Teil 4: Abbildung des epigenomischen und transkriptomischen Zusammenspiels während der Gedächtnisbildung und des Abrufs im Hippocampus-Engramm-Ensemble

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RNA-seq

ul nukleasefreies Wasser), für 30 min bei 37c unter leichtem Schütteln. Augmentierte DNA-Fragmente wurden amplifiziert und mittels PCR-Reaktion barcodiert (1 Zyklus; 5 Min. – 72 °C, 30 Sek. – 98 °C, 10 Zyklen; 15 Sek. – 98 °C, 30 Sek. – 60 °C, 3 Min. – 72 °C). Gemäß dem Protokoll des Herstellers wurde amplifizierte DNA unter Verwendung von 1,8x AMPure-Kügelchen (AmpureXP-Kügelchen, Beckman Coulter, A63880) gereinigt und gereinigt. Nach der Bioanalyzer-QC für Bibliotheksgröße und -verteilung wurden die Bibliotheken auf der Illumina Nextseq 550-Plattform im MIT BioMicro Center sequenziert.

Cistanche und Cistanches zur Verbesserung des Gedächtnisses

ATAC-seq-Analyse – Die fastq-Rohdaten von 40-bp-Paired-End-Sequenzierungs-Reads wurden mit Bowtie 2.0 im Paired-End-Modus50 mit dem mm9-Referenzgenom der Maus abgeglichen. Die Samtools-Sammlung51 wurde verwendet, um PCR-Duplikate zu sortieren, zu entfernen (rmdup), BAM-Dateien zu indizieren (index) und Bibliotheksstatistiken zu berechnen (flagstat, siehe Ergänzungstabelle 13). BAM-Dateien wurden von richtig ausgerichteten, gepaarten und eindeutigen Lesevorgängen auf 50 MB heruntergerechnet. Offene Chromatin-Peaks wurden mit der MACS252-Software analysiert. Differentiell zugängliche Regionen (DARs) wurden von Diffbind v1.16.353 mit Standardparametern und -einstellungen zur Verwendung von DESeq2 (Cutoff; FDR < 0,01;="" fold="" changes=""> 1,5) identifiziert. Die vollständige Matrix der normalisierten Zählungen (RPKM54) wurde vom DiffBind-Paket abgerufen. Für eine Generation von Bigwig-Tracks wurden Pileup-Signaldateien (Fragment-Pileup pro Million Lesevorgänge) im Biografieformat erstellt, indem die MACS2-Call-Peak-Funktion mit den Flags -B –SPMR verwendet wurde. Dann wurde unter Verwendung der bdgcmp-Funktion von MACS2 mit der Einstellung –m FE eine normalisierte Faltenanreicherung (FE) über Eingabe-Lambdaspuren erzeugt. Dann wurden bedGraph-Dateien in das Bigwig-Format konvertiert.

IGV55-Tools wurden für die Visualisierung von Bigwig-Dateien verwendet. ChromHMM56 wurde verwendet, um ein Chromatin-Zustandsmodell aus zwei unabhängigen Studien zu erstellen, in denen Bulk-Hippocampus-Gewebe vor und nach einem Fußschock verwendet wurde21,22, und um zu bestimmen, ob die Anreicherung von DARs über das Zustandsmodell zu falten ist. Die Motivanreicherungsanalyse57,58 und die Peakannotation wurden mit HOMER59-Tools durchgeführt. Alle Codes sind in der ergänzenden Softwaredatei verfügbar. RNA-Extraktion und Bibliotheksvorbereitung – Unmittelbar nach der Fixierung und Sortierung (siehe Gewebevorbereitung) wurden 4 ul Protease zum Verdauungspuffer hinzugefügt (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE, Life Technologies, AM1975) . Die Proben wurden in Wärmeblöcken für 15 min bei 5 0 Grad und dann 15 min bei 8 0 Grad inkubiert. Als nächstes wurden 0,75 ml Trizol LS (TRIzol™ LS Reagent, Thermo Fisher Scientific, 10296028) und 0,2 ml Phenol: Chloroform-Lösung (Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol, 1 Phase, VWR International, K169) zu jeder Probe hinzugefügt, gefolgt von kräftiges Schütteln für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Die Suspension wurde in Phase-Lock-Gel-Heavy-Röhrchen (PLG, 5 Prime, 2302830) gegeben und bei 13{000rpm für 5 min abzentrifugiert. Die aquatische Phase mit Nukleinsäuren wurde aus den Röhrchen in ein frisches Eppendorf-Röhrchen mit einer gleichen Menge 100-prozentigem Ethanol extrahiert. Die RNA-Reinigung wurde mit dem Direct-zol TM RNA MicroPrep-Kit (Zymo Research, R2060) für die RNA-Reinigung gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. RNA wurde eluiert (10 ul, DEPC) und dann bei –80 Grad gelagert. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian (Clontech, 635006) wurde für die Erstellung und Amplifikation der Bibliothek verwendet. 3 biologische Replikate (N=3) wurden für die Erstellung der Bibliothek verwendet. Die Bibliotheken wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers ohne zusätzlichen Fragmentierungsschritt (FFPE, Option 2, siehe Handbuch), mit Depletion der ribosomalen cDNA und abschließender PCR-Amplifikation (15 Zyklen) hergestellt. Bibliotheken wurden auf der Illumina HiSeq 2000-Plattform am MIT BioMicro Center sequenziert.

RNA-seq-Analyse – Die fastq-Rohdaten wurden mit der Maus-mm9-Referenz abgeglichen

Genom mit Bowtie 2.0. Die kartierten Reads von Genkörpern (einschließlich Exons- und Intron-Reads) wurden von Manschettenknöpfen 2.260 und DEseq261 mit UCSC-mm9-Referenzgenannotation verarbeitet, um die Transkripthäufigkeit abzuschätzen. Differenzielle Genexpression und Downstream-Analysen wurden mit DEseq2 und benutzerdefinierten R-Skripten durchgeführt. Die relative Häufigkeit von Transkripten wurde durch Fragmente pro Kilobase Exon pro Million kartierter Fragmente (FPKM) gemessen.

Für die Analyse der Transkriptionsprogramme wurde die Expression jedes Gens unterschiedlich bewertetErinnerungPhasen (Aktiviert - früh, Aktiviert - spät, Reaktiviert) durch ihre log2-fache Änderung (log2FC) vom Basalzustand. 1095 differentiell exprimierte Gene (DEGs) bestanden die Cutoff-Kriterien, bei denen wir mindestens in einem Vergleich einen P-Wert von beobachteten< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">

Cistanche kann das Gedächtnis verbessern

Chromosomenkonformationserfassung (Hi-C)

Kerne von fixierten Zellen (siehe Gewebevorbereitung) wurden in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen sortiert, die 500 ul frischen eiskalten Lysepuffer (10 mM Tris pH=8, 10 mM NaCl, 0,2 % Igepal CA{{ 9}}, Wasser in Pi- und PCR-Qualität) und auf Trockeneis eingefroren und bis zu ihrer Verwendung bei –80 °C gelagert. Hi-C-Bibliotheken wurden aus 100 000 Zellen/pro Gruppe (von zwei Tieren gesammelt) in zwei biologischen Wiederholungen unter Verwendung des Dovetail™ Hi-C-Kit-Handbuchs (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, USA) hergestellt. Die sechs Hi-C-Bibliotheken wurden auf der Illumina Nextseq 500-Plattform sequenziert (Paired-End). Die HOMER Hi-C-Pipeline wurde verwendet, um experimentelle Artefakte wie Zirkularisierung, Selbstligationen und PCR-Duplikate zu filtern. Gefilterte Reads wurden mit dem Referenz-Mausgenom (mm9) abgeglichen und mit der HOMER HI-C-Pipeline weiterverarbeitet.

Die Hi-C-Tools von HOMER wurden verwendet, um eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) an den Hi-C-Daten durchzuführen, um subnukleare Kompartimente (A und B) mit einer Auflösung von 50 Kb zu identifizieren (siehe ergänzende Software). Für die Abteilungswechselanalyse haben wir zuerst die PC1-Werte zwischen den Gruppen subtrahiert. Als nächstes identifizierten wir die oberen BtoA-Übergänge als Regionen mit PC1-Änderungen über dem 90. Perzentil und die oberen AtoB-Übergänge als Regionen mit PC1-Änderungen unter dem 10. Perzentil. Da subnukleare Kompartimente als Einheiten von mehreren hundert Kilobasen reguliert werden, haben wir aufeinanderfolgende 50-Kb-AtoB- oder BtoA-Segmente konsolidiert, die sich in einem Abstand von 100 Kb voneinander befanden. Konsolidierte Domänen mit einer Gesamtgröße von weniger als 200 KB haben wir verworfen. Fachwechsel wurde nur berücksichtigt, wenn ein negativer Wert in einen positiven Wert transformiert wurde (und umgekehrt). Schließlich wurden positive und negative Werte der ersten Komponente zwischen allen drei Neuronenpopulationen (basal, aktiviert – früh und aktiviert – spät) verglichen.

Promoter erfassen Hi-C

Nach der Fixierung und Sortierung (siehe Gewebevorbereitung) wurden die Zellen in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen sortiert, die 500 ul frischen eiskalten Lysepuffer (10 mM Tris pH=8, 10 mM NaCl, 0,2 % Igepal CA{ {9}}, Wasser in Pi- und PCR-Qualität), auf Trockeneis eingefroren und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Hi-C-Bibliotheken wurden aus 10,000 Zellen/pro Gruppe (N=3–4) hergestellt, wie zuvor beschrieben62, mit einigen Modifikationen. Die Proben wurden herunterzentrifugiert (4 Grad, 1.600 g für 20 min) und das Pellet wurde in 400 ul 1,2x Cutsmart-Puffer (New England Biolabs,

VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA). Der erste Restriktionsverdau wurde wie im Originalprotokoll beschrieben mit 1.500 U HindIII (R3104L, New England Biolabs, USA) als 6--Basisschneider (anstelle von BglII im Originalprotokoll) durchgeführt. Nach Biotin-Markierung und Ligation über Nacht (Einzelheiten siehe ursprüngliches Protokoll) wurden die Proben herunterzentrifugiert (4 Grad, 1.600 × g für 15 min) und das Pellet wurde in 25 μl PBS resuspendiert. Die Suspension wurde in 65°C mit 3 &mgr;l Proteinase K für 12–16 h inkubiert. Die Reinigung von Hi-C-DNA wurde wie im Originalprotokoll beschrieben mit 100 ul Streptavidin-Kügelchen (Dynabeads M-280-Streptavidin, Life Technologies, 11205D) durchgeführt. Für das zweite Restriktionsenzym verwendeten wir den 4-Basenschneider Hpych4V (10 U/pro Probe, R0620S, New England Biolabs, USA). Nach der A-Tailing-Reaktion (Einzelheiten siehe Originalprotokoll) wurden die Proben mittels PCR amplifiziert (17 Zyklen) und mit AMPure XP-Kügelchen gereinigt. Hi-C-Bibliotheken wurden in 20 ul 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) eluiert. Design des Bait-Capture-Systems für Promoter Capture Hi-C – Eine Liste von 5000 Maus-Gen-Promotoren wurde aus dem zuvor veröffentlichten Protokoll in Schoenfelder erhalten. Et al.29. Die Liste enthält nur Transkripte mit einem Biotyp von proteinkodierenden Regionen mit HindIII-Restriktionsfragmentstellen. Es wurden zwei 120-bp-Einfangsonden konstruiert, eine an jedem Ende des Fragments. Die Sonden wurden von Agilent Technologies gemäß dem SureSelect Target-Anreicherungssystem (Agilent Technologies) synthetisiert.

Promotor-Capture-Hi-C-Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung – Um Hi-C-Ligationsprodukte zu erfassen, die Promotorsequenzen enthalten, verwendeten wir das zuvor veröffentlichte Protokoll29. Kurz gesagt, Hybridisierungsblocker (Agilent Technologies) wurden zu den Hi-C-DNA-Bibliotheken hinzugefügt. Hybridisierungspuffer und Capture-Bait-RNA wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt (SureSelect Target Enrichment, Agilent Technologies). Als nächstes wurden die Hi-C-Bibliotheks-DNA/Hybridisierungsblocker für 5 Minuten auf 95 Grad erhitzt, bevor die Temperatur auf 65 Grad gesenkt wurde. Hi-C-Bibliotheks-DNA wurde mit Hybridisierungspuffer (vorgewärmt für 5 Minuten auf 65 Grad) und anschließend mit dem kundenspezifischen Fangködersystem (vorgewärmt für 3 Minuten auf 65 Grad), bestehend aus 10 000 biotinyliert RNAs, die auf die Enden der HindIII-Restriktionsfragmente von 5000 Maus-Genpromotoren abzielen (Agilent Technologies, siehe ergänzendes Material für Fangköder-Design). Nach 24 h bei 65 Grad in der PCR-Maschine wurden Biotin-Pulldown (MyOne Streptavidin T1 Dynabeads; Life Technologies) und Waschungen nach dem SureSelect Target-Anreicherungsprotokoll (Agilent Technologies) durchgeführt. Nach dem letzten Waschen wurden die Beads in 30 μl NEBuffer 2 ohne vorherige DNA-Elution resuspendiert, und eine Post-Capture-PCR (vier Amplifikationszyklen unter Verwendung von Illumine-Universalprimern) wurde an DNA durchgeführt, die über biotinylierte RNA an die Beads gebunden war. Capture-Hi-C-Bibliotheken wurden Paired-End-sequenziert (Nextseq 500, Illumina).

Promoter-Capture-Hi-C-Analyse – die HiCUP-Pipeline63 wurde verwendet, um die Raw-Fastq-Sequenzierungs-Reads zu verarbeiten. Diese Pipeline wurde verwendet, um die Read-Paare gegen das Maus-Genom (mm9) abzubilden, experimentelle Artefakte (z. B. zirkuläre Reads und Religationen) zu filtern und doppelte Reads zu entfernen. Für die PC-HiC-Daten wurden die resultierenden BAM-Dateien heruntergerechnet und mit CHiCAGO Version 1.2.064 verarbeitet, wobei den Standardeinstellungen zum Aufrufen signifikanter Interaktionen gefolgt wurde. Vollständige Einzelheiten dieser Pipeline sind von Babraham Bioinformatics erhältlich

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Stereotaktische Adeno-assoziierte Virusinjektion

ArcCreERT2-Mäuse wurden mit Avertin und einer AAV9-EF1a-DIO-hChR2-EYFP-Virusinfusion (Serotyp 5, erhalten aus dem UNC-Viruskern) anästhesiert. Zuerst wurde ein kleines Loch in den Schädel über dem dorsalen Hippocampus gemacht (bezogen auf Bregma: anterior-posterior −2,0 und mediolateral ± 1,5), eine Hamilton-Spritze mit einer 33-Gauge-Nadel wurde abgesenkt auf –1,8 DV und 500 ul Virus wurden mit einer Flussrate von 50 ul pro Minute in beide Hippocampi infundiert. Die Nadel wurde nach einer 10-minütigen Nachinjektionsperiode zurückgezogen und die Mäuse konnten sich 4 Tage lang erholen.