Teil Ⅱ: Überexpression von PKD1 verursacht polyzystische Nierenerkrankung

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Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Cote und Marie Trudel

Die zugrunde liegenden pathogenetischen Mechanismenautosomal dominant polyzystische Nierenerkrankung(ADPKD) müssen noch aufgeklärt werden. Zwar gibt es Hinweise darauf, dass PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Gen-Haploinsuffizienz und Verlust der Heterozygotie können bei Mäusen zur Zystenbildung führen, paradoxerweise hohe PKD1-Spiegel (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Expression wurde in den Nieren von ADPKD-Patienten (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung) nachgewiesen. Um festzustellen, ob PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Funktionsgewinn kann ein pathogenetischer Prozess sein, eine PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) bakterielles künstliches Chromosom PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-BAC) wurde durch homologe Rekombination modifiziert, um ausschließlich auf eine anhaltende PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Expression bevorzugt in der erwachsenen Niere. Es wurden mehrere transgene Linien generiert, die PKD1 spezifisch überexprimierten (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Transgen in den Nieren 2- um PKD1 15- zu falten (polyzystische Nierenerkrankung1) endogene Ebenen. Alle transgenen Mäuse entwickelten reproduzierbar tubuläre und glomeruläre Zysten und Niereninsuffizienz und starben an Nierenversagen. Dieses Modell zeigt, dass die Überexpression von Wildtyp-PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) allein reicht aus, um eine Zystogenese auszulösen, die der menschlichen ADPKD ähnelt (autosomal dominantpolyzystische Nierenerkrankung). Unsere Ergebnisse deckten auch eine auffallend erhöhte renale c-Myc-Expression bei Mäusen aller transgenen Linien auf, was darauf hindeutet, dass c-Myc ein kritischer in vivo nachgeschalteter Effektor der PKD1 ist (Polyzystische Nierenerkrankung 1) molekularer Weg. Diese Studie produzierte nicht nur eine unschätzbare und erste PKD（polyzystische Nierenerkrankung）Modell zur Bewertung der molekularen Pathogenese und Therapien, liefert aber auch Hinweise darauf, dass Funktionsgewinn ein pathogenetischer Mechanismus bei ADPKD sein könnte (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung).

Cistanche zur Behandlung von Nierenerkrankungen

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ERGEBNISSE

Produktion von PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Ac-BAC durch homologe Rekombination. Um festzustellen, ob PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Funktionsgewinn allein ausreicht, um den Phänotyp ADPKD (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung) zu erzeugen, isolierten wir zunächst einen genomischen Klon, der die gesamte PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Gen in einer BAC-Vektor-129/Sv-Bibliothek. Diese Bibliothek wurde durch PCR mit zwei Sätzen von Primern für die PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Gen, das Exon 1 am 5'-Ende und Exons 39 bis 40 zum 3'-Ende hin umspannte (Fig. 1). Ein positiver BAC-Klon für die PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Gen identifiziert, das den gesamten angrenzenden Tsc2-Genkörper umfasste. Das PKD1-Insert (polyzystische Nierenerkrankung 1) wurde im Detail charakterisiert, um sicherzustellen, dass die genomische Struktur mit der des endogenen PKD1 übereinstimmt (polyzystische Nierenerkrankung1) Gen des Mausstamms 129/Sv, von dem das Insert stammt, und des Inzuchtstamms C57BL/6J. Genomische Karten der PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Locus im BAC und in diesen Inzuchtstämmen durch Southern-Blot-Analyse, mit vier Restriktionsenzymverdauungen und sieben Sonden, die die gesamte PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Gen, schienen identisch zu sein, ohne Anzeichen von Umlagerungen (Fig. 1). Dieses BAC enthielt ein -121- kb-Insert, einschließlich ~37 kb stromaufwärts und -39 kb einer stromabwärts gelegenen Sequenz der PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung1) Gen, bestimmt durch Elektrophorese und Sequenzierung.

FEIGE. 2.Produktion von SBPkdlrAc-Konstrukten und transgenen Mäusen. (a) Aufeinanderfolgende homologe Rekombinationsereignisse wurden am murinen Pkdl-BAC durchgeführt, um zwei Modifikationen einzuführen: die regulatorischen SB-Elemente, die unmittelbar stromaufwärts des Pkdl-Initiationscodons eingefügt wurden, und eine stille Punktmutation von EcoRI (RI *), die in Exon (ex) eingeführt wurde. 10. Der BAC-Rekombinationsvektor enthält einen R6Ky-Replikationsursprung, ein Ampicillin-resistentes Gen, ein SacB-Gen, ein RecA-Gen und eine einzigartige Smal-Klonierungsstelle, in der die "SB"-regulatorischen Elemente (oder die stille Punktmutation von Exon 10) kloniert wurden mit flankierenden Pkd1-Genarmen. Der BAC-Rekombinationsvektor wurde in E. coli (DH10B)-Zellen, die den Pkdl-BAC-Wildtyp enthielten, elektroporiert, und nach der Selektion trat ein erstes homologes Rekombinationsereignis über einen der zwei Pkd1-Arme auf, um BAC-Cointegrate zu produzieren. Der Rekombinationsvektor und duplizierte Pkdl-Regionen der BAC-Cointegrate wurden in einem zweiten Selektionsschritt eliminiert. Aufgelöste Pkdl-BACs können entweder zum Wildtyp zurückkehren oder die beabsichtigte Modifikation enthalten. Anschließend kann eine homologe Rekombination in den neu modifizierten BAC eingeführt werden. (b) (ienomc DNA von SBPkd l-etransgenic mxce wurde durch Southern Blot analysiert. AVicToiD1ecLon von linearisierten Fragmenten verursachte die Insertion des Transgens in einem Kopf-an-Kopf-Kopf -an-Schwanz- und/oder Schwanz-an-Schwanz-Orientierung. Das 5'-Ende wurde durch Verdau genomischer DNA mit HindIII analysiert und mit der spezifischen transgenen SB-Sonde (linkes Feld) hybridisiert. Alle drei transgenen Mauslinien erzeugten die erwarteten 10 .9- kb-Bande für die Kopf-an-Schwanz-Insertion; die zusätzliche Bande, die in Zeile 39 beobachtet wird, stellt höchstwahrscheinlich ein Verbindungsfragment zwischen SB und dem Mausgenom dar. Die interne Integrität des Transgens wurde durch mehrere Restriktionsenzymverdauungen überwacht, und ein repräsentativer Blot genomischer DNA, die mit EcoRI verdaut und mit der Pkdl-Sonde (Exon 7-15) hybridisiert wurde, ist gezeigt (mittleres Feld).

Dieses SBPKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-BAC-Klon wurde durch zwei aufeinanderfolgende homologe Rekombinationsereignisse in E. coli modifiziert. Das PKD1-Gen (polyzystische Nierenerkrankung 1) wurde in Exon 10 markiert, indem ein Nukleotid (G zu A) ausgetauscht wurde, um eine neue EcoRI-Stelle an Position 2355 auf der cDNA-Karte zu erzeugen. Diese stille Punktmutation wurde erzeugt, um die PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Gen und Transkript des BAC von dem endogenen Ursprungs. Außerdem haben wir die 5'regulatorischen Elemente der PKD1 ersetzt (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-BAC-Gen, indem die zuvor identifizierten "SB"-Nierenepithel-spezifischen Elemente aus dem SBM- (verbunden mit c-Myc) oder SBF-verbunden mit c-fos)-Konstrukt-Transgen ausgenutzt werden, um die Expression auf die Nieren zu beschränken (36, 38) (Abb. 2a).

Dieses neue SBPkdlrAG-BAC wurde mit NotL, einer einzigartigen Stelle unmittelbar stromaufwärts der SB-Elemente, und ClaI innerhalb des Tsc2-Genkörpers verdaut, wodurch die regulatorischen Tsc2-Elemente und die 5'-Hälfte des Genkörpers gekürzt wurden, um das Fehlen von T'sc2 sicherzustellen exogene Expression in allen Geweben und zur Entfernung der prokaryotischen BAC-Vektorsequenzen (Fig. 1 und 2). Dieses 70- kb NotI-ClaI linearisierte Fragment wurde isoliert, gereinigt. und für die Oozyten-Mikroinjektion quantifiziert (36).

CISTANCHE VORTEIL: BEHANDLUNG VON NIERENERKRANKUNGEN

Herstellung und Analyse von transgenen SBPkdl-ac-Mäusen. Vier transgene Gründer, die mehrere Kopien des SBPkdlrAc-Transgens trugen, entwickelten konsequent PKD. Von den vier SBPKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)RAC-Gründermäuse bestimmt durch Southern-Analyse, drei SBPKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)TAG-transgene Linien wurden mit zwei bis neun Kopien des Transgens etabliert (Abb. 2b). Die Charakterisierung der Transgenintegrität in diesen Linien wurde mit 5'-, internen und 3'-Sonden überwacht, wie durch repräsentative Beispiele in Fig. 2b gezeigt. Transgene Linien zeigten mit der 5'"SB"-Sonde eine Bande bei 10,9 kb, die mit dem SBPkdlrAc übereinstimmt Transgen wurde in einer Kopf-an-Schwanz-Orientierung integriert und zeigte mit der 3'-Sonde eine 7,1--kb-Bande (Fig. 2b). Darüber hinaus detektierte die interne Sonde die 9,4--kb-Bande der endogenen PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1) sowie die 6,9--kb- und 2,5--kb-Banden des Transgens aufgrund der EcoRI-Insertionsstelle in Exon 10 (Fig. 2b). Diese Mäuse enthielten vollständige Kopien des Transgens, basierend auf der Analyse der genomischen überlappenden Struktur.

PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Funktionsgewinn in erwachsenen transgenen SBPkdl-Ac-Mäusen. Expression des SBPkdl-AG. Transgen und PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Gen wurde in verschiedenen Organen untersucht. Die Quantifizierung der Transkriptspiegel des Transgens und/oder des endogenen Gens wurde durch Northern-Blot-Analyse durchgeführt (Fig. 3a). Wie erwartet waren die transgenen und endogenen Gentranskripte von ähnlicher Länge (14,2 kb). Basierend auf der Kontroll-GAPDH-Expression wiesen die Nieren aller SBPkd 1 A-Mauslinien im Vergleich zu normaler PKD1 eine konsistent erhöhte Transkriptexpression auf (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Spiegel in den Nieren von Erwachsenen (n=3) ähnlichen Alters. Renale transgene und endogene Expression für die verschiedenen transgenen Linien zeigten einen Bereich von 2-- bis 15--fach über der renalen endogenen PKD1-Kontrolle(polyzystische Nierenerkrankung 1)(Abb. 3a). Insbesondere die transgene Linie 39 (n=4) zeigte höhere PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Ebenen als die Zeilen 3 (n=3) und 41 (n=4). Außerdem ist PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)Expressionsniveaus, die durch Northern-Blot-Analyse gemessen wurden, korrelierten mit denen, die durch Echtzeit-PCR unter Verwendung von Primern in Exons 1 und 2 erhalten wurden (Abb. 3b).

ABB. 3.Renale Expressionsanalyse von SBPkdlrA-Mäusen. (a) Expressionsanalyse von Pkd1-endogenen (endo) und SBPkdlrA-Transgen (Tg)-Transkripten in Nieren von drei transgenen Linien durch Northern-Blotting. Zwei Proben von jeder transgenen Linie, 3, 39 und 41, wurden mit dem endogenen renalen Pkdl-Transkript von normalen Kontrollmäusen gleichen Alters mit dem gleichen genetischen Hintergrund verglichen (C5BI 6I × CBA/DE, Nieren-RNA-Proben wurden von transgenen Mäusen vor erhalten Nierenerkrankung im Endstadium. Transkripte von endo und Tg sind beide -14,2 kb lang. Eine systematische Überexpression der Transkripte wurde in den Nieren aller transgenen Mäuse im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrollen beobachtet. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet Die Quantifizierung der renalen Expression in diesen transgenen Mäusen reichte vom 2-- bis 15--fachen relativ zu den endogenen Pkd1-Spiegeln von Kontrollmäusen, die willkürlich auf 1 gesetzt wurden verwendet, um Gesamt-Pkdl zu amplifizieren, einschließlich endogen und transgen (Exon 1 und Exon 2) und nur Pkd1-Transgen (B. Exon 2) durch Echtzeit-PCR und semiquantitative RT-PCR, RT-PCR-Analyse der SBPkdlAc-Transgenexpression wurde in der Niere quantifiziert und zusätzlich Nierengewebe. Eine repräsentative halbquantitative Bewertung des SBPkdl.Ac-Transgens (Tg) wird gezeigt, die eine Nierengewebeprobe (K) von einer Maus aller drei transgenen Linien (3, 39 und 41) und von extrarenalen Geweben umfasst. H, Herz; Lu, Lunge; B. Gehirn; Li, Leber; und S. Milz aus einer Maus der Linie 39. Die Expression des Transgens ist in den Nieren aller transgenen Mäuse leicht nachweisbar, während sie in extrarenalen Geweben gering bis nicht nachweisbar ist. Die Expression vom SBPkd1rAc-Transgen erzeugte ein spezifisches 307--bp-Amplikon, während die interne S16-Kontrolle ein 102--bp-Amplikon erzeugte. M,100-bp-Marker; H, O, Negativkontrolle für die PCR-Amplifikation. (c)Echtzeit-PCR-Expressionsanalyse des SBPkdlr. Das Transgen wurde von mehreren unabhängigen Mäusen bestimmt. Das SBPkdl.Ac-Transgen aus den drei transgenen Mauslinien 3 (n=5), 39 (n =7) und 41 (n=5) zeigte, dass die Linien 39 und 41 die höchsten Werte aufwiesen Nierenexpressionsniveaus. Die Expression des SBPkdlrAc-Transgens in extrarenalen Geweben von Mäusen (n=3) der drei transgenen Linien wurde durch Echtzeit-PCR bewertet. Im Vergleich zu den Nieren jeder transgenen Linie (100 Prozent) zeigte die Analyse extrarenaler Gewebe, dass die Transgen-Expressionsniveaus in Gehirn, Herz, Leber und Bauchspeicheldrüse durchgehend um das 10-- bis 1,000--Fache niedriger waren , Milz und Lunge. (d) Expression des endogenen c-mc-Gens in den SBPkdl.Ac-Nieren durch semiquantitative RT-PCR. Eine schematische Darstellung zeigt die zur Amplifikation von c-Myc verwendeten Primer. Wie erwartet ist die c-Myc-Expression in adulten nicht-transgenen Nieren (Kontrollen) minimal Positive Kontrolle. Das Amplikon von c-Myc war 250 bp; das Amplikon von S16, einer internen Kontrolle, war 102 bp.M, 100- bp-Marker.

Die Quantifizierung der transgenen Expressionsniveaus wurde speziell durch Real-Time-PCR und semiquantitative RT-PCR in den drei transgenen Linien im Erwachsenenalter unter Verwendung von Primern in der 5'-untranslatierten Region (B, -Globin-Promotor) und in Exon 2 von PKD1 durchgeführt (Polyzystische Nierenerkrankung 1)(Abb.3b). Das SBPKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Die RAC-Expression in transgenen Mäusen wurde mit dem Genprodukt des ribosomalen S16-Proteins als internem Standard verglichen. Die für die semiquantitative RT-PCR-Amplifikation verwendeten Bedingungen lagen im linearen Bereich. Die Transgenexpression durch Echtzeit-PCR und semiquantitative RT-PCR zeigte konsistent und spezifisch die höchste Expression in der Niere aller transgenen Linien im Vergleich zu anderen Organen (Abb. 3b und c). Die Nierenexpressionsniveaus für eine einzelne Probe waren mit jeder der verwendeten Nachweistechniken reproduzierbar. Die höchsten Werte von PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) transgene renale Expression wurde für die Linien 39 und 41 gemessen. Um zu überwachen, ob die erhöhte PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1)-Expression von dem transgenen oder dem endogenen Gen herrührte, wurde dieselbe Gruppe von Mäusen aus den drei transgenen Linien auf renale PKD1 ( polyzystische Nierenerkrankung 1) Transgenexpression und für renale PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1) Gesamtexpression (transgen und endogen) durch Echtzeit-PCR. Interessant. Linien 39 und 41 relativ zu Linie 3 zeigten, dass die erhöhte PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Die renale Expression des Transgens war ähnlich oder höher als die der gesamten renalen Expression von PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1), was darauf hindeutet, dass das Transgen spezifisch für diese induzierte Expression verantwortlich ist. In verschiedenen Organen (einschließlich Herz, Lunge, Gehirn, Leber, Bauchspeicheldrüse und Milz) ist das SBPKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) RAK; Transgen zeigte eine sehr schwache Expression, die gelegentlich in Milz und Lunge nachgewiesen wurde, mit geringer bis nicht nachweisbarer Expression in anderen Organen (Abb. 3b). Die Quantifizierung durch Echtzeit-PCR zeigte ein 10-- bis 1,000--fach niedrigeres Niveau der Transgenexpression in extrarenalen Geweben im Vergleich zur Nierenexpression (Abb. 3c). Die "SB"-regulatorischen Elemente des SBPkdlrAc-Transgens verliehen eine bevorzugte renale Expression; diese besondere Organverteilung wurde auch bestimmt, wenn sie in Transgenen verwendet wurde, die mit c-Myc (SBM) und c-fos(SBF) verknüpft waren (36, 38). c-Mye, ein nachgeschalteter Effektor von PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Signalwege in SBPkdlrAc: Mäusen. Um einen Einblick in den intrazellulären pathogenetischen Mechanismus von transgenen SBPkdlrAc-Mäusen zu erhalten, versuchten wir als nächstes, das c-Myc-Nierenexpressionsniveau zu überwachen, basierend auf unserer früheren Beobachtung der c-Myc-Deregulierung in menschlichen ADPKD-Nieren (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung) (22). Die Analyse der Nieren wurde von allen drei transgenen Linien 3(n=4), 39(n=7) und 41 (n=4) ​​sowie Kontrollen (n {{9 }}). Wie in 3d gezeigt, gibt es eine beträchtliche Expression von endogenem c-Mye, das in SBPkdlrAa-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen ähnlichen Alters induziert wird. Interessanterweise erreichte das Niveau der c-Myc-Expression in einigen SBPkdlrAG-Nieren, insbesondere Linie 39, Niveaus, die mit denen vergleichbar waren, die im transgenen PKD-SBM-Mausmodell beobachtet wurden, das durch renale c-Myc-Expression erzeugt wurde.

Nierenanomalien bei SBPKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 für jede Linie) entwickelten mehrere tubuläre (T) und glomeruläre Zysten (G) (Abb. 4d, f und g). Zysten wurden in Tubuli aus der kortikalen und medullären Region sowie Sammeltubuli aus der Papille beobachtet (Abb. 4d und e). Transgene Mäuse zeigten eine tubuläre epitheliale Hyperplasie (Pfeilspitze), die sowohl zystische als auch nicht-zystische Tubuli umfasste, und häufige Hypertrophie ( 4g und h). aber der Schweregrad variierte zwischen einzelnen Mäusen. Interstitielle Fibrose (F). perivaskuläre lymphatische Infiltrate und proteinhaltige Zylinder (P) wurden häufig beobachtet (Abb. 4d und e).

Abb. 4

Um die Lokalisationsstelle erhöhter PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Expression in den Nieren führten wir eine In-situ-Hybridisierung unter Verwendung der zuvor verwendeten Exon-36-45-Sonde durch (16). Das Hybridisierungssignal wurde spezifisch auf die Epithelzellen lokalisiert, die Zysten und hyperplastische Tubuli sowie glomeruläre Zysten auskleiden. Darüber hinaus wurde ein gewisses Signal über dem Epithel von nicht zystischen oder leicht erweiterten Tubuli gesehen, was wahrscheinlich Tubuli identifiziert, die prädestiniert sind, zukünftige zystische Veränderungen zu erfahren (Abb. 4i und j). Eine histologische Analyse der Nieren wurde auch an transgenen Mäusen bei der Geburt (n=8), postnatalen Tag 10 (P10) (n=3), P20 (n=5), P35 (n{ {10}}) und P45(n= 3) im Vergleich zu negativen Wurfgeschwistern derselben Altersgruppe (n =2 bis 4). Interessanterweise zeigten alle neugeborenen transgenen Mäuse eine tubuläre und glomeruläre Dilatation relativ zu Kontroll-negative Wurfgeschwister (Fig. 4k und 1), was darauf hinweist, dass Nierenanomalien im Uterus initiiert wurden, wie bei SBM-Mäusen und bei ADPKD beobachtet (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung) Patienten. Die tubuläre und glomeruläre Dilatation nahmen mit fortschreitendem Alter an Größe und Anzahl zu. Bei P35 zeigten transgene Mäuse eine schwerere Hyperplasie und Anzeichen von Glomerulosklerose. Veränderte physiologische Nierenfunktionen bei SBPkdlrsc-Mäusen. Die physiologischen Nierenfunktionen aller transgenen Mäuse zeigten ähnliche Merkmale wie PKD, während die nicht-transgenen Wurfgeschwister die Krankheit nie entwickelten. Innerhalb weniger Monate nach der Geburt entwickelten die betroffenen Tiere eine chronische Niereninsuffizienz. Diese Tiere wurden auf Nierenfunktionsparameter durch Messung der Serum- und Urinspiegel überwacht. Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) und Kreatinin, Urinosmolalität, Urinprotein und Ionenausscheidung (Tabelle 1). Alle Mäuse aus den drei Linien zeigten im Vergleich zu den Kontrollen Konzentrationsstörungen, ein häufiger Befund bei ADPKD (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung). und zeigten folglich einen verringerten BUN im Urin. Kreatinin-, Protein- und Eisenkonzentrationen. Transgenes SBPKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)rAc.founders und Nachkommen (n=6) aus jeder Linie wurden qualitativ auf Proteinurie in Urinproben durch SDS-PAGE überwacht (Fig. 5). Mäuse, die älter als 2 Monate waren, zeigten eine nichtselektive Proteinurie, die mit zunehmendem Alter fortschritt. Außerdem waren die Serum-BUN- und Serum-Kreatininspiegel erhöht, was auf eine Niereninsuffizienz hinwies (Tabelle 2). Da chronische Niereninsuffizienz häufig zu Veränderungen der hämatologischen Parameter führt, wurden diese an SBPkdlAc-transgenen Mäusen im Alter von 3 bis 14 Monaten untersucht (Tabelle 2). Diese transgenen Mäuse waren anämisch, was durch die signifikant verringerte Anzahl roter Blutkörperchen belegt wurde, wobei Hämoglobin und Hämatokrit die Hälfte der normalen Werte erreichten. Andere Parameter der roten Blutkörperchen, wie der Prozentsatz an Retikulozyten, blieben wie erwartet unbeeinflusst, wenn sie durch einen Nierenschaden induziert wurden. Diese Tiere starben durchgängig im Alter von -5,9 ± 2,8 Monaten (n {{12} }) für die transgene Linie 39 und in späteren Altern, -14,6 ± 3,1 Monate (n= 20) und -11,7 ± 6,5 Monate (n=7) ,für die Zeilen 3 bzw. 41.

WIRKUNGEN VON CISTANCCHE: BEHANDLUNG VON NIERENERKRANKUNGEN

DISKUSSION

Hier berichten wir über die Isolierung und Charakterisierung einer murinen PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-BAC. Diese PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Gen wurde markiert und regulatorische Elemente wurden ersetzt, um die Expression durch zwei aufeinanderfolgende homologe Rekombinationsereignisse spezifisch auf die Nieren auszurichten. Transgene Mäuse, die mit diesem neuartigen SBPkdlrAG-Gen produziert wurden, zeigten eine 2-- bis 15--fache Erhöhung der PKD1-Expression (polyzystische Nierenerkrankung 1) und entwickelten reproduzierbar frühe morphologische Veränderungen der Niere, die für PKD typisch sind. Niereninsuffizienz ist im mittleren Alter offensichtlich, und Mäuse sterben vorzeitig an Nierenversagen. Unsere Ergebnisse weisen auch darauf hin, dass der für diesen Phänotyp verantwortliche PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1)-Überexpressionsmechanismus durch die Signalaktivierung von c-Myc in vivo vermittelt wird. Diese Studie zeigt, dass die murine PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1) Funktionszunahme in den Nieren ausreicht, um einen PKD-Nierenphänotyp zu erzeugen.

Da die murine PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Gen nicht dupliziert wird wie beim Menschen (27), haben wir direkt einen BAC-Klon identifiziert und isoliert, der die gesamte PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Gen. Vollständige Charakterisierung der 129/Sv-Mäuse-PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-BAC. Der indirekte Vergleich mit zwei anderen Inzucht-Mausstämmen bestätigte die Integrität des PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1)-Locus. Die PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-BACinsert enthielt -37 bis 39 kb stromaufwärts und stromabwärts gelegene Sequenzen des PKD1-Gens (polyzystische Nierenerkrankung 1). Unsere Analyse zeigte, dass die PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Gen in diesem BAC war ein echter muriner Wildtyp-Lokus, der für weitere Studien dienen könnte.

Obwohl es starke Hinweise darauf gibt, dass die Zystenbildung bei ADPKD (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung) kann aus dem Verlust der Heterozygotie nach somatischer Inaktivierung der normalen PKD1 resultieren (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Allel (3.21.32) gibt es auch Hinweise auf eine anhaltende oder sogar erhöhte Polycystin-1-Expression im zystischen tubulären Epithel (22.29). Die letztgenannte Beobachtung wirft die Frage auf, ob die Überexpression von PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1) per se eine hinreichende unmittelbare Ursache der Zystogenese ist. In transgenen Mäusen, die die humane PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1), TSC2. RAB26. NTHL1- und SLC9A3R2-Genen entwickelten nur eine Minderheit der Mäuse Zysten und keine hatte trotz 30 Kopien des Transgens eine nachweisbare Transgenexpression im Erwachsenenalter (31). In diesen transgenen Mäusen. Es war schwierig, eine klare Rolle für die Überexpression von PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1) bei der Zystogenese festzustellen. Unser Modell unterscheidet sich, da zwei bis neun Wildtyp-Kopien von PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1) allein, ohne zusammenhängende Gene, in transgene Mäuse integriert wurden. Da das PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1)-Gen essentielle Funktionen in verschiedenen Organen oder Geweben hat, wie für zahlreiche Mäuse mit Ablation des PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1)-Gens beschrieben, kommt es zu einer systemischen Überexpression von PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) könnte zu zusätzlichen Störeffekten führen. Folglich haben wir uns mit der Rolle von PKD1 befasst (Polyzystische Nierenerkrankung 1)Funktionsgewinn durch einen Ansatz, der PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1) spezifisch auf die Nieren abzielt. Durch homologe Rekombination haben wir zuerst die stromaufwärts gelegene regulatorische Region von PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1) durch die "SB" renalen eingeschränkten regulatorischen Elemente ersetzt, wodurch die verringerte Genexpression verhindert wird, die normalerweise für PKD1 beobachtet wird (Polyzystische Nierenerkrankung 1) im Erwachsenenalter sowie mögliche sekundäre Rückkopplungsschleifenregulation (36,38). Zweitens haben wir die murine PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Transgen (Pkdlr) mit einer stillen Punktmutation in Exon 10, in das jedoch kein Epitop-Tag eingefügt wurde, um sicherzustellen, dass ein voll funktionsfähiges "Wildtyp"-Protein mit konservierter Struktur und Integrität produziert wird. Aus diesem modifizierten BAC wurde ein SBPkdlrAG-Fragment vom Tsc2-Gen und BAC-Vektor entfernt, um eine Störung durch das Tsc2-Gen zu verhindern, das auch einen zystischen Phänotyp induzieren kann (8.20.28). sowie um die hemmende Wirkung prokaryotischer Sequenzen zu vermeiden(5).

Vier verschiedene SBPkdlrAc-transgene Gründermäuse und drei unabhängige Linien wurden mit spezifischer renaler PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-erweiterter Ausdruck. Besonders auffällig ist die vollständige Penetranz des Phänotyps bei diesen transgenen Mäusen. Das SBPKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) rAc-Gründer- und -Mauslinien teilten mehrere physiopathologische Merkmale mit ADPKD (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung). Dazu gehören die Entwicklung von Zysten in Cortex, Medulla und Glomeruli zusammen mit epithelialer Hyperplasie, interstitieller Fibrose und fokaler interstitieller Entzündung.

Da der PKD-Phänotyp konsistent in allen verschiedenen transgenen Gründermäusen beobachtet wurde und die Transgen-Integration in das Mausgenom ein zufälliges Phänomen ist, kann der Phänotyp nicht aus einem chromosomalen Positionseffekt resultieren, sondern nur aus einer erhöhten PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)Ausdruck. Tatsächlich wurde gezeigt, dass die Expression des Transgens PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1) in allen Linien auf die Nieren beschränkt ist. wie zuvor für andere Transgene beobachtet, die durch die "SB"-Elemente reguliert werden (36, 38). Darüber hinaus wurde diese erhöhte Expression von PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1) durch das Transgen verursacht und nicht durch eine indirekte endogene PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Aktivierung. Daher liefern unsere Ergebnisse einen klaren Beweis dafür, dass der Funktionsgewinn einer funktionellen PKD1 vom Wildtyp (polyzystische Nierenerkrankung 1) mehrere Nierenzysten hervorrufen kann. Wichtig ist, dass diese SBPKD1-Praktiken (polyzystische Nierenerkrankung 1) das erste Mausmodell darstellen, das durch die alleinige Überexpression des Mausorthologs der menschlichen PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Gen.

Die SBPkdl-Ac-Mäuse zeigen, dass PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)Überexpression ist ein primärer pathogenetischer Mechanismus der renalen Zystogenese. Wichtig ist, dass die höchsten Transgen-Expressionsniveaus in den Nieren mit dem Fortschreiten und der Schwere des Phänotyps zu korrelieren schienen. Wir fanden auch, dass eine Überexpression von PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1) bei der Entwicklung von SBPKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1)-Ac-Phänotyp signalisiert wahrscheinlich die Aktivierung von c-Myc in vivo. Es ist denkbar, dass diese Aktivierung sogar direkt durch den C-terminalen Schwanz von Polycystin-1 erfolgen könnte, der einer proteolytischen Spaltung und Kerntranslokation unterzogen wird (7). wäre sehr konsistent, um c-Myc als einen wichtigen nachgeschalteten Effektor von PKD1 zu unterstützen (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Signalwege Dieses Ergebnis korrelierte auch mit unseren früheren Befunden einer erhöhten c-Myc-Expression in den Nieren aller analysierten humanen ADPKD (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung) (22). Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass c-Mye ein Hauptmediator von PKD1 ist (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Zystogenese.

Unsere Ergebnisse aus dem PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Gain-of-Function-Modell, zusammen mit muriner PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1), Haploinsuffizienz und Funktionsverlust, weisen darauf hin, dass jede PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Dysregulation könnte zu Zystogenese führen (2.19.23-26.31.40). Schwere PKD1 (polyzystische Nierenerkrankung 1) Ungleichgewicht bei Mäusen, induziert durch PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Ablation oder transgene Überexpression verursachten einen frühen Beginn und ein rasches Fortschreiten von Nierenzysten und betrafen einen hohen Anteil an Tubuli. Im Gegensatz dazu ist eine mildere PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Ungleichgewicht wie Haploinsuffizienz führte zu einem langsameren Fortschreiten der PKD mit mehr fokalen Zysten. Die scheinbar paradoxe Entwicklung eines ähnlichen Phänotyps durch entgegengesetzte Polycystin-1-Dysregulation könnte durch das gemeinsame Ergebnis erklärt werden, nämlich ein relatives Ungleichgewicht der Proteinkonzentration, das die Bildung oder Funktion eines aktiven Polycystin-Multiproteinkomplexes verändern könnte. Zusammengenommen argumentieren unsere Ergebnisse und die anderer Forscher, dass der Mechanismus der Zystenbildung bei ADPKD (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung) ist wahrscheinlich auf drei pathogenetische Mechanismen zurückzuführen: Funktionsgewinn, Funktionsverlust und Gendosiseffekte.

Das neue SBPkdlrAc; Mäuse stellen ein leistungsfähiges Modell der renalen Zystogenese dar, das wichtige Einblicke in die Pathophysiologie von PKD, PKD1 (Polyzystische Nierenerkrankung 1) Signaltransduktionswege und Interaktionspartner. Die Untersuchung dieses Modells kann auch zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Wiederherstellung des normalen Proteingleichgewichts innerhalb der PKD1 führen (Polyzystische Nierenerkrankung 1) multimerer Komplex.

Cistanche behandelt Nierenerkrankungen und verbessert die Nierenfunktion

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