Teil 3: Der Magnesiumausfluss aus Drosophila-Kenyon-Zellen ist entscheidend für das normale und durch die Ernährung verbesserte Langzeitgedächtnis

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war auf erwachsene Fliegen beschränkt, was darauf hindeutet, dass UEX eine nachhaltigere Rolle in der neuronalen Physiologie spielt. Im Gegensatz dazu beeinträchtigte die Unterdrückung der uex-Expression entweder in den Neuronen abs oder a{{0}}b0 die LTM nicht. Die Aktivität von a0 b0-Neuronen ist nach dem Training erforderlich, um appetitives LTM zu konsolidieren (Krashes und Waddell, 2008), während abc und abs KC-Ausgabe zusammen und getrennt sind für seinen Ausdruck erforderlich (Krashes und Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). Daher spricht die Beobachtung einer normalen LTM-Leistung bei Fliegen mit uex-Funktionsverlust in abs- und a0b0-Neuronen gegen einen allgemeinen Mangel an ab-neuronaler Funktion bei der Manipulation von uex.

Nahrungs-Mg2 plus konnte die fehlerhafte LTM-Leistung von Fliegen, die konstitutiv uex-mutiert waren oder einen ab KC-beschränkten uex-Funktionsverlust beherbergten, nicht verbessern. Die Expression von uex in den ab KCs von uex-Mutantenfliegen stellte jedoch die Fähigkeit von Mg2 plus wieder her, die Leistung zu steigern. Daher sind die ab KCs der zelluläre Locus für Mg2 plus -angereichertErinnerungin der Fliege.

Es scheint vielleicht kontraintuitiv zu sein, dass ein UEX-gerichteter Magnesiumausfluss in KCs erforderlich ist, um die zu unterstützenErinnerung-verstärkende Wirkung von Mg2 plus Fütterung, wenn diätetisches Mg2 plus KC [Mg2 plus ]i erhöht. Warum das so ist, darüber kann zum jetzigen Zeitpunkt nur spekuliert werden. Wir gehen davon aus, dass sich insbesondere das Gehirn und die ab-KCs in ausgewogener Weise an die höheren Konzentrationen von intrazellulärem und extrazellulärem Mg2 plus anpassen müssen, die sich aus der Nahrungsergänzung ergeben. Unsere Live-Bildgebung von KC [Mg2 plus ]i in Wildtyp- und uex-Mutantengehirnen legt nahe, dass der UEX-gerichtete Efflux wahrscheinlich ein wesentlicher Faktor bei der aktiven und möglicherweise reizinduzierten homöostatischen Aufrechterhaltung dieser erhöhten Spiegel ist.

Einige Säugetierzelltypen extrudieren Mg2 plus in cAMP-abhängiger Weise wenige Minuten nachdem sie einer b-adrenergen Stimulation ausgesetzt wurden (Romani und Scarpa, 2000; Vormann und Günther, 1987; Jakob et al., 1989; Romani und Scarpa, 1990b; Romani und Scarpa, 1990a; Vormann und Günther, 1987; Günther et al., 1990; Howarth et al., 1994). Das Vorhandensein einer CNBH-Domäne legt nahe, dass UEX und CNNMs direkt durch cAMP reguliert werden könnten. Wir testeten die Bedeutung des CNBH, indem wir eine R622K-Aminosäuresubstitution einführten, die die cAMP-Bindung im UEX-CNBH blockieren sollte. Diese subtile Mutation beseitigte die Fähigkeit des uexR622K-Transgens, die LTM-Leistung bei uex-Mutantenfliegen wiederherzustellen. Wir haben auch CRISPR verwendet, um die CNBH im nativen uex-Locus zu mutieren. Obwohl das Löschen des CNBH aus CNNM4 die Mg2-Plus-Efflux-Aktivität aufhob (Chen et al., 2018), waren Fliegen, die homozygot für die uexT626NRR-Läsion waren, lebensfähig, was zeigt, dass sie ein ausreichendes Maß an UEX-Funktion beibehalten. Diese Fliegen zeigten jedoch eine unmittelbare und langfristige BeeinträchtigungErinnerung. Außerdem konnte die Leistung von uexT626NRR-Fliegen durch Mg2 plus Fütterung nicht gesteigert werden. Diese Daten zeigen, dass eine intakte CNBH ein kritisches Element von istErinnerung-relevante UEX-Funktion. Die Bindung von Clathrin-Adapterproteinen an das CNNM4-CNBH wurde mit basolateralem Targeting in Verbindung gebracht (Hirata et al., 2014), was darauf hindeutet, dass UEXT626NRR möglicherweise unangemessen in KCs lokalisiert ist. Darüber hinaus KC-Expression der CNNM2 E122K-Mutantenvariante, die Restfunktion behält

aber einen Trafficking-Defekt hat (Arjona et al., 2014), hat den uex-LTM-Defekt nicht wiederhergestellt.

Obwohl in Frage gestellt wurde, ob die CNNM2/3-CNBH-Domänen zyklische Nukleotide binden (Chen et al., 2018), fanden wir heraus, dass FSK einen Anstieg von ab KC [Mg2 plus ]i hervorrief, der empfindlich auf uex-Mutationen reagierte, und dass UEX: :HA wurde in rut2080-Adenylatcyclase (Han et al., 1992) und dnc1-Phosphodiesterase (Dudai et al., 1976) fehllokalisiert, die lerndefekte Mutantenfliegen waren. Während die UEX::HA-Markierung in Wildtyp-Fliegen gleichmäßig in g-, abc- und abs-KCs verteilt war, war die UEX::HA-Markierung in den g- und abs-KCs verringert und in abc-Neuronen in rut2080- und dnc1-Mutanten stärker. Die chronischen Manipulationen von cAMP in den Mutanten stimmen daher damit überein, dass cAMP die UEX-Lokalisierung beeinflusst, möglicherweise durch Wechselwirkung mit dem CNBH. Darüber hinaus kann eine veränderte UEX-Lokalisierung dazu beitragenErinnerungdefekte rut2080 und dnc1 fliegt.

Unsere physiologischen Daten mit Magnesium Green in Säugetierzellkulturen und dem genetisch codierten MagIC-Reporter in ab KCs zeigen, dass Fliegen-UEX den Mg2-plus-Ausfluss erleichtert. Die Stimulierung des Fliegengehirns mit FSK rief einen größeren Anstieg von ab KC [Mg2 plus ]i in uex-Mutantengehirnen hervor als in Wildtyp-Kontrollen, was den ersten Beweis liefert, dass UEX einen Anstieg von [Mg2 plus ]i in Drosophila-KCs begrenzt. Unsere MagIC-Aufzeichnungen zeigten auch eine langsame Oszillation (zentriert um 0,015 Hz, ungefähr einmal pro Minute) von ab KC [Mg2 plus ]i, die von UEX abhängig war. Wir verstehen die physiologische Funktion dieser [Mg2 plus ]i-Schwankung noch nicht, obwohl sie wahrscheinlich eine homöostatische Eigenschaft der Zellen auf Systemebene widerspiegelt. Die biochemische Oszillationsaktivität spielt eine entscheidende Rolle in vielen Aspekten der Zellphysiologie (Nova´k und Tyson, 2008). Am bemerkenswertesten ist, dass die zirkadiane zeitliche Schwankung von [Mg2 plus ]i den dynamischen zellulären Energiestoffwechsel mit der uhrgesteuerten Translation über den Mg2 plus sensitiven mTOR (mechanistisches Ziel von Rapamycin)-Weg verbindet (Feeney et al., 2016). Es ist daher möglich, dass langsame Mg2-Plus-Oszillationen Rollen für cAMP, UEX, Energiefluss (Plac¸ais et al., 2017) und mTOR-abhängige Translation vereinen, die der LTM-relevanten synaptischen Plastizität zugrunde liegen (Casadio et al., 1999 ; Huber et al., 2000; Beaumont et al., 2001; Hou und Klann, 2004; Hoeffer et al., 2008).

Kontakt für die gemeinsame Nutzung von Reagenzien und Ressourcen

Eine vollständige Liste der Reagenzien finden Sie in der Schlüsselressourcentabelle.

Weitere Informationen und Anfragen nach Ressourcen und Reagenzien sind an Scott Waddell (scott.waddell@cncb.ox.ac.uk) zu richten und werden von diesem bearbeitet.

Versuchsmodell und Gegenstandsdetails

Fliegenstämme

Sofern nicht anders angegeben, wurden die Fliegen mit Standard-Maismehlfutter unter einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus bei 60 Prozent Luftfeuchtigkeit und 25 °C aufgezogen. Test- und Kontrollfliegen für GAL80ts-Experimente wurden bei 18 °C aufgezogen. In Experimenten wurden gemischtgeschlechtliche Fliegen im Alter von 1–7- Tagen verwendet.

Canton-S war der Wildtyp-Stamm. Die in dieser Studie verwendeten GAL4-Treiberlinien sind c739-GAL4 (McGuire et al., 2001), c305a-GAL4 (Krashes et al., 2007), NP7175-GAL4 (Tanaka et al., 2004), 0770-GAL4 (Gohl et al., 2011), MB247-GAL4 (Zars et al., 2000), nSyb-GAL4 (Bloomington Drosophila Stock Centre, BDSC 51635), elav-GAL4 (BDSC, 8765) und uex-GAL4 (Kvon et al., 2014); Vienna Drosophila Resource Center, VDRC, VT23256-GAL4). Die vom Lagerzentrum erhaltenen UAS-Linien sind UAS-CD8::GFP (BDSC, 5136), UAS-NmdarRNAi (BDSC, 25941) und UAS-uexRNAi (BDSC, 36116). Die verschiedenen mutanten und transgenen Linien werden beschrieben, uexMI01943 (Venken et al., 2011; BDSC, 32805), uexNC1 (BDSC, 7167), rut2080 (Han et al., 1992) und dnc1 (Dudai et al., 1976). , tubP-GAL80ts (McGuire et al., 2003) und PhsILMiT (BDSC, 24613). Die Minos-Exzisionslinien uexMI01943.ex1 und uexMI01943.ex2 wurden unter Verwendung des in Arc et al., 1997, beschriebenen Verfahrens erzeugt. Das detaillierte Paarungsschema ist in Abbildung 2 – Abbildungsergänzung 2A – dargestellt. Potenzielle Exzisionslinien wurden von einzelnen Fliegen etabliert, die den Phänotyp der gelben Körperfarbe zeigten. Genomische DNA wurde aus sechs solcher Linien extrahiert und DNA, die das uexMI01943 MiMIC flankierte, wurde durch PCR amplifiziert und sequenziert. Es wurde identifiziert, dass die Linien uexMI01943.ex1 und uexMI01943.ex2 präzise Exzisionen beherbergen, nachdem sie die Wildtyp-Genomsequenz wiederhergestellt hatten. Siehe Ressourcentabelle für PCR- und Sequenzierungsprimersequenzen. Das Schema des Sequenzdetails der uexMI01943-MiMIC-Insertion und in den Exzisionen ist in Abbildung 2 – Abbildungsergänzung 2B – dargestellt. Um UAS-uex-transgene Fliegen zu konstruieren, wurde eine uex-codierende Sequenz voller Länge (CDS) durch RT-PCR kloniert. Gesamt-RNA wurde aus Wildtyp-Fliegen unter Verwendung von TRIZOL (Thermo Fisher, 15596018) isoliert und unter Verwendung des SuperScript III-Erststrang-Synthesesystems (Invitrogen, 18080400) revers in cDNA transkribiert. Diese Gesamt-cDNA-Mischung wurde als Matrize verwendet, um die uex-CDS zu amplifizieren. Siehe Ressourcentabelle für Primersequenzen. Das PCR-Produkt wurde mit SacII und XhoI verdaut und dann in die komplementären Stellen von pUAST ligiert (Brand und Perrimon, 1993). Das pUAST-klonierte uex-CDS wurde vollständig sequenziert und bestätigt, dass es die 2505 bp des Wildtyp-uex-cDNA-Leserahmens darstellt (beachten Sie, dass alle vier möglichen uex-mRNA-Isoformen, FlyBase Release 6, dasselbe 834 Aminosäureprotein codieren). UAS-uex-transgene Fliegen wurden kommerziell (Bestgene) durch Transformation mit dem pUAST-uex-Vektor erzeugt. Wir kartierten die UAS-uex-Chromosomeninsertion von 10 unabhängigen transgenen Linien und testeten das Verhalten von drei Linien, bezeichnet als UAS-uex3M, UAS-uex5M und UAS-uex8M, mit einer Insertion auf dem dritten Chromosom. UAS-uex3M-Fliegen wurden während der gesamten Studie verwendet und im Manuskript als UAS-uex bezeichnet.

UAS-uexR622K-transgene Fliegen wurden ähnlich wie UAS-uex-Fliegen erzeugt. Eine Missense-Mutation wurde bei Codon 622 von UEX innerhalb der CNBH-Domäne eingeführt, die jene nachahmt, die zuvor in der cAMP-Bindungsdomäne der regulatorischen Untereinheit von Proteinkinase A konstruiert wurde (Bubis et al., 1988). Die Mutation ändert das CGT-Codon, das Arg codiert, in AAA, das Lys codiert. Die Mutation wurde in die Wildtyp-uex-CDS unter Verwendung von Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs, E2621S) eingeführt, wie in „Improved methods for site-directed mutagenese using Gibson Assembly Master Mix“ (NEB Application Note) beschrieben. Die verwendeten Primer-Sets sind in der Ressourcentabelle aufgeführt. Das Produkt der Gibson-Assemblierung wurde weiter durch PCR amplifiziert und das resultierende Produkt wurde in den pUAST-Vektor kloniert und sequenziert. Transgen-Insertionen wurden wie für UAS-uex kartiert, und eine von zwei Insertionen, die auf das dritte Chromosom kartiert wurden, wurde in Verhaltensexperimenten verwendet.

Transgene UAS-CNNM2-, UAS-CNNM2E122K-, UAS-CNNM2E357K-, UAS-CNNM2S269W- und UAS-CNNM2T568I-Fliegenlinien wurden durch Transformation mit pUAST-Konstrukten erzeugt, die Wildtyp- oder punktmutierte Versionen einer Maus-CNNM2-cDNA enthielten, die mit HA (mCNNM2:: HA), beschrieben in Arjona et al., 2014. Wildtyp- oder mutierte Versionen von CNNM2 wurden aus ursprünglichen mCNNM2::HA-Klonen in pCiNEO_IRES_GFP-Plasmiden amplifiziert (Arjona et al., 2014). Primer sind in der Ressourcentabelle aufgeführt. PCR-Produkte wurden mit XhoI und XbaI verdaut und in die komplementären Stellen in pUAST ligiert. Insertionen jedes Konstrukts auf dem dritten Chromosom wurden durch Kartierung wie oben beschrieben identifiziert und in den Verhaltensexperimenten verwendet. Beachten Sie, dass alle in der Studie verwendeten CNNM2-Codierungskonstrukte HA-markiert sind, obwohl die Notation der Kürze halber oft weggelassen wird.

Transgene UAS-MagFRET-1-Fliegenlinien wurden durch Transformation mit pJFRC-MUH-Konstrukten erzeugt, die MagFRET-1-CDS enthielten, das aus dem pCMVMagFRET-1-Plasmid subkloniert wurde, beschrieben in Lindenburg et al. , 2013. Primer sind in der Ressourcentabelle aufgeführt. PCR-Produkte wurden mit XhoI und XbaI verdaut und in die komplementären Stellen in pJFRC-MUH ligiert. Die Insertion des Konstrukts wurde durch das ortsspezifische Transgenesesystem vermittelt und die Landestelle ist attP2 (auf dem dritten Chromosom).

Transgene UAS-MagIC- und UAS-MARIO-Fliegenlinien wurden durch Transformation mit pTW-Konstrukten erzeugt, die die MagIC/MARIO-CDS enthielten, die von den Plasmiden MagIC/pcDNA3 und MARIO/pcDNA3 subkloniert wurden, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von T. Nagai: (Maeshima et al., 2018 und Koldenkova et al., 2015). MagIC/MARIO CDS wurden zunächst aus MARIO/pcDNA3 bzw. MagIC/pcDNA3 PCR-amplifiziert und in den pENTR/D-TOPO-Vektor kloniert. Primer sind in der Ressourcentabelle aufgeführt. Beachten Sie, dass der MARIO-Sense-Primer so gestaltet wurde, dass er mit der Sequenz von pcDNA3 an der Insertionsstelle von MARIO überlappt. MagIC/MARIO CDS wurden weiter in den Gateway-Zielvektor pTW (Drosophila Gateway Vector Collection) kloniert.

Der CRISPR/Cas9-bearbeitete uexD-Locus wurde kommerziell von GenetiVision generiert. Das Bearbeitungsschema ist in Abbildung 2 dargestellt – Abbildungsergänzung 2C. Der uex-Locus sitzt in umgekehrter Orientierung auf Chromosom 2R und überspannt eine 49.141 bp-Region zwischen Position 3.900.285 und 3.949.425 (FlyBase, Release 6). Die folgende Beschreibung bezieht sich auf diese Koordinaten innerhalb des uex-Orts. Um uexD zu erzeugen, wurden zwei gRNA-Plasmide und ein doppelsträngiges DNA-Donor-(dsDNA)-Plasmid konstruiert und in nos-Cas9-Embryonen (BDSC, 54591) injiziert. Wie in Abbildung 2 – Abbildungsergänzung 2C angegeben und in der Ressourcentabelle detailliert dargestellt, liegt die stromaufwärts gelegene gRNA1 in Exon 6 und zielt auf die Sequenz 30.930.30.952 ab. Die entsprechende nachgeschaltete gRNA2 liegt zwischen Exon 7 und Exon 8 zwischen 33.988 und 34.010. Beide gRNAs wurden einzeln in pCFD3-dU63gRNA (Addgene, 49410) kloniert. Die Schnittstelle von gRNA1 sollte zwischen 30.946 und 30.947 liegen, während gRNA2 zu einem Schnitt zwischen 33.993 und 33.994 führen sollte. Ein stromaufwärts gelegener Homologiearm von 795 bp (30.152.30.946) und ein stromabwärts liegender Homologiearm von 977 bp (33.994.34.970) wurden in das Donor-DNA-Plasmid kloniert. Ein Terminationscodon (STOP, in allen drei Leserahmen) wurde zwischen die beiden Homologiearme eingefügt, gefolgt von einer GFP-Kassette, die von einem 3xP3-Promotor angetrieben wurde. Das Spender-DNA-Rückgrat wurde von GenetiVision konstruiert und die vollständige Spendersequenz für die uexD-Linie ist auf Anfrage erhältlich. Die erfolgreiche Bearbeitung wurde durch die Expression von GFP in den Fliegenaugen identifiziert und durch genomische PCR und Sequenzierung bestätigt. In den uexD-Fliegen wurde ein 3047 bp großes Fragment von 30.947 bis 33.993 durch die Sequenz zwischen den beiden Homologiearmen im Donorplasmid ersetzt, hauptsächlich das STOP-Signal und die GFP-Kassette. Das uexD-Allel verkürzt den uex-ORF. Die für die genomische PCR-Verifizierung verwendeten Primer sind in der Ressourcentabelle aufgeführt. Das nos-Cas9-Transgen (auf dem X-Chromosom) wurde durch Kreuzen entfernt.

CRISPR/Cas9--bearbeitete uex::HA-Fliegen wurden von WellGenetics unter Verwendung des ScarlessDsRed-Systems generiert, das vom Labor von Kate O'Connor-Giles entwickelt wurde (unveröffentlicht, Originalplasmid an Addgene gespendet, Nr. 80822). Ein 6XHA-Tag wurde im Leseraster an den Carboxy-Terminus von UEX fusioniert, indem die 6XHA-codierende Sequenz unmittelbar vor dem nativen STOP-Codon in den uex-Lokus eingefügt wurde ( 3 – Abbildungsergänzung 1A). Der Prozess umfasste zwei Hauptschritte. In Schritt 1 wurde ein 6XHA-Tag zusammen mit einem pBAC-Transposon, das eine DsRed-Kassette enthielt, in den Leserahmen mit dem STOP-Codon von uex unter Verwendung von CRISPR/Cas9--vermittelter Genombearbeitung durch homologiegesteuerte Reparatur (HDR) unter Verwendung von 1 gRNA und eingefügt ein dsDNA-Plasmidspender. Die gRNA liegt 50 bp vom uex-STOP-Codon entfernt und sollte einen Schnitt zwischen 48.587 und 48.588 dirigieren. Die gRNA wurde in ein pCFD3-dU63gRNA-Plasmid kloniert. Ein stromaufwärts gelegener Arm von 1.200 bp (47.438,48.637) und ein stromabwärts liegender Arm von 1.033 bp (48.641,49.673) wurden in das Donor-DNA-Plasmid mit dem pUC57-Kan (2579 bp)-Rückgrat kloniert. Siehe Ressourcentabelle für gRNA- und Primersequenzen. Eine Protospacer Adjacent Motif (PAM)-Mutation (TCC zu TCG, 48.581.48.583) wurde in den Spender eingeführt, um HDR zu fördern. Ein 6XHA-Tag, gefolgt von einem pBAC-Transposon, das eine 3XP3-Promotor-gesteuerte DsRed-Kassette enthielt, wurde zwischen die beiden Homologiearme eingefügt. Ein pBAC-Erkennungsmotiv TTAA ist in das STOP-Codon von 6XHA eingebettet. Die vollständige Spendersequenz ist auf Anfrage erhältlich. Spender- und gRNA-Plasmide wurden in nos-Cas9-Embryonen (NIG-FLY, CAS0002) injiziert. Die erfolgreiche Bearbeitung wurde durch die Expression von DsRed in den Fliegenaugen identifiziert und durch genomische PCR und Sequenzierung bestätigt. Sechs unabhängige positive Linien wurden identifiziert und vier bestanden die PCR-Validierung. Von diesen vier Linien hat eine weitere die Sequenzvalidierung bestanden und ist die in Abbildung 3 dargestellte Zwischenlinie – Abbildungsergänzung 1A. Aus dieser Linie wurden vier isogenisierte und balancierte Bestände hergestellt. In Schritt 2 wurde der DsRed-Selektionsmarker durch PiggyBac (PBac)-Transposition mit der Helferlinie Tub-PBac (BDSC, 8285) ausgeschnitten. Fünf homozygote lebensfähige Linien mit erfolgreicher Exzision wurden durch genomische PCR und Sequenzierung validiert. Ein als uex::HA bezeichnetes wurde in Experimenten im Manuskript verwendet.

Um die CRISPR/Cas{{0}}-bearbeiteten uexT626NRR-Fliegen zu konstruieren, haben wir eine gRNA entworfen und kloniert und ein einzelsträngiges Oligo-Desoxynukleotid (ssODN) entworfen und bestellt (Sigma). gRNA- und ssODN-Sequenzen sind in der Ressourcentabelle aufgeführt. Da wir planten, eine einzelne Aminosäuresubstitution R622K in der UEX-CNBH-Domäne vorzunehmen, war der 120-bp-ssODN-Donor auf Codon R622 zentriert und trägt die Codon-Änderung CGT zu AAA (bei 31.179.31.181), die R622K entspricht. Die erwartete Schnittstelle der gRNA (zwischen 31.192 und 31.193) ist nur 11 bp vom erwarteten Mutationspunkt entfernt. Um die Wahrscheinlichkeit von HDR zu erhöhen, die bei Verwendung von ssODN als Spender angeblich gering ist, haben wir kommerziell (GenetiVision) Bearbeitungsmaterial in 250 lig4 KO vasa-Cas-Embryonen injiziert (Zimmer et al., 2016). Wir erhielten 37 lebensfähige G0-Fliegen aus den injizierten Embryonen. Insgesamt 224 G1-Fliegen wurden einer Einzelfliegen-Genom-PCR und Sequenzierung unterzogen, um auf die erwartete Mutation zu screenen. Grundierungen detailliert in der Ressourcentabelle. Wir identifizierten 59 mutmaßlich bearbeitete Linien aus dem Screening der ersten Runde, und von diesen wurden 12 bestätigt. Trotz der Verwendung von lig4 KO vasa-Cas9 haben wir anstelle von HDR-vermittelten Punktmutationen nur nicht-homologe Endjoining-Ereignisse (NHEJ) festgestellt. Von den 12 bearbeiteten Linien waren sechs homozygot tödlich und die anderen sechs lebensfähig. In vier der homozygoten lebensfähigen Linien fanden wir einen Ersatz von G durch T an Position 31.192 zusammen mit einer 6 bp In-Frame-Insertion von ATCTTC zwischen 31.192 und 31.193. Diese NHEJ-Bearbeitung entspricht dem T626 ! NRR-Änderung in der Proteinsequenz von UEX (Abbildung 5A). Das X-Chromosom vasa-Cas9 wurde von diesen Linien durch Kreuzen entfernt und eine als uexT626NRR bezeichnete Linie wurde in den Verhaltensexperimenten im Manuskript verwendet.

Methodendetails

Verhaltensexperimente

Für Verhaltens-T-Labyrinth-Experimente wurden 1–7- Tage alte Fliegen gemischten Geschlechts verwendet. Die Gerüche waren 4--Methylcyclohexanol (MCH) und 3--Octanol (OCT), verdünnt ~1:103 (insbesondere 9 ml MCH oder 7 ml OCT in 8 ml Mineralöl). Alle Experimente wurden bei 23 °C und 55–65 % relativer Luftfeuchtigkeit durchgeführt.

Appetit sofort und späterErinnerungExperimente wurden im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (Krashes und Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). Chargen von 100–120 Fliegen wurden vor dem Training in 35-ml-Hungerfläschchen mit ~2 ml 1-prozentigem Agar (als Wasserquelle) und einem 2-cm-4-cm-Filterpapier 21-23 Stunden lang ausgehungert. Zuckerpapiere (5 cm × 7,5 cm) für das Training wurden durch Tränken mit 4 ml 2 M Saccharose und Trocknen über Nacht hergestellt. Wasserpapiere der gleichen Größe wurden mit Wasser getränkt und über Nacht stehen gelassen. Für das appetitliche Training wurden die Fliegen aus einem Hungerröhrchen in ein Trainingsröhrchen mit einem trockenen "Wasser"-Papier überführt und sofort am Trainingsarm des T-Labyrinths befestigt und 2 min lang dem CS-Geruch ausgesetzt, gefolgt von 30 s lang saubere Luft. Die Fliegen wurden dann in ein anderes Übungsröhrchen mit trockenem Zuckerpapier überführt, am T-Labyrinth befestigt und 2 Minuten lang dem CS plus-Duft ausgesetzt. SofortErinnerungwurde getestet, indem Fliegen zum T-Wahlpunkt transportiert wurden und ihnen 2 min Zeit gegeben wurde, zwischen den beiden Geruchsströmen zu wählen. 24 Std. testenErinnerungwurden die Fliegen aus dem Trainingsröhrchen entfernt und für 1 Stunde in Standard-Maismehl-Nahrungsmittelfläschchen überführt, dann bis zum Test für 23 Stunden zurück in Hungerfläschchen überführt. Der Leistungsindex wurde berechnet als die Anzahl der Fliegen im CS-Plus-Arm minus der Anzahl im CS-Arm, dividiert durch die Gesamtzahl der Fliegen. MCH und OCT wurden abwechselnd als CS plus oder CS verwendet, und eine einzelne Probe oder n repräsentiert den durchschnittlichen Leistungsindex von zwei reziprok trainierten Gruppen.

Für Verhaltenstests nach Fütterung mit Mg2 plus wurden 1–2- Tage alte Fliegen in Fläschchen mit Mg2 plus ergänzter Nahrung für 1–5 Tage gehalten, bevor sie für Appetittraining und Tests, wie oben beschrieben, ausgehungert wurden. Um 80 mM [Mg2 plus ] Futter herzustellen, wurden 40 ml 1 M MgCl2-Lösung zu 460 ml normalem flüssigem Fliegenfutter gegeben; 1 mM [Mg2 plus ]-Nahrung wurde hergestellt, indem 0,5 ml 1 M MgCl2 in 39,5 ml MilliQ-Wasser verdünnt und zu 460 ml flüssiger Nahrung gegeben wurden. Das Futter wurde aliquotiert und zur Verfestigung gekühlt. Mit MgSO4 und CaCl2 ergänztes Futter wurde auf die gleiche Weise zubereitet.

Aversiv sofort und 24 StdErinnerungExperimente wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Hirano et al., 2013; Perisse et al., 2016; Tully und Quinn, 1985). Gruppen von 100–120 Fliegen wurden entweder mit einem Zyklus aversiven Trainings oder mit fünf Zyklen im Abstand von 15 Minuten zwischen den Versuchen (gespreiztes Training) trainiert. Für aversive unmittelbarErinnerung, Fliegen wurden nach einem Trainingszyklus getestet. Aversive 24 StdErinnerungwurde mit zwei verschiedenen Protokollen getestet. Im Fasten-erleichterten Protokoll wurden Fliegen 16 Stunden lang vor dem One-Cycle-Training ausgehungert (Hirano et al., 2013). Für das beabstandete Training wurden die Fliegen vor dem Training nicht ausgehungert. Die Fliegen wurden nach dem Fasten-erleichterten und beabstandeten Training 24 Stunden lang mit normalem Fliegenfutter gefüttert, bevor sie getestet wurdenErinnerungLeistung. Während jedes aversiven Trainingszyklus wurden die Fliegen 1 Minute lang einem ersten Geruch (CS plus ) ausgesetzt, gepaart mit zwölf 90-V-Elektroschocks in 5-Sekunden-Intervallen. Nach 45 s sauberer Luft wurde ein zweiter Geruch (CS) für 1 min ohne Schock dargeboten. Der Leistungsindex wurde als die Anzahl der Fliegen im CS-Arm minus der Anzahl im CS-Plus-Arm berechnet

Arm, dividiert durch die Gesamtzahl der Fliegen. MCH und OCT wurden abwechselnd als CS plus oder CS verwendet, und eine einzelne Probe oder n repräsentiert den durchschnittlichen Leistungsindex von zwei reziprok trainierten Gruppen.

Sensorische Schärfetests (Abbildung 2 – Quelldaten 1) wurden wie beschrieben (Keene et al., 2004; Keene et al., 2006; Schwaerzel et al., 2003) mit Modifikationen durchgeführt. Um die Geruchsschärfe zu testen, wurden ungeschulten Fliegen 2 Minuten Zeit gegeben, um zwischen einem verdünnten Geruch, wie er bei der Konditionierung verwendet wird, und Luft, die durch Mineralöl im T-Labyrinth geperlt wurde, zu wählen. Ein Vermeidungsindex wurde berechnet als die Anzahl der Fliegen im Luftarm minus der Anzahl im Geruchsarm, dividiert durch die Gesamtzahl der Fliegen. Die Stromschlagvermeidung wurde ähnlich durchgeführt und berechnet. Ungeübte Fliegen wählten 1 Minute lang zwischen zwei Röhren mit Stromgittern, aber nur eine war mit der Stromquelle verbunden. Ein Vermeidungsindex wurde berechnet als die Anzahl der Fliegen im nicht elektrifizierten Arm minus der Anzahl im elektrifizierten Arm, dividiert durch die Gesamtzahl der Fliegen. Um die Zuckerschärfe zu beurteilen, wurden ausgehungerten Fliegen 2 Minuten Zeit gegeben, um zwischen einem Arm des T-Labyrinths, der ein getrocknetes Zuckerpapier enthielt, und dem anderen, der ein getrocknetes „Wasser“-Filterpapier enthielt, zu wählen. Beide Arbeiten wurden wie im Appell vorbereitetErinnerungTests. Ein Präferenzindex wurde berechnet als die Anzahl der Fliegen im Zuckerarm minus der im anderen Arm, dividiert durch die Gesamtzahl der Fliegen. Wir fanden heraus, dass das Licht im Verhaltensraum eingeschaltet blieb und ein Luftstrom durch die Reagenzgläser strömte, den Präferenzindex bei Wildtyp-Fliegen stark verbesserte und wendeten daher diese Bedingungen für alle Zuckerpräferenztests an.

Anti-UEX-Antikörper und Western Blot

Ein polyklonaler UEX-Antikörper wurde kommerziell von Eurogentec entwickelt. Zwei Peptide wurden als Antigene synthetisiert: Peptid 1 H-CLPKLDDKFESKQSKP-OH (16aa) und Peptid 2 H-CVDNRTK TRRNRYKKA-NH2 (16aa) und Kaninchen injiziert. Nur Peptid 2 induzierte eine robuste Immunantwort und wurde weiter verarbeitet. Das Endserum wurde gegen Peptid 2 gereinigt und als 1:2000-Verdünnung für die Western-Blot-Analyse verwendet.

Für jede Probe im Western Blot wurden Proteine ​​aus 2 0-Fliegenköpfen durch gründliches Homogenisieren in 120 ml Proteinprobenpuffer extrahiert, der eine Mischung aus 30 ml 2-Mercaptoethanol (Bio-Rad), 270 ml enthielt 4 Laemmli-Probenpuffer (BioRad) und 900 ml nukleasefreies Wasser (Invitrogen). Die Proben wurden dann 3 Minuten lang auf einem 100 °C-Heizblock gekocht und vor dem Beladen 10 Minuten lang zentrifugiert. Ein Probenvolumen, das vier Köpfen entspricht, wurde in jede SDS-PAGE-Gelspur geladen. Die Proteine ​​wurden auf eine PVDF-Membran übertragen und in 5-prozentiger Magermilch für 1 Stunde bei 25 °C unter Rühren mit 35 U/min blockiert. Die Membran wurde dann in Anti-UEX-Lösung (1:2000 Kaninchen-Anti-UEX in 5 % Magermilch) über Nacht bei 4°C unter Rühren mit 35 U/min inkubiert. Die Membran wurde dreimal schnell gewaschen, gefolgt von Waschschritten von 3 10 min in TBST-Lösung (100 ml TBS 10-Lösung, BioRad, verdünnt in 900 ml MilliQ-Wasser, mit 0,1 Prozent Tween 20) und dann mit HRP-konjugiertem inkubiert sekundäre Antikörperlösung (1:5000 Ziegen-Anti-Kaninchen in 5 % Magermilch) für 1–2 Stunden bei 25 °C mit 35 U/min Rühren. Die Membran wurde erneut dreimal schnell gewaschen, gefolgt von 3 10 min Waschschritten in TBST. Proteinbanden wurden unter Verwendung von Pierce ECL-Western-Blotting-Substrat (Life Technologies, 32134) sichtbar gemacht. Die Membran wurde dann unter Verwendung von Millipore ReBlot Plus Mild-Lösung (Merck, 2502) gestrippt, erneut in 5 % Magermilch blockiert und mit Maus-Anti-Tubulin-Primärantikörper (1:2000, Sigma, T6199) und entsprechendem HRP-konjugiertem Ziegen-Antikörper sondiert. Maus-Sekundärantikörper (1:5000) nach dem oben beschriebenen Protokoll.

Immunfärbung

Die Immunfärbung wurde wie beschrieben durchgeführt (Wu und Luo, 2006). Gehirne von 1- bis 5- Tage alten erwachsenen Fliegen wurden in PBS seziert und für 20 min in PBS mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert. Sie wurden dann zweimal kurz in 0,5 % PBT (2,5 ml Triton-X100 in 497,5 ml PBS) und dreimal 20 Minuten lang gewaschen. Die Gehirne wurden dann für 30 min bei Raumtemperatur in PBT mit 5 % normalem Ziegenserum blockiert und dann mit primären und sekundären Antikörpern mit leichter Rotation (35 U/min) bei 4 °C für 1 oder 2 Tage inkubiert. Primäre Antikörper waren Kaninchen-anti-GFP (1:250; Invitrogen A11122) und Kaninchen-anti-HA (1:250, NEB 3724T). Alexa 488-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen (1:250; Invitrogen, A11034) war der sekundäre Antikörper. Vor und nach der Inkubation mit dem sekundären Antikörper wurden die Gehirne zwei schnellen Waschungen unterzogen, gefolgt von drei 20-minütigen Waschungen in 0,5 % PBT. Gefärbte Gehirne wurden auf Glasobjektträger in Vectashield (Vector Labs H1000) montiert und unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops Leica TCS SP5 bei 40-facher Vergrößerung (HCX PL APO 40, 1,3 CS-Ölimmersionsobjektiv, Leica) abgebildet. Bildstapel wurden mit 1024 1024-Auflösung in 1-mm-Schritten gesammelt und mit Fidschi verarbeitet (Schindelin et al., 2012). Für die Quantifizierung in Abbildung 3G und H wurden rechteckige ROIs von etwa 40 25 mm für den Globus oder runde ROIs mit einem Durchmesser von 15 mm für ab, a'b' und EB manuell auf einem einzigen Abschnitt gezeichnet eines Z-Stapel-Scans des Fliegenhirns. Entsprechende ROIs wurden auch auf dem oberen medialen Protocerebrum (SMP) als Hintergrundkontrollregion gezeichnet, und die mittlere Fluoreszenz wurde mit ImageJ berechnet. Die ROI-Intensität der MB-Lappen und des EB wurde auf die der jeweiligen SMP-Intensität normalisiert. Für einen einzelnen Datenpunkt wurde ein Durchschnitt zwischen linker und rechter Gehirnhälfte verwendet. Für die Quantifizierung in den Abbildungen 7C und D sind ROIs in den Abbildungen angegeben, und die ROI-Intensität wurde ähnlich wie in Abbildung 3H berechnet. In Abbildung 7C wurde eine Linie durch den breitesten Teil der Spitze des a-Lappens gezogen. Das Intensitätsprofil dieser Linie wurde durch ImageJ erhalten. Für jedes Linienprofil wurden 30 Datenpunkte in der Mitte eines solchen Profils, das etwa eine 15-mm-Linie überspannt, extrahiert. Das Profil wurde weiter auf den Mittelwert der ersten fünf Datenpunkte (F0) normalisiert und als (F F0)/F0 berechnet. Mittelwerte dieser normalisierten Profile aus verschiedenen Gehirnen wurden aufgetragen (Abbildung 7C, mittleres Feld). Linke und rechte Gehirnprofile wurden berechnet und werden separat angezeigt. In Abbildung 7D werden die relativen Intensitäten von verschiedenen ROIs, die verschiedene Regionen darstellen, addiert, um ein Gesamtintensitätsmaß für den MB zu erzeugen.

Das zur Untersuchung von Mg2 plus Efflux in Zellkultur verwendete menschliche CNNM4-cDNA-Expressionskonstrukt ist das zuvor beschriebene (Yamazaki et al., 2013). Ein Konstrukt, das Drosophila uex exprimiert, wurde durch Einfügen eines FLAG-Tags vor dem STOP-Codon des uex-CDS erzeugt. CNNM4- und uex-cDNAs mit FLAG-Tag wurden anschließend in pCMV-Tag-4A (Agilent) zur Expression in HEK293-Zellen eingefügt. HEK293-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Nissui) kultiviert, das mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika ergänzt war. Expressionsplasmide wurden mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfiziert.

Für die Immunfärbung wurden die Zellen mit 3,7 % Formaldehyd in PBS für 20 min fixiert und dann mit 0,2 % Triton X-100 in PBS für 5 min permeabilisiert, beides bei Raumtemperatur. Als nächstes wurden sie mit PBS, das 3 Prozent FBS und 10 Prozent Rinderserumalbumin (Blockierungspuffer) enthielt, für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die Zellen wurden dann über Nacht bei 4 °C mit Kaninchen-Anti-FLAG-Antikörper (F7425, Sigma-Aldrich), verdünnt in Blockierungspuffer, inkubiert, dreimal mit PBS gewaschen und 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Alexa 488--konjugiertem Anti- Kaninchen-IgG (Invitrogen) und Rhodamin-Phalloidin (zur F-Aktin-Visualisierung, Invitrogen), verdünnt in Blockierungspuffer. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden Deckgläser auf Objektträger montiert und mit einem konfokalen Mikroskop (FluoView FV1000; Olympus) abgebildet.

Die Mg2 plus-Bildgebung mit Magnesium Green wurde wie beschrieben durchgeführt (Yamazaki et al., 2013), mit leichten Modifikationen. Um eine mögliche Verringerung von [Mg2 plus ]i mit den exprimierten Proteinen zu vermeiden, wurden transfizierte HEK293-Zellen bis zur Bildgebung in mit 40 mM MgCl2 ergänztem Wachstumsmedium kultiviert. Die Zellen wurden dann mit Mg2 plus -Ladepuffer (78,1 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 40 mM MgCl2, 5,5 mM Glucose und 5,5 mM HEPES-KOH [pH 7,4]), einschließlich 2 mM Magnesium Green-AM, inkubiert (Invitrogen), für 30 min bei 37 °C. Die Zellen wurden dann einmal mit Ladepuffer gespült und mit einem Olympus IX81-Mikroskop betrachtet, das mit einer ORCA-Flash 4.0 CMOS-Kamera (Hamamatsu) und einer SHI-1300L-Quecksilberlampe (Olympus) ausgestattet war. Die Fluoreszenz wurde alle 20 s (Anregung bei 470–490 nm und Emission bei 505–545 nm) unter der Kontrolle der Metamorph-Software (Molecular Devices) gemessen. Der Puffer wurde dann auf Mg2 plus freien Puffer geändert (MgCl2 im Ladepuffer wurde durch 60 mM NaCl ersetzt). Die Daten werden als Liniendiagramme dargestellt (Mittelwert von 10 Zellen). Nach der Bildgebung wurden die Zellen mit PBS fixiert, das 3,7 Prozent Formaldehyd enthielt, und einer Immunfluoreszenzmikroskopie unterzogen, um die Proteinexpression zu bestätigen.

FRET-basierte Mg2 plus Konzentrationsmessungen in fixierten Fliegengehirnen

Ein- bis zwei Tage alte Fliegen mit Genotyp c739; UAS-MagFRET-1 wurden in Fläschchen mit 1 mM oder 80 mM [Mg2 plus ] Nahrung für 4 Tage untergebracht, bevor sie gesammelt wurden. Fliegenhirne wurden in PBS seziert und für 20 min in PBS mit 4 Prozent Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert. Sie wurden dann zweimal kurz in 0,5 % PBT (2,5 ml Triton-X100 in 497,5 ml PBS) und dreimal 10 Minuten lang gewaschen. Die Gehirne wurden dann auf Glasobjektträger in Vectashield (Vector Labs H1000) montiert und mit einem Wide-Field Scientifica Slicescope mit einem 40 , 0,8 NA Wasserimmersionsobjektiv und einer Andor Zyla sCMOS-Kamera mit Andor Solis Software (v4.27) abgebildet. Um das FRET-Verhältnis zu erhalten, das die Mg2-Plus-Konzentration des ab-Neurons angibt, wurden Zeitreihen abwechselnd zwischen dem Coelin-Kanal und dem Citrin-Kanal bei 3 Hz mit 512 512-Pixeln und 16 Bit aufgenommen. Die Anregungswellenlänge für beide Kanäle beträgt 436 nm, während der Emissionsfilter für Coelin 460–500 nm und für Citrin 520–550 nm beträgt. Die Serienakquisition beginnt mit dem Coelin-Kanal und dauert 5 s, wechselt dann zum Citrin-Kanal und dauert weitere 5 s, und dieser Zyklus wird noch zweimal wiederholt. Für jedes Gehirn wurden daher insgesamt 30 s (90 Frames) Bildstapel aufgenommen. Bildstapel wurden anschließend mit ImageJ und benutzerdefinierten Matlab-Skripten analysiert. Kurz gesagt, rechteckige ROIs (Abbildung 1E, linkes Feld) wurden manuell auf den Ab-Lappen (einer auf einem Lappen und einer auf B-Lappen für jede Hemisphäre) und außerhalb der Ab-Lappen (einer für jede Hemisphäre) als Hintergrundkontrolle gezeichnet. Die Fluoreszenzintensität aus dem himmelblauen Kanal wurde berechnet, indem jeder vertikale oder horizontale Keulen-ROI durch den Hintergrund-ROI dividiert und zwischen den beiden Hemisphären für jeden Keulen gemittelt und über die 15 Frames für jeden Zyklus gemittelt wurde. Das aus dem Citrinkanal wurde in ähnlicher Weise erhalten. Aus den obigen Intensitäten wurde ein FRET-Verhältnis erhalten, das weiter über die drei Erfassungszyklen gemittelt wurde und als ein Datenpunkt in Abbildung 1E (rechtes Feld) dargestellt ist.

Konfokale Mg2-plus-Bildgebung im explantierten Fliegengehirn

Explantatgehirne, die c739-GAL4-gesteuertes UAS-MagIC exprimieren, wurden auf den Boden einer 35-mm-Mikrotiterplatte mit Glasboden (Teile-Nr. P35G-1.5–14 C, MatTek Corporation) unter Extrazellulär platziert Salzpufferlösung (103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM N-Tris, 10 mM Trehalose, 10 mM Glucose, 7 mM Saccharose, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 1,5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, Osmolarität 275 mOsm [ pH 7,3]) nach Dissektion in kalziumfreiem Puffer (Barnstedt et al., 2016). Um die Mg2-Plus-Empfindlichkeit von UAS-MagIC sowie die Reaktion von UAS-MagIC auf andere Chemikalien wie EDTA, EGTA und CaCl2 (Abbildung 8B) zu bestimmen, wurden Gehirne in der Salzlösung mit 20 mg/ml Digitonin für inkubiert 6 min vor der Bildgebung (Koldenkova et al., 2015). Um die Mg2 plus Fluktuation als Reaktion auf die Anwendung von Forskolin (FSK) zu untersuchen (Abbildung 8C–I), wurden Gehirne ohne Digitonin oder Inkubation in die Salzpufferlösung gegeben. In beiden Situationen bezieht sich Kochsalzlösung auf den Puffer (entweder mit oder ohne Digitonin), in den das Gehirn eingetaucht ist.

Die Bildgebung wurde in einem konfokalen LSM780-Mikroskop (Zeiss) mit einem 20-Luft-Objektiv unter Verwendung der ZEN 2011-Software durchgeführt. Der Venus-Teil von MagIC wurde mit einem 488-nm-Laser angeregt und seine Emission wurde im Bereich von 520–560 nm gesammelt. mCherry wurde mit einem 561-nm-Laser angeregt und seine Emission wurde im Bereich von 600–640 nm gesammelt. Zeitreihen wurden bei 0,5 Hz mit 512 512 Pixeln und 16 Bit erfasst. Nach 60 s Basislinien-Venus/mCherry-Messung wurden 2–20 ml Kochsalzlösung oder eine andere relevante chemische Lösung über eine Mikropipette in die Schale mit konstanter Bildaufnahme gegeben. Die Auswirkungen der aufgetragenen Wirkstoffe auf die Venus/mCherry-Emission wurden dann für 15–20 min aufgezeichnet.

Bildstapel wurden anschließend mit ImageJ und benutzerdefinierten Python-Skripten analysiert. Kurz gesagt, rechteckige ROIs wurden manuell auf die ab-Neuronen gezeichnet (eine für jede Hemisphäre, Abbildung 8A), und eine andere ROI der gleichen Größe wurde in der Mitte, aber außerhalb der MBs als Hintergrundkontrolle gezeichnet. Die Fluoreszenzintensität des Venus- (oder mCherry-) Kanals wurde berechnet, indem der Hintergrund-ROI von den Calyx-ROIs subtrahiert und zwischen den beiden Hemisphären gemittelt wurde. Dies wird als „Rel. Intensität (au)“ in Abbildung 8D und E. Das Verhältnis zwischen Venus- und mCherry-Intensität wurde als „MagIC-Verhältnis“ in Abbildung 8B und C sowie Abbildung 8F und G berechnet. Für Abbildung 8H wurde die Intensität für die beiden Kanäle separat berechnet. In diesem Fall „Rel. Intensität (DF/F0)' bezieht sich auf die relative Fluoreszenzintensität, normalisiert auf die mittlere Intensität aus der Basisperiode F0, berechnet als (FF0)/F{{9} }. Die relative Intensität DF/F0 der Venus wurde verwendet, um die PSD (Abbildung 8I) durch die Python-Funktion psd (unter matplotlib.pyplot) zu berechnen, die die durchschnittliche Periodogramm-Methode von Welch übernahm (Bendat et al., 2000).

Reverse Transkription und quantitative Echtzeit-PCR

Für jede Probe wurden 120 Fliegen in flüssigem Stickstoff eingefroren und ihre Köpfe vollständig in TRIzol-Reagenz (Invitrogen) homogenisiert. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines Direct-zol RNA MiniPrep (R2050)-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. cDNA wurde unter Verwendung des SuperScript III First-Strand-Synthesesystems (Invitrogen) synthetisiert. Für jede unterschiedliche Behandlung oder jeden Genotyp wurden fünf unabhängige Proben hergestellt. Quantitative PCR wurde dreifach für jede cDNA-Probe auf einem LightCycler 480 Instrument (Roche) unter Verwendung von SYBR Green I Master Mix (Roche) durchgeführt. Schmelzkurven wurden nach der Amplifikation analysiert, und Amplikons wurden durch Agarose-Gelelektrophorese sichtbar gemacht, um die Primerspezifität zu bestätigen. Relative Transkriptspiegel wurden nach der 2-DDCt-Methode (Livak und Schmittgen, 2001) berechnet, und das geometrische Mittel der Ct-Werte von drei Referenzgenen (Gapdh, Tbp und Ef1a 100E) wurde zur Normalisierung verwendet. Primer sind in der Ressourcentabelle aufgeführt.

Inverse PCR

Inverse PCR wurde verwendet, um die MiMIC-Insertionsposition in uexMI01943-Fliegen zu kartieren. Genomische DNA wurde von 15 erwachsenen Fliegen präpariert. Zwei Fliegen entsprechende DNA wurde dann in einer 25-ml-Restriktionsreaktion mit MboI verdaut, und 10 ml des Produkts wurden über Nacht bei 4°C ligiert, um die Fragmente zu zirkularisieren; 5 ml des Ligationsprodukts wurden für die inverse PCR verwendet. Das PCR-Produkt wurde vor der Sequenzierung unter Verwendung einer Exo/SAP-Reaktion (Thermo Fisher, 78201) gereinigt. Die Sequenz wurde mit dem D. melanogaster-Genom (FlyBase, Release 6) durch BLAST verglichen und einheitlich mit der Region 3.882.886.3.882.641 auf 2R abgeglichen, was mit der gemeldeten uexMI01943-Insertion auf FlyBase übereinstimmt. Primer sind in der Ressourcentabelle aufgeführt.

Vorhersage und Ausrichtung von Proteindomänen

Das Proteinsequenz-Alignment wurde unter Verwendung von Geneious R10.2.2 durchgeführt. Die Proteindomänenvorhersage wurde mit InterPro (Finn et al., 2017; Jones et al., 2014) und Phyre2 (Kelley et al., 2015) durchgeführt. Proteindomänen- und Struktur-Alignment wurde unter Verwendung von TM-align durchgeführt (Zhang und Skolnick, 2005). Die Visualisierung der Proteinstruktur wurde in Chimera 1.11.2 (Pettersen et al., 2004) gerendert.

Quantifizierung und statistische Analysen

Verhaltensdaten wurden mit Excel und Prism 6 analysiert. Bildgebungsdaten wurden mit ImageJ und benutzerdefinierten MATLAB- oder Python-Skripten analysiert. Ungepaarte zweiseitige t-Tests wurden zum Vergleichen von zwei Gruppen verwendet, und eine einfache ANOVA, gefolgt von einem post-hoc-Test nach Tukey, wurde zum Vergleichen mehrerer Gruppen verwendet. Die Schwelle der statistischen Signifikanz wurde auf p festgelegt<>

Danksagungen

Wir danken FJ Arjona und JGJ Hoenderop für die murinen CNNM2-Klone und Kommentare zum Manuskript. Wir danken T Nagai für Klone von MagIC und MARIO und dem Bloomington Stock Center und VDRC für Fliegen. Wir danken P. Cognigni, Y. Huang, R. Brain, R. Szoke-Kovacs und M. Goodwin für technische Unterstützung und anderen Mitgliedern der Waddell-Gruppe für Diskussionen. Wir danken N. Halidi, C. Monico und der Micron Advanced Bioimaging Unit (unterstützt durch die Wellcome Strategic Awards 091911/B/10/Z und 107457/Z/15/Z) für ihre Unterstützung und Unterstützung bei dieser Arbeit. EM wurde durch ein EMBO-Langzeitstipendium (ALTF 184-2109) ​​finanziert. KDJ bedankt sich für die Unterstützung durch den Rhodes Trust. SW wurde durch ein Wellcome Principal Research Fellowship (200846/Z/16/Z) und einen ERC Advanced Grant (789274) finanziert.