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Cistanche Kraut hat eine sehr gute neuroprotektive Wirkung

2.6. Antiapoptotische Wirkungen von Zytokininen, bestimmt durch Caspase-3/7-Aktivitätsmessungen

Wie die oben beschriebenen PI-Färbeassays zeigen, induzierte SAL einen Anstieg der Todesraten der SH-SY5Y-Zellen. Da SAL sowohl mit Apoptose als auch mit Nekrose assoziiert ist [51], untersuchten wir auch die Aktivierung von Caspase-3 und 7 (casp-3/7) als spezifischen Marker der Apoptose (die Ausführungsphase) [52] nach Exposition der Zellen gegenüber CKs. Caspase-3/7-Aktivitäten, die nach der Behandlung mit jeder der Testverbindungen aufgezeichnet wurden, wurden in Bezug auf die nach der Behandlung mit 500 uM SAL aufgezeichneten Aktivitäten normalisiert (festgelegt als 100%). Wie in Abbildung 4 gezeigt, hemmte der bekannte Caspase-Inhibitor Ac-DEVD-CHO (als spezifische, Apoptose-bezogene Kontrolle enthalten) die Caspase-3/7-Aktivität bei submikromolaren Konzentrationen stark (auf 36,3 ± 2,66 und 25,2 ± 2,69% der Spiegel in Zellen, die mit SAL allein bei 0,05 bzw. 0,5 uM behandelt wurden). Ähnliche Hemmungsniveaus wurden zuvor [53] in verschiedenen in vitro SH-SY5Y-Zellmodellen der Neurodegeneration beobachtet. Die Positivkontrolle NAC reduzierte auch signifikant die Caspase-3/7-Aktivität auf 88,7 ± 1,87% bzw. 78,5 ± 2,56% der SAL-induzierten Werte bei 100 uM bzw. 1000 uM. Die getesteten CKs hatten eine breite Palette von Auswirkungen auf Caspase-3/7-Aktivitäten. Interessanterweise hatte von den CK-Ribosiden nur cZR signifikante Auswirkungen auf die Aktivitäten bei 0,1 uM (Reduktion auf 83,3 ± 4,33% der SAL-induzierten Werte), während iPR bei 1 uM keine signifikante Reduktion von casp-3,7 aufwies. Schließlich verringerte K3G die Caspase-3/7-Aktivität mit maximaler Wirkung bei 10 uM (auf 81,7 ± 4,31% des SAL-induzierten Niveaus). Insgesamt induzierte SAL einen 1,6-fachen Anstieg der Caspase-3/7-Aktivität im Vergleich zu gesunden Kontrollzellen (CTR, Abbildung 4), in Übereinstimmung mit den Ergebnissen einer früheren Studie, in der eine ähnliche SAL-Konzentration (400 uM) und die gleiche Zelllinie verwendet wurden [54]. Es ist bekannt, dass NAC die Caspase-3/7-Aktivität in mehreren Modellen vonneuronalTod [55–58]. Die hier vorgestellten Ergebnisse liefern jedoch die erste Demonstration ihrer Caspase-3/7 in einem SH-SY5Y-zellbasierten SAL-induzierten Modell vonneuronalTod. Die Positivkontrolle reduzierte die durch 500 uM SAL induzierte Caspase-3/7-Aktivität in ähnlicher Weise wie CKs, aber cZR und K3G waren sogar bei submikromolaren oder mikromolaren Konzentrationen wirksam. Andere Studien mit Stressmodellen, die mit PD (Proteasom-Inhibitor MG 132- oder H2O2-induzierte Toxizität in SH-SY5Y-Zellen [17] und Fibroblasten [15]) und der Huntington-Krankheit (Serumhungermodell in PC12-Zellen [19]) assoziiert sind, haben ebenfalls gezeigt, dass die CKs K und tZR anti-apoptotische (Caspase-3) Aktivitäten aufweisen können [17] und dass sowohl K als auch tZR Anti-Seneszenz-Aktivitäten aufweisen können [17,19]. Darüber hinaus sind Zusammenhänge zwischen abnehmender casp-3,7-Aktivierung undNeuroprotektiveFür SAL- und SAL-bezogene Modelle wurden Aktivitäten gemeldet [54,59,60].

Abbildung 4. Caspase-3/7-Aktivität im SAL-induzierten Modell von PD. Tripliziert sich in mindestens vier unabhängigen Tagen. * P gegenüber dem Fahrzeug mit 500 uM SAL, # P gegenüber dem Fahrzeug ohne 500 uM SAL.

2.7. Identifizierung der neuroprotektiven Cytokinin-Aktivität im Glutamat-induzierten Zelltod-Modell

Da SH-SY5Y-Zellen nicht alle NMDA-Rezeptor-Untereinheiten exprimieren [61], ist der wahrscheinlichste Mechanismus der Glutamat-Toxizität (Glu) die Blockierung des Cystin/Glutamat-Xc-Antiporters bei massiver Induktion von oxidativem Stress [62]. Frühere Autoren haben bereits einen Zusammenhang zwischen Glutamat-induziertem Zelltod und Nekroptose in SH-SY5Y-Zellen [63] und die Bedeutung der Caspase-3-Aktivierung bei der Glutamat-induzierten Toxizität für sie gezeigt [62,64]. Mehrere Studien haben auch das Auftreten von eisengetriebenem Zelltod (Ferroptose) nach Glutamatintoxikation [62,65,66] gezeigt und das Auftreten von drei Arten des Zelltods (Nekroptose, Apoptose und Ferroptose) nach Blockade des Xc-Antiporter-Systems angezeigt. Um eine umfassende Evaluierung derNeuroprotektivePotenzial des GetestetenCytokininewurde das Glutamat-induzierte Zelltod-Assay-System in ein analytisches Panel mit der bekanntenNeuroprotektiveEisenchelator Deferoxamin (DFO) und Inhibitor der Nekroptose Necrostatin-1 (NEC-1) [67] als Positivkontrollen. Hier wurden SH-SY5Y-Zellen 48 h differenziert, dann mit 160 mM Glu oder in Co-Treatment davon mit verschiedenenCytokininKonzentrationen (0,1–10 uM) für 24 h und mit PI gefärbt. In diesem Modell war die Wirkung von Glu auf den Zelltod 100% PI-Signal, so dass die Verringerung des Zelltods durch die Testverbindungen bewertet wurde. Glu induzierte fast einen 4-fachen Anstieg des Zelltods im Vergleich zu gesunden SH-SY5Y-Kontrollen (26,1 ± 0,42%). Screening von Positivkontrollen undCytokininezeigten, dass sowohl die Positivkontrollen NEC-1 (50 uM, 76,6 ± 2,51%) als auch DFO (10 uM, 84,2 ± 4,54%) den durch Glutamat induzierten Zelltod verringerten. Wie in Abbildung 5A gezeigt, aus dem Panel vonCytokinine, nur dreiCytokininewaren in der Lage zu schützenNeuron-wie SH-SY5Y-Zellen in ähnlicher Weise wie Positivkontrollen. Die aktivstenCytokininewaren Transzeatin (tZ) (0,1 uM, 79,5 ± 2,91%; 1 uM, 81,3 ± 2,77%) und cis-Zeatin (CZ) (0,1 uM, 82,1 ± 3,29%; 1 uM, 86,2 ± 2,89%) und Kinetin (K) (1 uM, 88,0 ± 3,76%; 10 uM, 79,9 ± 3,44%). Um ihre vielversprechende Aktivität zu bestätigen, wurde ein orthogonaler Assay verwendet, um die biologischen Wirkungen von CKs in diesem Modell genauer zu erklären: Ein Laktat-Dehydrogenase (LDH)-Freisetzungsassay [68], der auch einen dramatischen (4-fachen) Anstieg der Toxizität nach der Glu-Behandlung zeigte. Interessanterweise ermöglichte uns die Bestimmung der LDH-Freisetzung, zwischen den Aktivitäten von CKs und den Positivkontrollen (NEC-1 und DFO) zu unterscheiden. Die CKs hatten eine moderate, aber signifikante Schutzaktivität (tZ reduzierte die Sterberaten auf 91,9 ± 1,40% bei 0,1 uM; cZ reduzierte sie auf 92,3 ± 1,15% bei 0,1 uM und 91,7% ± 1,56% bei 1 uM; K reduzierte sie auf 92,2 ± 1,06% bei 1 uM). Die Positivkontrollen NEC-1 und DFO hatten stärkere Schutzwirkungen, waren aber bei viel höheren Konzentrationen wirksam (Verringerung der Raten auf 76,9 ± 2,94 % bzw. 81,6 ± 3,74 % bei 50 bzw. 10 μM) (Abbildung 5B). Der LDH-Assay validierte die mit der PI-Färbung erhaltenen Indikationen und die beobachteten Effekte der Positivkontrollen stimmten mit den veröffentlichten Daten überein [69,70]. Befunde zu Effekten von K im Glu-induzierten Zelltodmodell in HT22-Zellen [18] und unsere Beobachtungen der Effekte repräsentativer CKs wie tZ, cZ und K zeigen, dass CKs vielversprechende Kandidaten für die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen im Zusammenhang mit oxidativem Stress sind [71]. Schließlich wurden tZ und cZ bevorzugt, da sie in niedrigeren Konzentrationen wirksam waren und zusammen mit K für weitere Studien ihrer Auswirkungen auf oxidativen Stress und Caspase-3,7-Aktivierung ausgewählt wurden.

Cistancherezensionenüber die Auswirkungen vonNeuroprotektion

2.8. Auswirkungen von Cytokininen auf glu-induzierten oxidativen Stress in SH-SY5Y-Zellen

Im Gegensatz zum Vorgängermodell kann Glu oxidativen Stress in SH-SY5Y-Zellen über verschiedene Wege induzieren. Eine basiert auf der Blockade des Cystin / Glutamat (Xc-) -Antiporters, was zu einem Abbau von Glutathion (GSH) und negativen Auswirkungen auf die Superoxiddismutase (SOD) -Aktivität führt [62]. Der glu-vermittelte Zelltod beinhaltet vermutlich auch die Rac-NADPH-Oxidase-getriebene ROS-Bildung (insbesondere Superoxidradikal) in SH-SY5Y-Zellen [72]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hauptursache für den Zelltod im Glu-induzierten Modell OS ist. Innerhalb des ModellsNeuron-ähnliche Zellen wurden mit Glu behandelt und Verbindungen getestet, mit DHE gefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Wie in Abbildung 6A zu sehen ist, wurde in Glu-behandelten Zellen ein dramatischer Anstieg der roten DHE-Fluoreszenz beobachtet, der durch die Positivkontrollsubstanzen verbessert und CKs getestet wurde. Basierend auf der mikroskopischen Beobachtung wurde die Quantifizierung der Superoxidgehalte in Glu-induzierten Zellen durch den DHE-Assay ähnlich wie in SAL-induzierten Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse wurden in Bezug auf die durch Glu allein induzierten Spiegel normalisiert (auf 100% festgelegt), was zu einem dramatischen, fast 3-fachen Anstieg der Superoxidwerte innerhalb von nur 4 h inNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen im Verhältnis zu den Spiegeln in gesunden Kontrollzellen (CTR: 33,79 ± 1,45 %). Wie in Abbildung 6B gezeigt, reduzierten CKs wie tZ, cZ und K signifikant den Superoxidgehalt in Glu-berauschten Zellen: 0,1 uM tZ, 0,1 uM cZ, 1 uM und 10 uM K reduzierten ihn auf 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 und 83,8 ± 2,32% der Spiegel in Zellen, die nur mit Glu behandelt wurden. Diese Werte sind vergleichbar mit denen, die mit dem Nekroptiose-Inhibitor NEC-1 (80,5 ± 3,19% bei 5 uM und 80,4 ± 2,70% bei 50 uM) und Eisen-Chelator-DFO (80,2 ± 3,80% bei 10 uM) erhalten wurden. Die mit dem Glu-induzierten Zelltodmodell erzielten Ergebnisse, insbesondere die Auswirkungen von Positivkontrollen, stimmen mit früheren Berichten überein [70,73]. Bisherige Hinweise darauf, dass CKs OS-reduzierende Effekte in Glu-induzierten oder ähnlichen Modellen haben, beschränken sich auf eine Demonstration, dass K ein potentes OS-reduzierendes Mittel (bei ca. 23 uM) im HT22-Zell-basierten Glu-induzierten Zelltodmodell ist [18]. Wir fanden heraus, dass K bei niedrigeren Konzentrationen (1–10 uM) in unseren SH-SY5Y-Zellen eine OS-reduzierende Wirkung hatte. Darüber hinaus wurden vorteilhafte Langzeitwirkungen von tZ auf menschliche Fibroblasten, einschließlich der Wasserstoffperoxid-Zersetzungsaktivität, beobachtet [15], was darauf hindeutet, dass tZ und cZ indirekte OS-reduzierende Wirkungen in Glu-induzierten Zelltodmodellen haben können. Darüber hinaus wiesen andere Berichte auf die Zusammenhänge zwischen CKs-vermittelter OS-reduzierender Wirkung und schützender Aktivität hin [22,74-76]. Zusammengenommen zeigten tZ, cZ und K überraschend starke OS-reduzierende Effekte, vergleichbar mit denen von Positivkontrollen, trotz unterschiedlicher Stärken insgesamtNeuroprotektiveEffekt.

Abbildung 5. (A) Sterbeziffer vonNeuron-wie SH-SY5Y-Zellen in Glutamat (Glu)-induziertem Modell des Zelltods; B) Glu-induzierte Toxizität (LDH-Freisetzung) vonNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen. Dreifach in mindestens drei unabhängigen Tagen.* P im Vergleich zum Fahrzeug mit 160 uM Glu, # P gegenüber dem Fahrzeug ohne 160 uM Glu.

Abbildung 6. (A) Glu-induzierter oxidativer Stress (OS) und OS-reduzierende Aktivität der angegebenen Verbindungen beim MenschenNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen, die durch Fluoreszenzmikroskopie nach Dihydroethidium (DHE)-Markierung sichtbar gemacht werden. Balken = 50 um. Bilder zeigenNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen, die mit DMSO (Control), 160 mM Glutamat (Glu) allein und zusammen mit: 10 uM Deferoxamin (+DFO), 50 uM Necrostatin-1 (+NEC-1), 0,1 uM tZ (+tZ) und 0,1 uM cZ (+cZ) für 4 h behandelt und dann mit DHE gefärbt werden. (B) Glu-induzierte Superoxid-Radikalbildung inNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen nach 4 h. Die Grafik zeigt die Quantifizierung von DHE-gefärbten Zellen mit dem Mikroplattenleser Infinite M200 Pro (Tecan, Österreich). Dreifach in fünf unabhängigen Tagen.

* P gegenüber dem Fahrzeug mit 160 uM Glu, # P gegenüber dem Fahrzeug ohne 160 uM Glu.

2.9. Auswirkungen von Cytokininen auf die Caspase-3/7-Aktivität im Glu-induzierten Zelltodmodell

Glu hat ähnliche toxische Wirkungen auf SH-SY5Y-Zellen wie zuvor berichtete Wirkungen auf HT22-Zellen, die mit einer Xc-Antiporter-Blockade assoziiert sind. So sind in beiden Fällen nicht-apoptotische Zelltodmechanismen (Ferroptose, Nekroptose usw.) beteiligt [62], obwohl die Expression von Caspase-3 und bis zu einem gewissen Grad die NMDA-Untereinheit von NR1 in SH-SY5Y-Zellen stärker auftreten kann [61]. Daher können sich die Endstadien des Zelltods in den beiden Zelllinien unterscheiden. Eine beitragende Rolle der Caspase-3-Aktivität wurde in vielen Studien im Glu-induzierten Modell des Zelltods von SH-SY5Y-Zellen beobachtet [62,77–79]. In diesem AssayNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen wurden hier mit 160 mM Glu behandelt, was zu einer Erhöhung der Caspase-3/7-Aktivität führt. Um die Rolle der Apoptose beim Glu-induzierten Tod von SH-SY5Y-Zellen aufzuklären, wurde ein spezifischer Caspase-3/7-Inhibitor, Ac-DEVD-CHO, angewendet und es wurde festgestellt, dass er eine starke hemmende Wirkung hat: Bei 50 nM reduzierte es die Caspase-3,7-Aktivität auf 23,70 ± 1,01% des Spiegels in den behandelten Zellen

mit Glu allein und bei 0,5 uM blockierte es die Aktivität fast vollständig (wodurch sie auf ein normalisiertes Niveau von nur 7,22 ± 1,05% reduziert wurde; vergleichbar mit dem Niveau, das in gesunden Zellen beobachtet wurde:

7,8 ± 0,39 %), wie in Abbildung 7 dargestellt. Die Anwendung von Positivkontrollen führte zu einer allmählichen dosisabhängigen Abnahme der Caspase-3,7-Aktivität. Interessanterweise hatte NEC-1 einen leichten Effekt mit maximaler Wirkung bei 50 uM und DFO hatte eine robustere inhibitorische Aktivität bei 10 uM (Verringerung der Aktivität auf 80,5 ± 1,85 bzw. 75,8 ± 3,00%). Auf der anderen Seite wurden nur geringe, aber signifikante Effekte auf casp-3,7 durch tZ bei 1 uM (89,5 ± 2,50%), cZ bei 0,1 uM (87,4 ± 1,62%) und K bei 1 uM (91,0 ± 2,06%) erzielt. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass beide Positivkontrollen eine stärkere Caspase-3/7-Aktivität abnehmende Aktivität aufwiesen als die getesteten CKs, aber die CKs hatten Effekte bei viel niedrigeren Konzentrationen. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Modulation der Caspase-3/7-Aktivität eine Schlüsselrolle bei der potentenNeuroprotektiveAktivität von Wirkstoffen wie DFO [58] im Glu-induzierten Modell des Zelltods [79,80]. Wie in diesem Abschnitt gezeigt, hatte NEC-1 jedoch auchNeuroprotektiveAktivität, was darauf hindeutet, dass andere Arten des Zelltods am Glu-induzierten Tod von neuronenähnlichen SH-SY5Y-Zellen beteiligt sein könnten [63,67,81]. Hinweise darauf, dass Caspase-unabhängige Mechanismen am Glu-induzierten Zelltod beteiligt sind, wurden auch in Analysen der Wirkungen von NEC-1 [70], DFO [69] und K [18] auf HT22-Zellen gewonnen.

Abbildung 7. Caspase-3/7-Aktivität im Glu-Modell der oxidativen Schädigung vonNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen. Dreifach in mindestens vier unabhängigen Tagen. * P gegenüber dem Fahrzeug mit 160 uM Glu, # P gegenüber dem Fahrzeug ohne 160 uM Glu.

3. Schlussfolgerungen

Zusammenfassend ergab unsere Studie, dass CKs und ihre MetabolitenNeuroprotektiveAktivitäten im SAL-induzierten Modell vonParkinson-Krankheitund Glu-induzierte oxidative Schädigung im humanen differenzierten SH-SY5YneuronalZellen. K3G, cZR und iPR erwiesen sich als biologisch signifikantNeuroprotektiveAktivitäten. Darüber hinaus waren die aktiven CKs bei niedrigeren (submikromolaren und mikromolaren) Konzentrationen wirksam als die Positivkontrollsubstanz NAC. K3G, cZR und iPR hatten auch positive Auswirkungen auf Lebensfähigkeit, Zytotoxizität, oxidativen Stress und Caspase-3,7-Aktivität (außer iPR). Die orthogonalen Demonstrationen deuten stark darauf hin, dass die antioxidative Stressaktivität eine Schlüsselrolle bei den Schutzwirkungen von CKs im SAL-induzierten Zelltodmodell spielt. Nur drei Metaboliten im getesteten Panel von CKs (tZ, cZ und K) geschütztNeuron-wie SH-SY5Y-Zellen im Glu-induzierten Modell oxidativer Schäden in ähnlicher Weise wie der Eisenchelator NEC1 und der Nekroptiose-Inhibitor DFO. Um ihre vielversprechende Aktivität zu bestätigen, testeten wir ihre Wirkungen im orthogonalen Laktat-Dehydrogenase (LDH)-Freisetzungsassay. Die CKs hatten eine moderate, aber signifikante Schutzaktivität. Dies war schwächer als die entsprechenden Aktivitäten der Kontrollsubstanzen, aber trotz der Unterschiede in der Modulation vonneuronalGesundheit, stimulierten alle drei getesteten CKs eine starke Verringerung der Superoxidradikalbildung, ähnlich wie die positiven Kontrollsubstanzen. Die CKs hatten auch vergleichbare Wirkungen auf den Glu-induzierten oxidativen Stress in SH-SY5Y-Zellen wie NEC1 und DFO, aber diese Verbindungen hatten stärkere hemmende Wirkungen auf die Caspase-3/7-Aktivität als die CKs. Da der Glu-induzierte Zelltod nicht auf einem Caspase-abhängigen Weg beruht, wie in Studien zu Wirkungen von DFO und NEC-1 auf HT-22-Zellen gezeigt wurde [70], können CKs offenbar sowohl den Caspase-abhängigen als auch den -unabhängigen Zelltod modulieren, indem sie oxidativen Stress reduzieren [18,82]. In laufenden Studien wurde der detaillierte Wirkmechanismus von CKs und/oder ihre mitochondrialen Wirkungen aufneuronaloder Astrozytenzellen werden untersucht.

CistancheErfahrungfürsPDundGedächtnis

4. Materialien und Methoden

4.1. Chemikalien und Reagenzien

CytokininStandards wurden von OlChemIm (Olomouc, Tschechische Republik) bezogen. Calcein AM (1 mg/ml Lösung) und LDH-Release-Kit sowie ein Neurite-Outgrowth-Kit wurden von ThermoFisher gekauft. Propidiumiodid, Dihydroethidium, Komponenten von Caspase-3/7-Assay-Puffer, DMEM/F12 1:1-Medium, fetales Rinderserum, Trypsin, ATRA, Salsolinolhydrobromid, Glutamatmononatriumsalz, Deferoxamin, N-Acetylcystein, Ac-DEVD-CHO und DMSO für Zellkulturen wurden von Sigma Aldrich (Merck) gekauft. Ac-DEVD-AMC Substrat wurde von Enzo Life Science geliefert.

4.2. Assays der ORAC-Radikalfängeraktivität

Die Fähigkeit der Verbindungen, freie Radikale in vitro abzufangen, wurde durch den ORAC-Assay (Oxygen Radical Absorbance Capacity) bestimmt. Kurz gesagt, Fluorescein (100 uL, 500 mM) und 25 uL der getesteten Verbindungslösung wurden zu einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben, die bei 37 ° C vorinkubiert wurde. Als nächstes, 25 uL von 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3.SH-SY5Y Zellkultur

Die von ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) erworbene humane Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y wurde in Dulbeccos modifizierter Ea- gle's Medium and Ham's F12 Nutrient Mixture (DMEM: F-12, 1:1), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin und Streptomycin bei 37 oC in einer befeuchteten 5% CO2-Atmosphäre gezüchtet. Die Zellen wurden bis zu 20 Mal durchgelassen und die Medien wurden zweimal oder dreimal pro Woche gewechselt. Die Zelldichte wurde für den geplanten Assay (5000, 7000, 10.000 oder 20.000 Zellen pro Well) in 96-Multiwell-Platten in 100 uL Gesamtvolumen des Mediums für jedes Experiment angepasst. Am Tag nach der Aussaat wurde ATRA in 1% FBS DMEM / F12-Medium zu den Zellen bis zu einer Endkonzentration von 10 uM hinzugefügt, und die Inkubation wurde für weitere 48 h fortgesetzt, um die Differenzierung zu induzieren, die Bildung längerer Neuriten zu ermöglichen und die Proliferation zu reduzieren.

4.4. Mikroskopie

Mikroaufnahmen vonNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen wurden mit einem DM IL LED-Fluoreszenzmikroskop (Leica Microsystems, Mannheim, Deutschland) mit einem geeigneten Anregungsfilter für den Assay oder einem Hellfeld-Setup mit einer DP73 Hochleistungs-Digitalkamera (Olympus, Tokio, Japan) gewonnen. Da das Signal-Rausch-Verhältnis für die Färbung moderat war, wurde der Kontrast in der ImageJ-Software (Fidschi) leicht angepasst, ohne die resultierende Beobachtung zu beeinträchtigen. Originalbilder sind in den ergänzenden Materialien enthalten.

4.5. Zellmembranfärbung (Neurite Outgrowth Kit, Invitrogen™)

Neuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen (5000 Zellen pro Well), die durch das 48-stündige Differenzierungsverfahren erhalten wurden, wurden mit einem Neurite-Outgrowth-Kit (Invitrogen™) gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit geringfügigen Modifikationen gefärbt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, mit einer Lösung des mit dem Kit gelieferten Membranfärbstoffs (gemäß dem Protokoll für 96 Multiwell-Platten) in PBS für 20 min bei 37 oC markiert, erneut mit PBS gewaschen und unter einem Fluoreszenzmikroskop (mit 533 bzw. 585 nm Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen) betrachtet.

4.6. Zellbehandlung

Nach dem Differenzierungsverfahren wurde das Differenzierungsmedium auf 1% DMEM/F12-Medium umgestellt, ergänzt mit Testverbindungen in Konzentrationen von 0,1, 1 und 10 uM (mit 7000 Zellen pro Well für Zytotoxizitätstests) oder zusammen mit dem Toxin SAL bei 500 uM (mit 7000–10.000 Zellen pro Well) oder 160 mM Glu (mit 20.000 Zellen pro Well) für eine für den Assay-Typ geeignete Dauer (Lebensfähigkeit, B. Zelltod usw.). Kontrollzellen wurden mit einem Medium behandelt, das 。 0,1% von DMSO.

4.7. Zelllebensfähigkeit und Zelltod

Die Lebensfähigkeit vonNeuron-ähnliche SH-SY5Y-Zellen, die nach 24 Stunden Behandlung in 96-Well-Mikrotiterplatten (mit ca. 7000 Zellen pro Well) wachsen, wurden vom Calcein AM-Assay mit geringfügiger Modifikation bewertet [31]. Die in PBS verwendete Calcein AM-Lösung hatte eine Konzentration von 0,75 uM und die Inkubationszeit wurde auf 50 min festgelegt. Die Anzahl der lebenden Zellen in jedem Bohrloch wurde mit einem Infinite M200 Pro Mikroplattenleser (Tecan, Österreich) mit 495 bzw. 517 nm Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen bestimmt.

Zelltod vonNeuron-ähnliche Zellen (SAL-Modell: 10.000 Zellen pro Well; Glu-Modell: 20.000 Zellen pro Well) wurde mittels PI-Assay bestimmt, wie von Stone et al. 2003 mit kleiner Modifikation berichtet [83]. Kurz gesagt, das Medium des SAL-induzierten Modells wurde abgesaugt und in eine 1 ug / ml-Lösung von PI in PBS umgewandelt, aber Zellen, die einer Glu-Induktion unterzogen wurden, haben eine schwächere Adhärenz, so dass eine 1 mg / ml-Lösung von PI in PBS hinzugefügt wurde, um eine Endkonzentration von 1 ug / ml zu erhalten. In beiden Fällen wurden die Zellen für weitere 15–25 min bei Raumtemperatur inkubiert, dann wurde die PI-Fluoreszenz von einem Infinite M200 Pro Lesegerät (Tecan, Grödig, Österreich) mit 535 bzw. 617 Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen gemessen. Die resultierende PI-Fluoreszenz, die allein mit Toxinen erhalten wurde, wurde als 100% Zelltod festgelegt.

4.8. Messung des oxidativen Stresses mit dem Dihydroethidium (DHE)-Assay

Die Zellen wurden wie im vorherigen Abschnitt beschrieben für die SAL-Induktion (10.000 Zellen pro Well, 24 h oder Glu-Induktion (20.000 Zellen pro Well, 4 h) differenziert und behandelt. Nach den Behandlungen wurden die Zellen bei 500 x g für 330 s zentrifugiert, dann wurden die Kulturmedien (nach Aspiration) durch 10 uM DHE-Lösung in PBS ersetzt. 96-Multiwell-Platten mit Zellen wurden im Dunkeln für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, dann wurde die DHE-Fluoreszenz von einem Infinite M200 Pro Mikroplattenleser (Tecan, Grödig, Österreich) mit 500 bzw. 580 nm Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen gemessen. Die resultierende DHE-Fluoreszenz, die mit SAL oder Glu allein erhalten wurde, wurde als 100% Superoxid-Radikalbildung eingestellt. Illustrative Fluoreszenzmikroaufnahmen von DHE-gefärbten Zellen wurden nach DHE-Messung mit dem Mikroplattenleser erhalten.

Cistanche-Pflanze hat eine sehr gute neuroprotektive Wirkung

4.9. Messung der Caspase-3/7-Aktivität

Einstufige Caspase-3/7-Assays wurden nach einem zuvor veröffentlichten Verfahren durchgeführt [84]. Für Kulturen, die einer SAL-Induktion und Glu-Induktion unterzogen wurden, wurden die Reaktionsgemische (Caspase-3,7-Puffer und Komponenten mit Zellen in 96-Multiwell-Platten) für 2 h bzw. 3 h bei 37 oC inkubiert. Die Caspase-3/7-Aktivität wurde dann von einem Infinite M200 Pro-Mikroplattenleser (Tecan, Österreich) mit 346 bzw. 438 nm Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen gemessen.

4.10. Statistische Analyse

Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und in drei bis fünf (n = 3–5) unabhängigen Tagen wiederholt. Alle Daten werden als Mittelwert ± REM ausgedrückt. Die Werte für alle Messgrößen werden als Mittelwerte ± REM ausgedrückt, die mit Prism 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) berechnet wurden, das auch zur Generierung der Zahlen verwendet wurde. Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Softwarepaket PAST (Version 1.97) [85]. Für das Differenzierungsexperiment wurde der Student t-Test verwendet. Der Rest der Experimente wurde durch nicht-parametrischen Kruskal-Wallis-Test mit Mann-Whitney-Post-hoc-Test mit sequentieller Bonferroni-Korrektur ausgewertet. Ein Wert von p< 0.05="" was="" considered="">

Ergänzende Materialien: Originalbilder sind online verfügbar.

Autorenbeiträge: Die Beiträge der Autoren waren wie folgt: Untersuchung, Methodik, Validierung, Datenanalyse, G.G., C.W.D. und J.G.; Schreiben - ursprüngliche Entwurfsvorbereitung G.G., C.W.D. und M.S.; Datenkuratierung, Finanzierungsakquisition, Überwachung, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten, C.W.D., M.S. und P.K. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Finanzierung: Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse der Internal Grant Agency der Palacky University in Olomouc, Tschechische Republik (IGA_PrF_2020_021), der Czech Grant Agency (20-15621S) und des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung – Projekt ENOCH (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/0000868) und ein Studentenstipendium aus dem Stiftungsfonds der Palacky Universität.

Erklärung des Institutional Review Board: Nicht zutreffend.

Einverständniserklärung: Nicht zutreffend.

Erklärung zur Datenverfügbarkeit: Die Daten sind im Artikel oder im ergänzenden Material enthalten.

Danksagung: Die Autoren danken Dita Jordovd, Jana Hrubešovd und Lucie Koplikovd für die hervorragende technische Unterstützung. Darüber hinaus danken die Autoren Sees-editing Ltd., dem Vereinigten Königreich, für die englische Bearbeitung des Manuskripts.

Interessenkonflikte: Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Verfügbarkeit von Proben: Proben der Verbindungen sind bei den Autoren nicht verfügbar.