Wie beugt Echinacosid der Parkinson-Krankheit vor?

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Teil Ⅰ: Mechanismus der Autophagieregulation bei MPTP-induzierten PD-Mäusen über den MTOR-Signalweg durch Echinacosid

Abstrakt:

Ziel: Die vorliegende Studie zielte darauf ab, die Wirkung von zu untersuchenEchinacosid(ECH) auf Autophagie-bezogene Indikatoren über den mTOR-Signalweg, insbesondere die Wirkung auf die Clearance des Autophagie-Substrats P62 und -Synuclein, die wichtigsten pathologischen Produkte vonParkinson-Krankheit(PD), um neue Strategien für die Behandlung von PD bereitzustellen (Parkinson-Krankheit). Methoden: Ein Mausmodell der subakuten PD(Parkinson-Krankheit)wurde durch die intraperitoneale Injektion von 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) festgestellt. Zunächst wurden die neurologischen Verhaltenssymptome bei Mäusen jeder Gruppe bewertet, und die Monoamin-Neurotransmitter im Striatum jeder Gruppe wurden mit einer Hochleistungs-Flüssigphase gemessen. Eine doppelte Immunfluoreszenzfärbung wurde angewendet, um die Expression von Tyrosinhydroxylase (TH), -Synuclein und LC3 zu beobachten. Mit dem Transmissionselektronenmikroskop wurden die Veränderungen der Ultrastruktur in der Substantia nigra und die Bildung von Autophagosomen beobachtet. Dann wurden die Expressionen von TH, -Synuclein, Beclin 1, LC3, P62, mTOR und dem Upstream-Protein AKT durch Western Blot nachgewiesen. Ergebnisse: Im Vergleich zur Modellgruppe verbesserte sich die neurobehaviorale Funktion signifikantEM (Echinacosid)Gruppe (P < {{0}}.01),="" zusammen="" mit="" einer="" erhöhten="" expression="" von="" th,="" da="" und="" dopac="" im="" gehirn="" (p="">< 0,01).="" in="">EM (Echinacosid)Gruppe, während die Expression von Beclin 1 und LC3-II zunahm (P < 0.01), nahmen die Expressionsniveaus von P62 und -synuclein signifikant ab (P < 0,01).EM (Echinacosid)könnte das Expressionsniveau des Überlebenssignals p-AKT/AKT hochregulieren und die Expression von mTOR verringern. Fazit:EM (Echinacosid)könnte die Autophagie erhöhen, indem es die Expression von mTOR hemmt, dadurch die Clearance von -Synuclein und den Abbau des Autophagie-Substrats P62 fördert und die neuroprotektive Wirkung ausübt.

Stichwort: Parkinson-Krankheit, MPTP,Echinacosid, -Synuclein, P62, Autophagie, mTOR

Cistanche kann die Parkinson-Krankheit behandeln

Einführung

Parkinson-Krankheit (PD)ist eine chronische und fortschreitende neurodegenerative Erkrankung. Ein typisches pathologisches Merkmal von PD(Parkinson-Krankheit)ist die Bildung von Lewy-Körperchen, und -Synuclein und Ubiquitin sind die Hauptbestandteile von Lewy-Körperchen. Immer mehr Beweise zeigen, dass die Störung der Autophagie-Regulation schließlich zur Anhäufung von fehlgefalteten Proteinen und verletzten Organellen führt.54 Der Autophagie-Lysosom-Weg kann nicht nur Proteine ​​abbauen, die nicht durch den Ubiquitin-Proteasom-Weg abgebaut werden können, sondern auch der Weg-Weg kann -synuclein abbauen. Daher kann die Regulierung der Autophagie eine neue Strategie für die Behandlung von PD bieten (Parkinson-Krankheit). Autophagie ist der Hauptweg für den Abbau intrazellulärer Aggregate, und die mTOR-Kinase ist eine wichtige regulatorische Stelle für die Autophagie. Daher ist es von theoretischer und praktischer Bedeutung, die Beziehung zwischen PD aufzuklären(Parkinson-Krankheit) und Autophagie, reguliert durch den mTOR-Signalweg. Da der Abbau von -Synuclein hauptsächlich vom Autophagie-lysosomalen System mit der Eliminierung der abnormalen Proteine ​​als Ziel abhängt, kann die Entwicklung von neuroprotektiven Arzneimitteln, die die Autophagie regulieren können, Richtungen für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen aufzeigen. EM (Echinacosid) hat die Summenformel C35 H46 O20. Es ist der Hauptbestandteil der chinesischen Medizin Cistanche Phenylethanoid-Glykoside. Es wurde erstmals von Stoll et al. aus der Wurzel des isoliertEchinaceaAngustifolia DC.EM (Echinacosid)hat ein breites Spektrum an pharmakologischen Wirkungen. Es hat entzündungshemmende, antioxidative, Nervenschutz-, Lern- und Gedächtnisverbesserungs-, Leberschutz-, Immunregulierungs- und Antitumorwirkungen. Die vorliegende Studie, ausgehend von den wichtigsten pathologischen Mechanismen von PD(Parkinson-Krankheit), zielte darauf ab, die Regulierung der neuroprotektiven Wirkungen von zu untersuchenEM (Echinacosid)in einem Maus-PD(Parkinson-Krankheit)Modell, induziert durch MPTP aus dem Autophagie-lysosomalen Weg.

Materialien und Geräte

Versuchstier

Die Versuchsgruppe bestand aus 108 männlichen C57BL/6J-Mäusen mit SPF-Grad, acht Wochen alt, 20–22 g schwer, vier Mäuse pro Käfig, gehalten bei 22–25 Grad . Die Mäuse wurden vom Shanghai Center for Laboratory Animals, Chinese Academy of Sciences, das an der Nanjing University of Chinese Medicine untergebracht ist, zur Verfügung gestellt, und die Tiere wurden gemäß den Richtlinien des National Institutes of Health in einem SPF-Klassenraum mit einer Temperatur von 22–22–24 °C human versorgt. 25 Grad, relative Luftfeuchtigkeit von 55 Prozent und unter dem 12-Stunden-zirkadianen Rhythmus. Die Mäuse durften Futter und Wasser haben.

Hauptreagenzien

MPTP (Sigma Company), Maus-anti-TH-monoklonaler Antikörper (Sigma Company), Alexa Fluor 555-Anti-Kaninchen-Antikörper (Biyuntian Institute of Biotechnology), Alexa Fluor 488-Anti-Kaninchen-Antikörper (Biyuntian Institute of Biotechnology), HRP -Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Biyuntian Institute of Biotechnology), polyklonaler Kaninchen-Synuclein-Antikörper (Cell Signaling Technology Company), HRP-Ziege-Anti-Mäuse-Sekundärantikörper (Biyuntian Institute of Biotechnology),EM(Echinacosid) (Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), Kaninchen-Anti-p-AKT (Ser473)-Antikörper (Cell Signaling Technology Company), Rapamycin (Cell Signaling Technology Company), Chloroquine (Sigma Company), Wortmannin (Sigma Company), polyclonales Kaninchen LC3-Antikörper (Abcam Company), polyklonaler Kaninchen-P62-Antikörper (Enzo Life Science Company), monoklonaler Maus-Aktin-Antikörper (Santa Cruz Company), polyklonaler Beclin-1-Antikörper (Abcam Company).

Informationen zu den Materialien:

MPTP (Amerika, Sigma Company), Maus-Anti-TH-monoklonaler Antikörper (Amerika, Sigma Company), polyklonaler Kaninchen-Synuclein-Antikörper (Amerika, Cell Signaling Technology Company), HRP-Ziege-Anti-Mäuse-Sekundärantikörper (China, Biyuntian Institute of Biotechnology ),EM(Echinacosid) (China, Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), Kaninchen-Anti-p-AKT (Ser473)-Antikörper (Amerika, Cell Signaling Technology Company), Rapamycin (Amerika, Cell Signaling Technology Company), Chloroquine (Amerika, Sigma Company), Wortmannin (Amerika, Sigma Company), polyklonaler Kaninchen-LC3-Antikörper (America, Abcam Company), polyklonaler Kaninchen-P62-Antikörper (America, Enzo Life Science Company), monoklonaler Maus-Aktin-Antikörper (America, Santa Cruz Company), polyklonaler Beclin-1-Antikörper ( Amerika, Firma Abcam).

Echinacosid behandelnParkinson-Krankheit

Experimentelle Methoden

Gruppierung von Versuchstieren

Die 108 C57BL/6J-Mäuse wurden zufällig in sechs Gruppen mit 18 Mäusen in jeder Gruppe eingeteilt. Die Details waren wie folgt: Die normale Kontrollgruppe (die Gruppe mit normaler Kochsalzlösung, N-Gruppe), die Modellgruppe (MPTP-Gruppe, M-Gruppe), dieEM(Echinacosid) Gruppe (MPTP plusEM (Echinacosid), EH-Gruppe), die induzierte Autophagie-Gruppe (MPTP plus Rapamycin-Gruppe, RA-Gruppe), die Autophagie-Inhibitor-A-Gruppe (MPTP plusEM (Echinacosid)plus Chloroquin-Gruppe, CQ-Gruppe), die Autophagie-Inhibitor-B-Gruppe (MPTP plusEM (Echinacosid)plus Wortmannin-Gruppe, WO-Gruppe). Die MPTP-Dosis betrug 30 mg/kg/Tag, kontinuierlich über 7 Tage injiziert.EM (Echinacosid) wurde mit 30 mg/kg/d intragastrisch verabreicht.9

Modellierung der Versuchstiere und Medikation

Die N-Gruppe und die EH-Gruppe erhielten normale Kochsalzlösung undEM(Echinacosid) jeweils drei Tage vor dem Modellieren bis sieben Tage nach dem Modellieren. Rapamycin,10 Wortmannin11 und Chloroquin wurden an sieben aufeinanderfolgenden Tagen nach der letzten MPTP-Injektion verabreicht. Die Dosis der Schwanzveneninjektion von Rapamycin wurde als 2 mg/kg/d berechnet. Die Dosis der intraperitonealen Injektion von Chloroquin bei Mäusen betrug 50 mg/kg/Tag. Die Dosis der Wortmannin-Injektion in die Schwanzvene bei Mäusen betrug 0,7 mg/kg/Tag (ergänzende Abbildung 1).

Die neurobehavioralen Beobachtungen

Laut Literatur12 war das selbstgebaute Gerät für den Masttest mit geringfügigen Modifikationen wie folgt: Das Gerät war eine 55 cm lange PV-Röhre mit einem Durchmesser von 1 cm und einem kugelförmigen Vorsprung von 2 cm Durchmesser an der Spitze Gerät als Befestigungspunkt für Mäuse. Das Gerät war mit schwarzem Klebeband bedeckt, um zu verhindern, dass die Mäuse herunterfallen. Jede Maus wurde während des Tests mit dem Kopf nach oben auf die kugelförmige vorstehende Spitze gelegt. Die Zeit vom oberen Ende des platzierten Balkens bis zum Absenken des Kopfes (T-Turn) und die Gesamtzeit vom oberen Ende des platzierten Balkens zum Klettern zum Boden der Röhre bis zur Landung (T-Total) wurden aufgezeichnet.

Die spontane Aktivität

Spontane Aktivität, auch bekannt als Open-Field-Aktivität, ist ein üblicher Indikator für den Nachweis der seltenen Aktivität nach einer MPTP-Verletzung.13 In der vorliegenden Studie wurde ein Videoanalysesystem für Open-Field-Experimente eingesetzt. Die genauen Arbeitsschritte waren wie folgt: Vier Mäuse der gleichen Gruppe wurden vor dem Experiment in eine Beobachtungsbox (mit einer Länge von 25 cm, einer Breite von 25 cm und einer Höhe von 25 cm) gesetzt

25 cm) 30 Minuten adaptieren. Sie wurden dann 30 Minuten lang kontinuierlich auf Video aufgezeichnet. Im Beobachtungszeitfenster von 30- Minuten wurde die Anzahl der vertikalen Bewegungen (Aufzuchtszahl) in drei diskontinuierlichen Intervallen von fünf Minuten getrennt gezählt. Das Videoanalysesystem analysierte automatisch die Trajektorie der Mausaktivitäten und erhielt eine 30--Minuten-Gesamtstrecke (Total Distance) als Indikator für die horizontale Bewegung.

Die Ganganalyse

Ganganalyse: Laut Literatur14 wurde ein selbstgebautes Ganganalysegerät verwendet. Dieses Gerät war wie folgt: Ein Holzsteg (mit einer Länge von 42 cm, einer Breite von

4,5 cm und einer Höhe von 12 cm), ein Ende war offen, das andere Ende führte zum Eichhörnchenkäfig. Der Eichhörnchenkäfig war mit einem schwarzen Tuch bedeckt. Blaue Tinte wurde auf die Unterseite der Füße der Maus getaucht. Dann wurde die Maus auf das offene Ende des Gehwegs gesetzt. Die Maus bewegte sich natürlich zum Ende des Eichhörnchenkäfigs, der mit schwarzem Tuch bedeckt war. Die drei längsten Vorder- und Hinterbeinschritte wurden jeweils gemessen und die Durchschnittswerte genommen.

Der Rotarod-Test

Die Maus wurde auf einem Rotarod mit variabler Geschwindigkeit angeordnet, wobei die Geschwindigkeit des Rotarods so eingestellt wurde, dass sie innerhalb von fünf Minuten von vier Runden/Minute auf 40 Runden/Minute zunahm. Die Zeit vom Beginn der Rotation des Rotarods bis zum Fallenlassen der Maus vom Rotarod wurde jedes Mal als Latenz bis zum Fall aufgezeichnet. Bestimmung des Gehalts an Monoamin-Neurotransmittern im Striatum durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Elektrochemie-Detektion (HPLC-ECD)

Probenahme und Behandlung

Die Mäuse wurden eingeschläfert und das Striatum wurde schnell auf Eis abgetrennt und gewogen. Entsprechend dem Verhältnis von 1 ml 5-prozentiger Perchlorsäure zu 0,1 g Gehirn (Nassgewicht) wurden die Proben jeder Gruppe in das Glas mit dem entsprechenden Volumen an Perchlorsäure gegeben und in einem Aufschlämmungsröhrchen homogenisiert . Das Homogenat wurde bei niedriger Temperatur mit 13,000 U/min für 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und die Zentrifugation wiederholt. Der Überstand wurde zur weiteren Detektion in einen Tiefkühlschrank gegeben. Die Bedingungen für HPLC-ECD waren wie folgt. Es wurde die elektrochemische Couloehemllll 5300-Chromatographie verwendet. Die Nachweismittel waren 5020- und 504-lb-Zellen mit der chromatographischen Säule von MD-150 (3,0*150 mm; 3 um), der mobilen Phase von MDTM-2 und der Empfindlichkeit von 2uA. Die Flussrate wurde auf 0,6 ml/min eingestellt, das Potential der Elektrode wurde auf 220 mV eingestellt und die Säulentemperatur wurde auf 30 Grad eingestellt. Das Injektionsvolumen betrug 20 ul (zunächst zehnfach verdünnt).

Der Inhalt der folgenden Neurotransmitter wurde nachgewiesen: Dopamin (DA), Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC), hohe Vanillinsäure (HVA), Norepinephrin (NE), {{0}}Hydroxytryptamin (5-HT), 5-Hydroxyindolessigsäure (5-HIAA). Die Immunfluoreszenzfärbung von TH, -Synuclein, LC3 und p62 Die Mäuse (n=6 pro Gruppe) wurden unter tiefer Anästhesie (5 Prozent Chloralhydrat) eingeschläfert und mit 0,9 Prozent Natriumchlorid perfundiert, gefolgt von 4 Prozent Paraformaldehyd durch die linke Herzkammer. Die Gehirne wurden schnell entfernt und für 24 Stunden nachfixiert, dann in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 3 0 Prozent Saccharose bei 4 Grad C überführt, bis sie sanken. Das Gewebe wurde in Paraffin eingebettet und Koronalschnitte (30 µm) wurden durch die Substantia nigra pars compacta (SNc; –2,8 bis –3,8 mm kaudal des Bregma) unter Verwendung eines Schlittenmikrotoms geschnitten. Die Schnitte wurden entwachst und hydratisiert, und die endogene Peroxidase wurde 30 Minuten lang mit 0,3 % H2O2 gequencht. Nach der hitzeinduzierten Antigengewinnung wurden die Objektträger jeweils 30 Minuten lang mit 0,5 % Triton-X100 und dann 5 % Rinderserumalbumin inkubiert. Die Schnitte wurden dann mit Anti-- --Synuclein-Antikörper, Anti-TH-Antikörper, Anti-LC3-Antikörper, Anti-p62-Antikörper und den entsprechenden fluoreszierenden sekundären Antikörpern über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach drei fünfminütigen Waschschritten in PBS wurden die Schnitte eine Stunde lang in biotinyliertem Sekundärantikörper inkubiert, gefolgt von 30 Minuten Avidin-Biotin-Komplex. Die Peroxidaseaktivität wurde mit 3.3-Diaminobenzidin sichtbar gemacht.

Die Erkennungvon Protein durch Western Blot

SNc-Protein wurde extrahiert (n {{0}}-Mäuse pro Gruppe), unter Verwendung von 12–15 % SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur blockiert und mit Antikörpern gegen TH, Synuclein, p62, Beclin 1, LC3, p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR und GAPDH über Nacht bei 4 °C inkubiert . Am nächsten Tag wurden die Membranen mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,1 Prozent Tween 20 enthielt, gespült und mit entsprechenden sekundären Antikörpern für 1,5 Stunden hybridisiert. Proteine ​​wurden unter Verwendung verstärkter Chemilumineszenz sichtbar gemacht, und immunreaktive Banden wurden mit Bildanalysesoftware (Gel Doc 1000- UV; Bio-Rad, Richmond, CA) analysiert, um die optische Dichte von -Synuclein und TH-Banden zu berechnen, die auf GADPH normalisiert sind.

Angaben zu den Antikörpern: Polyklonaler LC3-Antikörper vom Kaninchen: 1:1000. Polyklonaler Kaninchen-P62-Antikörper: 1:1000. Beclin 1 polyklonaler Antikörper: 1:1000. Maus-anti-TH-monoklonaler Antikörper: 1:1000. Polyklonaler Kaninchen-Synuclein-Antikörper: 1:1000.

Beobachtung der Ultrastruktur der Substantia Nigra durch Transmissionselektronenmikroskop

Mäuse (n=6 pro Gruppe) wurden mit 5 % Chloralhydrat eingeschläfert und durch den linken Ventrikel mit eiskaltem PBS perfundiert, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd und 1 % Glutaraldehyd in PBS. Die Gehirne wurden entfernt und in 2,5 Prozent Glutaraldehyd bei 4 Grad C für sechs Stunden nachfixiert. Das SNc wurde in Blöcke von etwa 1 mm 3 geschnitten und in PBS fixiert, das 2,5 Prozent Glutaraldehyd enthielt, und bei 4 Grad C für die weitere Verarbeitung aufbewahrt. Die Fragmente wurden in 1 % Osmiumtetroxid im gleichen Puffer nachfixiert, durch abgestufte Alkohole dehydriert und in Epon 812 (Shell Chemical Co., Houston, TX) eingebettet. Ultradünne (50 nm) Schnitte wurden mit einem Ultramikrotom geschnitten, mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und unter einem Transmissionselektronenmikroskop (Leica TCS SP2CLSM, School of Medicine Electron Microscopy Center, Fudan University) analysiert.

Statistische Analyse

Alle Messdaten in der vorliegenden Studie wurden in Form von Mittelwerten ± Standardfehlern ausgedrückt, und die statistische Analyse wurde von der Software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA) verarbeitet. P<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" one-way="" analysis="" of="" variance="" (one-way="" anova)="" was="" used="" to="" test="" the="" statistical="" differences,="" and="" the="" comparison="" between="" multiple="" groups="" was="" analyzed="" by="" tukey's="" multiple="" group="">

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