hinaus kann Caco-2 beide Moleküle durch einen schnellen und linearen Transport im Bereich von 10 bis 100 uM aufnehmen [22]. Es wurden keine Daten über die Bioverfügbarkeit von Verbascosid beim Menschen berichtet, und doch deuten die oben genannten Studien darauf hin, dass es für nicht metabolisiertes Verbascosid möglich sein könnte, die Darmbarriere zu überwinden, im Blutplasma zu zirkulieren und antioxidative Wirkungen auf endokrine Zellen auszuüben Pankreas.
Wir fanden eine dosisabhängige (0.8–16 uM) schützende Rolle von Verbascosid auf klonale und menschliche Zellen, sowohl unter Grund- als auch unter Stressbedingungen. Diese Wirkung ist auf Verbascosid selbst zurückzuführen und nicht auf seine Metaboliten Koffeinsäure und Hydroxytyrosol, die bei einer Konzentration von 16 uM tatsächlich zytotoxisch erscheinen. Die in unseren Experimenten nachgewiesenen wirksamen Konzentrationen stimmen mit denen überein, die bei mit Verbascosid gefütterten Tieren beschrieben wurden [20].
Obwohl wir nicht wissen, ob Verbascosid extrazellulär wirkt, indem es an einen Membranrezeptor bindet, oder durch Endozytose internalisiert wird und intrazellulär wirkt, bestätigen unsere Daten, dass Verbascosid antioxidative und entzündungshemmende Eigenschaften hat und Zellen vor ER-Stress-assoziierten Dysfunktionen schützt, indem es die UPR und Förderung der mitochondrialen Dynamik.
Tatsächlich stellten wir eine signifikante Abnahme des ROS-Gehalts in mit Verbascosid behandelten Zellen fest, was durch die Verringerung der Lipidperoxidation, gemessen durch HNE- und Acrolein-Expression, weiter bestätigt wird. Im Gegensatz zu den meisten pflanzlichen Polyphenolen folgt die ROS-Abfangaktivität von Verbascosid eher indirekten (über Hochregulierung von ROS-entfernenden Enzymen) als auf direkten Wegen. Tatsächlich erhöht es die Gentranskription einiger antioxidativer Enzyme durch die Aktivierung des Nrf2-Wegs (NF-E2--verwandter Faktor 2) und über den AhR- (Arylkohlenwasserstoffrezeptor)-abhängigen Mechanismus [24,29]. Als solche fanden wir eine erhöhte Expression von SOD1 in mit Verbascosid behandelten Zellen.
Die ROS-Homöostase ist in der Pathologie von -Zellen äußerst relevant. Aufgrund des Mangels an antioxidativen Enzymen kann eine erhöhte Produktion von ROS nicht neutralisiert werden und eine ER-Stress fördernde Proteinfehlfaltung wird induziert. ER-Stress führt zu einer Verringerung der Insulintranskription und -translation durch die Aktivierung der UPR [44,46]. Dieser Weg hat den Hauptzweck, die ER-Funktion durch die Neuprogrammierung der Genexpression wiederherzustellen, löst jedoch bei Überstimulation Apoptose aus. Unsere Daten legen nahe, dass eine wichtige Wirkung von Verbascosid darin besteht, die UPR zu mildern, wodurch die zur Reparatur der ER-Dysfunktion erforderlichen Modifikationen ermöglicht werden, ohne Apoptose zu verursachen. Gemäß dieser Möglichkeit war die Expression von BIP-, HSP70- und PERK-Proteinen in mit Verbascosid behandelten Zellen verringert, und die Aktivierung des PERK-Signalwegs war als Reaktion auf Tunicamycin-induzierten ER-Stress abgeschwächt. Eine ähnliche Wirkung wurde für Tyrosol in der Insulinom-Zelllinie NIT-1 berichtet [47].
Besonders interessant ist die Fähigkeit von Verbascosid, die Aktivierung des PERK-Zweigs des UPR zu modulieren. In -Zellen ist dieser Weg erforderlich, um die basale sekretorische Homöostase und das Überleben der Zellen aufrechtzuerhalten, und er ist bei Diabetes stark dereguliert [41,48]. Noch faszinierender ist, dass häufige Varianten bei PERK zum Risiko von Prädiabetes beitragen, und rezessive Mutationen im EIF2AK3-Gen (das für PERK kodiert) liegen der Anfälligkeit für das Wolcott-Rallison-Syndrom zugrunde, das durch dauerhaften insulinabhängigen Diabetes bei Neugeborenen gekennzeichnet ist [49,50].
Eine Herunterregulierung des IKB-NFKB-Entzündungswegs wurde auch in unserem System in Gegenwart von Verbascosid festgestellt. NFKB stellt den wichtigsten Entzündungsweg in -Zellen dar, und seine anhaltende Aktivierung löst eine Kaskade von Ereignissen aus, die im -Zelltod gipfeln. In gestressten -Zellen schützt die Reduktion der NFKB-Expression Pankreaszellen vor diabetogenen Wirkstoffen [27,51], was die Anwendung von Verbascosid in der Diabetesprävention weiter unterstützt. Interessanterweise aktiviert die PERK-Signalgebung die Transkriptionsfaktoren NFR2 (beteiligt an der Redox-Homöostase) und NFKB, was die antioxidativen und entzündungshemmenden Wirkungen von Verbascosid erklärt [40,52].
Unsere Daten zeigen auch eine wichtige Rolle von Verbascosid auf die mitochondriale Aktivität und Dynamik.
Marker der mitochondrialen Betriebsqualität ist ihre Dynamik, ein Prozess, der durch koordinierte Zyklen von Fusions- und Spaltungsereignissen gekennzeichnet ist, die die Anzahl, Verteilung, Morphologie und das Membranpotential der Mitochondrien regulieren [39]. In Übereinstimmung mit dieser Möglichkeit verbessert Verbascosid das mitochondriale Membranpotential von tc3 sowohl unter Basal- als auch unter Stressbedingungen. Auch hier ist die Wirkung auf Verbascosid und nicht auf seine Metaboliten zurückzuführen, da Koffeinsäure die Mitochondrienfunktion nicht verbessert und Hydroxytyrosol das Organellenpotential signifikant verringert. Erhöhte mitochondriale Dynamik und Veränderungen in ihrer Morphologie wurden durch Verfolgung der mitochondrialen Bewegungen beobachtet, was darauf hindeutet, dass Verbascosid ein Mito-Morphose-Programm fördert. Die Umgestaltung des zellulären mitochondrialen Netzwerks beeinflusst den Aufbau der Superkomplexe der Atmungskette, wodurch nicht nur der Zellstoffwechsel, sondern auch der Redoxzustand verändert wird und die Zellen in die Lage versetzt werden, oxidativem Stress und Entzündungen besser entgegenzuwirken [5,37,39].
Obwohl der molekulare Mechanismus noch unbekannt ist, können wir die Hypothese aufstellen, dass Verbascosid wie andere Polyphenole die mitochondriale DNA schützt, indem es die ROS-Konzentration reduziert [53] und die Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore verhindert [54], wodurch die physiologische mitochondriale Aktivität sichergestellt wird. Eine weitere faszinierende Möglichkeit ist, dass die Modifikation der Dynamik und Aktivität der Mitochondrien wiederum durch die Wirkung von Verbascosid auf die UPR vermittelt wird. Tatsächlich zeigt eine neuere Forschung auf dem Gebiet der Mitochondrien, dass Orte der ER-Mitochondrien-Interaktion eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der mitochondrialen Dynamik und Aktivität als Reaktion auf oxidativen Stress spielen und PERK an diesem Phänomen beteiligt ist [55]. Die meisten In-vitro-Studien mit Polyphenolen wurden in Zelllinien durchgeführt, oft tumoralen Ursprungs, die sich von den Originalzellen in Bezug auf Metabolismus und ROS-Produktion unterscheiden. Wir liefern hier Beweise dafür, dass Verbascosid auch auf menschliche isolierte Langerhans-Inseln, das letzte Ziel der Intervention bei Diabetes, eine schützende Wirkung ausübt. Interessanterweise mildert das Polyphenol die PERK-Signalaktivierung bereits unter basalen Bedingungen, erhöht so den Insulingehalt und verhindert oxidativen Stress-vermittelte mitochondriale Dysfunktionen. Es bleibt zu klären, ob der Polyphenoleffekt auf den Insulingehalt die Fähigkeit der Verbindung widerspiegelt, den Zelltod zu verhindern, ER-Stress zu mindern oder die Insulingenexpression direkt zu kontrollieren, wie es für andere polyphenolische Verbindungen gezeigt wurde [56]. Diese Daten sind besonders relevant im Hinblick auf die mögliche Verwendung von Verbascosid als ergänzende Therapie bei der Behandlung von Diabetes.
5. Schlussfolgerungen
Die hier berichteten In-vitro-Studien an klonalen und menschlichen Zellen weisen darauf hin, dass Verbascosid Schutzwirkungen gegen ER-Stress-assoziierte Dysfunktionen ausübt, die Aktivierung des PERK-Zweigs der UPR abschwächt und die Dynamik der Mitochondrien verbessert. Da eine Störung der ER-Homöostase Zellschäden und Diabetes auslöst, liefern diese Daten eine Begründung für die mögliche Verwendung von Verbascosid als Nutrazeutika zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten. Für eine effektive klinische Anwendung von Verbascosid müssen jedoch noch viele Probleme gelöst werden. Trotz der Fülle an Laborstudien sind zuverlässige klinische Studien, die die gesundheitlichen Wirkungen von Verbascosid in vivo bestätigen, begrenzt. Darüber hinaus ist die Erhöhung seiner Stabilität und Bioverfügbarkeit für die zukünftige Anwendung dieser Verbindung in der menschlichen Gesundheit zwingend erforderlich. Unter diesem Gesichtspunkt ist Verbascosid ein interessantes Molekül, da sein Gerüst verschiedene reaktive Stellen aufweist, die durch kombinatorische Chemie modifiziert werden können. Wir erwarten, dass die aus diesen Studien resultierenden Informationen Wege zur therapeutischen Modulation von oxidativem Stress und Entzündungen bei pathologischen Zuständen durch die Verwendung natürlicher Verbindungen eröffnen werden.
Ergänzende Materialien: Die folgenden Materialien sind online verfügbar unter http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1. Abbildung S1: Auswirkungen von Koffeinsäure und Hydroxytyrosol auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Abbildung S2: Auswirkungen von Verbascosid auf Tunicamycin-induzierten ER-Stress. Abbildung S3: Auswirkungen von Koffeinsäure und Hydroxytyrosol auf das mitochondriale Membranpotential. Abbildung S4: Quantitative Bildanalysen von Mitochondrien in mit Koffeinsäure und Hydroxytyrosol behandelten Zellen. Video S1, S2 Videos: Mitochondrien-Dynamik, aufgezeichnet unter basalen Bedingungen, in Abwesenheit (S1) oder Anwesenheit (S2) von Verbascosid. Video S3, S4: Mitochondriendynamik, aufgezeichnet unter oxidativen Stressbedingungen, in Abwesenheit (S3) oder Anwesenheit (S4) von Verbascosid.
Autorenbeiträge: Konzeptualisierung, AG, PM und CP; Datenpflege, AG und PM; formale Analyse, AG und PM; Fördermittelakquise, CP; Untersuchung, MC; Methodik, AM und SG; Ressourcen, FB, RR und ADG; Supervision, KP; Validierung, AM, SG und MC; Visualisierung, AG und AM; Schreiben – Originalentwurf, AG; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, PM, AM, FB, RR, ADG, MC und CP Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.
Finanzierung: Diese Forschung erhielt keine externe Finanzierung.
Danksagungen: Wir möchten Carlo Corino und Mario Dell'Agli für die Reagenzien und die hilfreiche Diskussion danken.
Interessenkonflikte: Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an.
Verweise
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