Teil Ⅰ Smad3-Mangel verbessert die inselbasierte Therapie bei Diabetes und diabetischer Nierenverletzung durch Förderung der Zellproliferation über den E2F3--abhängigen Mechanismus

Abstrakt

1. Begründung

Eine schlechte Zellproliferation ist einer der nachteiligen Faktoren, die eine Inselzellersatztherapie bei Patienten mit Diabetes behindern. Smad3 ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor der TGF-Signalisierung und fördert nachweislich Diabetes, indem es die Zellproliferation hemmt. Daher nehmen wir an, dass Smad3--defiziente Inseln eine neuartige Zellersatztherapie für Diabetes darstellen könnten.

2. Methoden

Wir untersuchten diese Hypothese an Streptozocin-induzierten diabetischen Mäusen vom Typ -1 und db/db-Mäusen mit Diabetes vom Typ -2, indem wir Smad3-Knockout- (KO) bzw. Wildtyp- (WT) Inseln unter die Nierenkapsel transplantierten. Es wurden die Auswirkungen einer Smad3KO-Therapie im Vergleich zur WT-Inselersatztherapie auf Diabetes und diabetische Nierenschäden untersucht. Darüber hinaus wurde RNA-seq angewendet, um das nachgeschaltete Zielgen zu identifizieren, das der Smad3-regulierten Zellproliferation in Smad3KO-db/db- und Smad3WT-db/db-Mausinseln zugrunde liegt.

3. Ergebnisse

Im Vergleich zur Smad3WT-Inseltherapie führte die Behandlung mit Smad3KO-Inseln zu einer viel besseren therapeutischen Wirkung sowohl bei Typ--1- als auch bei Typ--2-Diabetes, indem sie die Serumspiegel von Blutzucker und HbA1c deutlich senkte und durch Prävention vor diabetischen Nierenschäden schützte ein Anstieg des Serumkreatinins und die Entwicklung von Proteinurie, mesangialer Matrixausdehnung und Fibrose. Diese waren mit einem signifikanten Anstieg der Proliferation transplantierter Zellen und des Blutinsulinspiegels verbunden, was zu einer verbesserten Glukoseintoleranz führte. Mechanistisch gesehen ergab RNA-seq, dass im Vergleich zu Smad3WT-db/db-Mausinseln die Deletion von Smad3 aus db/db-Mausinseln E2F3, einen zentralen Regulator des G1/S-Eintritts in den Zellzyklus, deutlich hochregulierte. Weitere Studien ergaben, dass Smad3 an den Promotor von E2F3 binden und so die Zellproliferation über einen E2F3--abhängigen Mechanismus hemmen kann, da die Stummschaltung von E2F3 den proliferativen Effekt auf Smad3KO-Zellen aufhebt.

4. Fazit

Eine Smad3--defiziente Insel-Ersatztherapie kann sowohl Typ--1- als auch Typ--2-Diabetes deutlich verbessern und vor diabetischer Nierenschädigung schützen, die durch einen neuartigen Mechanismus der E2F3--Abhängigkeit vermittelt wird Zellvermehrung.

Schlüsselwörter

Smad3, Inseltransplantation, Diabetes, E2F3, Zellzyklus.

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Einführung

Typ-1 und 2 Diabetes mellitus (T1DM und T2DM). Die Zell- oder Inseltransplantation ist eine attraktive Therapie und wurde erfolgreich bei Patienten mit T1DM eingesetzt. Die für die Transplantation verwendeten Inseln oder Zellen stammen normalerweise vom Leichenspender oder von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) [1, 2]. Mehr als 1500 Fälle klinischer Inseltransplantationen wurden bei Patienten mit T1DM gemäß dem etablierten Edmonton-Protokoll durchgeführt [1]. Obwohl etwa 50 Prozent der Patienten nach der Transplantation fünf Jahre lang ihre Insulinunabhängigkeit aufrechterhalten, ist das Scheitern der Transplantation klinisch ein häufiges Problem. Einer der Faktoren, die eine Inseltransplantation behindern, ist die extrem niedrige Proliferationsrate der transplantierten Inselzellen [3]. Darüber hinaus können gefährliche Reize aus der Transplantat-Mikroumgebung wie Entzündungen, Abstoßung von Immun-Allotransplantaten und metabolischer Stress dazu führen, dass transplantierte Zellen Apoptose und Nekrose erleiden, was zu einem fortschreitenden Transplantatverlust führt [1]. Daher ist die Verbesserung der Proliferation transplantierter Zellen von entscheidender Bedeutung für den Erfolg einer auf Inseltransplantationen basierenden Behandlung von Diabetes.

Die Signalübertragung des transformierenden Wachstumsfaktors Beta (TGF-) spielt in vielen biologischen Prozessen eine pleiotrope Rolle. Die Signaltransduktion wird durch die Bindung des TGF-Liganden an seinen Typ-2-Rezeptor TGFBR2 eingeleitet. Letzterer rekrutiert und aktiviert den Typ-1-Rezeptor TGFBR1 durch Phosphorylierung. Aktiviertes TGFBR1 phosphoryliert zusätzlich die rezeptorregulierten Smad-Proteine ​​(R-Smads), Smad2 und Smad3. Die R-Smads bilden mit Smad4 einen Komplex, der in den Zellkern transloziert, um Zielgene transkriptionell zu regulieren [4, 5]. Es wird berichtet, dass die Pankreasinsel eine universell aktivierte TGF-Signalisierung aufrechterhält, was sich in einem relativ hohen Anteil an phosphoryliertem Smad2/3 unter physiologischen Bedingungen zeigt. Als Reaktion auf den Insulinbedarf nimmt jedoch die TGF-Signalaktivität ab, was mit einer erhöhten Zellproliferation einhergeht [6]. Darüber hinaus fördert die pharmakologische Hemmung des TGF-Signals die Zellproliferation in vitro und in vivo [7, 8]. Noch wichtiger ist, dass die Deletion von Smad3 zu einer robusteren Zellproliferation führt als die Deletion von Smad2 bei Mäusen mit teilweiser Pankreatektomie, was darauf hindeutet, dass Smad3, aber nicht Smad2, der primäre Effektor stromabwärts des TGF-Signals zur Regulierung der Zellproliferation ist [6]. Spätere Studien zeigen, dass Smad3 die Zellproliferation unterdrückt, indem es die Expression von Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitoren (CDKIs) induziert, einschließlich p16, p21 und p57 [7, 8].

Unsere jüngste Arbeit ergab außerdem, dass die Deletion von Smad3 in db/db-Mäusen (Smad3KO-db/db) das Auftreten von manifestem Diabetes ohne Fettleibigkeit, Hyperglykämie, Insulinresistenz und Glukoseintoleranz verhindert. Interessanterweise zeigen Smad3KO-db/db-Mäuse eine Inselhyperplasie mit deutlich erhöhter Zellproliferation und anhaltender Hyperinsulinämie [9]. Dies impliziert, dass Smad3 bei Diabetes pathogen ist und dass die gezielte Behandlung von Smad3 in Zellen eine neuartige Zell- oder Inselersatztherapie für Diabetes darstellen könnte. Dies wurde in der vorliegenden Studie mithilfe einer Smad3-Knockout-Inseltransplantation (Smad3KO) bei durch Streptozocin (STZ) induzierten Typ--1-diabetischen Mäusen und bei Typ--2-diabetischen db/db-Mäusen untersucht.

Cistanche-Ergänzungsmittel

Ergebnisse

1. Die Transplantation von Smad3KO-Inseln führte zu einer besseren therapeutischen Wirkung bei STZ-induziertem Typ--1-Diabetes

Um die therapeutische Wirksamkeit von Smad3KO- und Smad3WT-Inseln bei Diabetes zu vergleichen, führten wir zunächst eine syngene Inseltransplantation unter der Nierenkapsel von STZ-induzierten diabetischen Mäusen durch, bei denen Hyperglykämie durch Zellmangel verursacht wird. Diabetischen Mäusen wurden am Tag 7 nach der STZ-Injektion drei Dosen Inseln (50, 100 und 200 Inseln pro Maus) transplantiert, die frisch aus Smad3WT- oder Smad3KO-Mäusen isoliert wurden. Sowohl der zufällige Blutzuckerspiegel (RBG) als auch der Nüchternblutzuckerspiegel (FBG) wurden 16 Wochen lang wöchentlich überwacht. Die Transplantationsdosen wurden auf der Grundlage früherer Erkenntnisse ausgewählt, dass die Transplantation von 300 Inseln ausreicht, um die Euglykämie bei Mäusen mit Zellmangel schnell wiederherzustellen [10]. Wie in den Abbildungen 1A bis D dargestellt, entwickelten die diabetischen Mäuse mit Scheinoperation über 16 Wochen eine anhaltende Hyperglykämie. Eine Transplantation mit einer niedrigen Dosis (50 Inseln) von Smad3KO- oder WT-Inseln konnte weder den RBG- noch den FBG-Spiegel senken. Allerdings erholten sich diabetische Mäuse, die 100 Smad3KO-Inseln, aber nicht die gleiche Dosis Smad3WT-Inseln erhielten, allmählich wieder im normalen RBG und FBG, ähnlich wie bei denen, die 200 Smad3KO- oder WT-Inseln erhielten. Wir fanden auch heraus, dass die blutzuckersenkende Wirkung ausschließlich den transplantierten Inseln zugeschrieben wird, da die Hyperglykämie sofort wieder auftrat, sobald die Insel-tragende Niere ab der 16. Woche entfernt wurde (Pfeil, Abbildung 1A).

Bei den scheinoperierten diabetischen Mäusen kam es auch zu einer beeinträchtigten Glukosetoleranz, die durch die Transplantation der hohen Dosis (200) von Smad3KO- oder WT-Inseln und 100 Smad3KO-Inseln deutlich gelindert wurde, nicht jedoch durch die niedrige Dosis von 50 Smad3KO- oder WT-Inseln und 100 Smad3WT-Inseln (Abbildung 1E und G). Wie erwartet entwickelten STZ-induzierte diabetische Mäuse keine Insulinresistenz.

Im Gegensatz dazu wurde bei hyperglykämischen Mäusen nach einer Scheinoperation oder einer ineffektiven Therapie mit 50 Smad3WT- oder KO-Inseln und 100 Smad3WT-Inseln eine verlängerte Reaktion auf Insulin beobachtet (Abbildung 1F und H). Im Einklang mit der wiederhergestellten Euglykämie und verbesserten Glukoseintoleranz zeigten diabetische Mäuse, denen 200 Smad3KO- oder WT-Inseln und 100 Smad3KO-Inseln, jedoch nicht 50 Smad3KO- oder WT-Inseln und 100 Smad3WT-Inseln verabreicht wurden, einen verringerten HbA1c-Spiegel im Blut, begleitet von einem erhöhten Insulinspiegel (Abbildung 1 I). und J). Darüber hinaus verursachte STZ-induzierter Diabetes eine Wachstumsverzögerung, die bei Mäusen, denen 200 Smad3KO- oder WT-Inseln und 100 Smad3KO-Inseln transplantiert worden waren, teilweise behoben wurde (Abbildung S1). Darüber hinaus entwickelten STZ-induzierte diabetische Mäuse nach 16 Wochen auch eine diabetische Nephropathie, was sich in mesangialer Ausdehnung, interstitieller Fibrose, Proteinurie und erhöhtem Serumkreatinin zeigte (Abbildung 2). Interessanterweise führte die Behandlung mit 100 Smad3KO-Inseln, jedoch nicht mit 100 Smad3WT-Inseln, zu einem Schutz vor der Entwicklung einer diabetischen Nierenerkrankung, obwohl dies auch bei diabetischen Mäusen zu beobachten war, die mit der hohen Dosis von 200 Smad3KO- oder WT-Inseln behandelt wurden (Abbildung 2). Diese Ergebnisse zeigen eine bessere therapeutische Wirksamkeit von Smad3KO-Inseln bei STZ-induziertem Diabetes und deuten auf eine etwa 50-prozentige Reduzierung der Inseln hin, die erforderlich sind, um eine kompetente Blutzuckerkontrolle und Schutz vor diabetischer Nierenschädigung durch die Verwendung einer Smad3-defizienten Inselersatztherapie zu erreichen Diabetes.

2. Die Transplantation von Smad3KO-Inseln führte bei db/db-Mäusen zu einer besseren therapeutischen Wirkung auf Typ--2-Diabetes

Es wurde berichtet, dass eine Inseltransplantation T2DM in einem Mausmodell verbessert, das mit einer fettreichen Diät ernährt und mit einer niedrigen STZ-Dosis belastet wurde [11]. Als nächstes untersuchten wir, ob die Transplantation von Smad3KO-Inseln auch eine bessere therapeutische Wirkung auf T2DM hat, indem wir db/db-Mäuse mit 250 Smad3KO- oder WT-Inseln im prädiabetischen Alter von Woche 4 bis Woche 12 behandelten. Wir fanden heraus, dass die Transplantation entweder mit Smad3KO oder WT erfolgte Inseln hatten keinen Einfluss auf das Wachstum der Empfänger-db/db-Mäuse (Abbildung S2). Obwohl db/db-Mäuse, die eine Smad3WT-Inseltransplantation erhielten, im Vergleich zu den scheinoperierten db/db-Mäusen eine tendenzielle Abnahme von RBG und FBG zeigten, zeigten db/db-Mäuse, denen die äquivalente Dosis von Smad3KO-Inseln transplantiert worden war, eine signifikante Abnahme von RBG und FBG (Abbildung). 3A und B). Die bei db/db-Mäusen entwickelte Glukoseintoleranz wurde durch die Smad3KO-Inseltransplantation signifikant verbessert, nicht jedoch durch die Smad3WT-Inseltransplantation, obwohl die Insulinresistenz nicht verändert wurde (Abbildung 3C-F). Im Vergleich zur Smad3WT-Inseltransplantation oder Scheinoperation zeigten db/db-Mäuse, die mit der Smad3KO-Inseltransplantation behandelt wurden, konsistent auch einen signifikanten Rückgang der HbA1c-Spiegel im Blut, der mit einem deutlichen Anstieg der Blutinsulinspiegel einherging (Abbildung 3G und H). Darüber hinaus schwächte die Behandlung mit 250 Smad3KO-Inseln die glomeruläre Mesangialexpansion deutlich ab (Abbildung 4). Da jedoch bei db/db-Mäusen im Alter von 12 Wochen keine signifikanten Veränderungen des Serumkreatinins, der Proteinurie und der Nierenfibrose festgestellt wurden, wurden bei db/db-Mäusen, die mit Smad3KO- oder WT-Inseln behandelt wurden, keine offensichtlichen Veränderungen dieser Parameter festgestellt (Abbildung). 4). Zusammenfassend deuten diese Daten erneut darauf hin, dass die Transplantation von Smad3KO-Inseln bei db/db-Mäusen mit Typ--2-Diabetes eine bessere Behandlung gegenüber Smad3WT-Inseln ergibt.

3. Smad3-Mangel fördert die Zellproliferation in den transplantierten Inseln sowohl bei STZ-induzierten diabetischen Mäusen als auch bei db/db-Mäusen.

Als nächstes untersuchten wir die möglichen Mechanismen, durch die die Transplantation von Smad3KO-Inseln eine bessere therapeutische Wirkung sowohl auf T1DM als auch auf T2DM erzielt. Wir untersuchten zunächst die Zellmasse in den transplantierten Inseln durch Immunfärbung mit Insulin. Bei STZ-induziertem Diabetes konnten wir bei Mäusen, denen 50 Smad3KO- oder WT-Inseln transplantiert worden waren, in Woche 16 nach der Transplantation das Vorhandensein von insulinpositiven Zellen unter der Nierenkapsel nicht nachweisen, was auf einen Zellverlust hinweist. Unerwarteterweise zeigten diabetische Mäuse, die 100 Smad3WT-Inseln erhielten, nur wenige verteilte insulinproduzierende Zellcluster, diese waren jedoch bei diabetischen Mäusen, die mit 100 Smad3KO-Inseln behandelt wurden, stark erhöht, was zu einer fast {{13}fachen Zunahme der Zellmasse führte (Abbildung). 5A und B). Interessanterweise zeigten diabetische Mäuse, denen eine hohe Dosis von 200 Smad3KO- oder WT-Inseln verabreicht wurde, eine ähnliche Zellmasse (Abbildungen 5A und B). Diese Ergebnisse stimmten mit der dosisabhängigen Wirkung der Inseltransplantation auf die Hyperglykämie überein, wie in den Abbildungen 1A und B dargestellt.

Als nächstes untersuchten wir, ob die erhöhte Zellmasse in Smad3KO-Inseltransplantaten mit einer verstärkten Zellproliferation verbunden ist. Die zweifarbige Immunfluoreszenz zeigte, dass die mit 100 Smad3WT-Inseln behandelten Mäuse in Woche 16 nach der Inseltransplantation nicht nachweisbares oder seltenes PCNA plus Insulin plus Zellen aufwiesen, was vor allem bei denjenigen erhöht war, die 100 Smad3KO-Inseln oder eine hohe Dosis von 200 Smad3KO oder WT erhielten Inseln (Abbildung 5C und D). Anschließend untersuchten wir, ob Smad3 die frühe Zellproliferation in den transplantierten Inseln unter fortschreitenden diabetischen Bedingungen durch BrdU-Markierung am Tag 7 nach der Inseltransplantation kontrolliert, wenn der Blutzuckerspiegel hoch blieb. Die BrdU-Markierung ergab einen {{14}fachen Anstieg von BrdU plus Insulin plus Zellen in 100 Smad3KO-Inseltransplantaten im Vergleich zur gleichen Dosis von Smad3WT-Inseltransplantaten (Abbildung 5E und F). Dieser Befund weist darauf hin, dass ein Smad3-Mangel die Zellproliferation im S-Phase-Zellzyklus unter hyperglykämischen Bedingungen weitgehend fördert und zu einem 17--fachen Anstieg der Zellmasse beiträgt, wie in Woche 16 nach der Inseltransplantation zu sehen ist (Abbildung 5A und B). . Zusammengenommen legen alle diese Ergebnisse nahe, dass ein Smad3-Mangel die Zellproliferation weitgehend fördert und dadurch die Euglykämie bei STZ-induziertem Typ--1-Diabetes wiederherstellt.

In ähnlicher Weise wurden auch in Smad3KO-Inseltransplantaten bei db/db-Mäusen mit Typ--2-Diabetes hohe Zellproliferationsaktivitäten festgestellt, was sich in einem {{2}fachen Anstieg der Zellmasse im Vergleich zu solchen mit Smad3WT-Inseltransplantaten zeigt Alter von Woche 12 nach Inseltransplantation (Abbildung 6A und B), was mit einem 2,7-fachen Anstieg von Insulin plus PCNA plus Zellen verbunden war (Abbildung 6C und D). Mithilfe der BrdU-Markierung konnten wir auch einen {{10}fachen Anstieg von Insulin plus BrdU plus Zellen in Smad3KO-Inseltransplantaten am Tag 7 nach der Transplantation bei {{14} Wochen alten db/db-Mäusen feststellen (Abbildung 6E und). F). Dieser Befund bestätigt erneut, dass Zellen, denen Smad3 fehlt, gegen Hyperglykämie resistent sind und stark proliferativ bleiben, um die Zellmasse aufrechtzuerhalten und T2DM zu verbessern.

4. Smad3-Mangel fördert die Zellproliferation in vitro

Es wurde berichtet, dass die pharmakologische Hemmung von TGFBR1 die Zellproliferation in vitro fördert [7, 8]. Wir untersuchten daher, ob die genetische Deletion von Smad3 auch die Zellproliferation fördert, indem wir die Smad3KO- und WT-Inselzellen kultivierten und anschließend BrdU-Markierung durchführten. Doppelte Immunfluoreszenz zeigte, dass Inselzellen ohne Smad3 einen signifikant höheren Anteil an BrdU-positiven Zellen (5,7 Prozent) aufwiesen als Smad3WT-Inselzellen (2,4 Prozent) (Abbildung 7A und B). Die verstärkte Proliferation von Smad3KO-Zellen wurde auch durch eine erhöhte Expression von PCNA nachgewiesen, wie die Western-Blot-Analyse ergab (Abbildung 7C), was die wichtige regulatorische Rolle von Smad3 bei der Zellproliferation bestätigte.

5. RNA-seq identifiziert E2F3 als Smad3-Zielgen, das die Zellproliferation reguliert

Um den Downstream-Mechanismus von Smad3 bei der Regulierung der Zellproliferation aufzudecken, führten wir eine RNA-Seq in Inseln durch, die aus db/m- oder db/db-Mäusen isoliert wurden, mit oder ohne Deletion des Smad3-Gens, einschließlich Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT -db/m- und Smad3KO-db/m-Mäuse wie zuvor beschrieben [9]. Die Pathway-Anreicherungsanalyse wurde zwischen den differentiell exprimierten Genen (DEGs) zwischen Smad3WT- und Smad3KO-Inseln im db/m- oder db/db-Hintergrund durchgeführt. Im genetischen Hintergrund von db/db führte Smad3KO zu erheblichen Veränderungen in zellzyklusbezogenen Genen oder Signalwegen, wie durch GO- und KEGG-Analyse gezeigt wurde (Abbildung 8A und Abbildung S3). Angesichts der einzelnen Gene ergab die RNA-seq-Analyse einen Anstieg der Expression von Genen, an denen die Proteinfamilie Cyclin, Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs) und Zellteilungszyklus (CDC) in Smad3KO-db/db-Inseln im Vergleich zu Smad3WT-db beteiligt ist /db-Inseln, was in kultivierten Smad3KO-Inselzellen durch RT-PCR weiter validiert wurde (Abbildung S4 A und C). Im Gegensatz dazu verursachte Smad3KO im genetischen Hintergrund von db/m keinen nennenswerten Einfluss auf zellzyklusbezogene Gene oder Signalwege (Abbildung S3B und C). Es wird berichtet, dass die TGF-/Smad3-Signalübertragung den Zellzyklus negativ reguliert, indem sie die Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitor-Gene (CDKIs) induziert [7, 8, 12]. Überraschenderweise wurde die Expression dieser CDKI-Gene in Smad3KO-db/db-Inseln in vivo und in kultivierten Smad3KO-Inselzellen nicht unterdrückt, wie durch RNA-seq bzw. RT-PCR nachgewiesen wurde (Abbildung S4B und C). Im Gegensatz dazu waren die Expressionsniveaus mehrerer CDKI-Gene wie p16, p18 und p57 in kultivierten Smad3KO-Inselzellen sogar hochreguliert (Abbildung S4C). Dies impliziert, dass bei der Smad3-regulierten Zellproliferation ein alternativer Mechanismus existiert.

Daher analysierten wir das Smad3-Bindungspotential für die Promotorsequenzen der 224 DEGs im GO-Term des Zellzyklus mit der ECR-Browsersoftware (Abbildung 8A). Unter ihnen erregte ein Gen namens E2F3 unsere Aufmerksamkeit, da es ein zentraler und terminaler Executor ist, der den G1/S-Eintritt in den Zellzyklus reguliert [13, 14]. Wir fanden eine potenzielle Smad3-Bindungsstelle im Promotor des Maus-E2F3-Locus, der auch beim Menschen konserviert ist (Abbildung 8B).

Cistanche tubulosa

Um zu untersuchen, ob E2F3 für die durch Smad3-regulierte Zellproliferation essentiell ist, untersuchten wir die Assoziation zwischen E2F3 und Smad3 in Inseln. In Übereinstimmung mit der RNA-Sequenz stellte die Immunhistochemie fest, dass die Expression von E2F3 in den Inseln von Smad3WT-db/db-Mäusen stark reduziert war, in Smad3KO-db/db-Mäusen jedoch stark anstieg (Abbildung 8C). Darüber hinaus wurde auch in kultivierten Smad3KO-Inselzellen eine erhöhte E2F3-Expression sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene beobachtet (Abbildung 8 DF). Im Gegensatz dazu hob die Adenovirus-vermittelte Stille von E2F3 die proliferative Aktivität von Zellen (Insulin) auf^PlusBrdU^Plus) in Smad3KO-Inselzellen (Abbildung 9), was eine wesentliche Rolle von E2F3 bei der Smad3-regulierten Zellproliferation zeigt.

Um die vorhergesagte Bindung von Smad3 im E2F3-Promotor weiter zu bestätigen, führten wir eine Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in isolierten Mausinseln durch (Abbildung 10A). Die Spezifität des für ChIP verwendeten Smad3-Antikörpers wurde zunächst durch Immunpräzipitation in Mausinseln validiert (Abbildung 10B). ChIP-PCR bestätigte die Bindung von Smad3 an den E2F3-Promotor als Anti-Smad3-Antikörper, aber kein unspezifischer IgG-Isotyp konnte das Chromatinfragment, das dem E2F3-Promotor entspricht, erfolgreich präzipitieren (Abbildung 10C). Quantitative RT-PCR ergab eine 6-fache Anreicherung der E2F3-Promotorsequenz im ChIP-Assay mit dem Smad3-Antikörper im Vergleich zum IgG-Isotyp (Abbildung 10D), was zeigt, dass Smad3 an die Promotorregion des E2F3-Genomlocus binden kann .

Um die funktionelle Bedeutung der Smad3-Bindung an den E2F3-Promotor zu validieren, konstruierten wir einen Luciferase-Reportervektor, der von einem Maus-E2F3-Promotor angetrieben wird, der die Smad3-Bindungsstelle oder ihre mutierte Form beherbergt (Abbildung 10E). Der Dual-Luciferase-Assay in HEK293T-Zellen ergab eine robuste Transkription von Luciferase, die durch den klonierten E2F3-Promotor gesteuert wird und durch Überexpression von Smad3 deutlich gehemmt wurde. Allerdings hob die Mutation der Smad3-Bindungsstelle die hemmende Wirkung von Smad3 auf (Abbildung 10F). Diese Ergebnisse lieferten direkte Beweise für die unterdrückende Rolle von Smad3 bei der E2F3-Transkription durch Bindung an seinen Promotor.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Transplantation von Smad3--defizienten Inseln eine bessere therapeutische Wirkung auf Diabetes und diabetische Nierenschäden bei STZ-induzierten diabetischen Mäusen und db/db-Mäusen hatte. Bei STZ-induziertem Diabetes führte die Transplantation von 100 Smad3KO-Inseln, jedoch nicht von 100 Smad3WT-Inseln zu einem {{7}fachen Anstieg der Zellmasse, was mit einem signifikanten Anstieg des Blutinsulinspiegels und damit einer Verbesserung der Glukoseintoleranz und einer Wiederherstellung der Euglykämie einherging zum Schutz vor diabetischer Nierenschädigung.

Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei T2DM bei db/db-Mäusen gefunden, bei denen die Transplantation mit 250 Smad3KO-Inseln, aber nicht der gleichen Dosis an Smad3WT-Inseln ebenfalls die Zellmasse um das {{4}-Fache erhöhte und eine bessere Blutzuckerkontrolle bewirkte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ein Smad3-Mangel resistent gegen diabetische Mikroumgebungen ist und die Ausbreitung transplantierter Inselzellen und die Insulinproduktion weitgehend fördert, um eine bessere Blutzuckerkontrolle zu erreichen. Interessanterweise fanden wir auch heraus, dass die Behandlung mit 100 Smad3KO-Inseln bei STZ-induziertem Diabetes zu einer gleichen Blutzuckerkontrolle führen könnte wie die Verwendung von 200 Smad3WT- oder KO-Inseln. Diese Beobachtung legt nahe, dass ein Smad3-Mangel möglicherweise die Anzahl der Inseln, die für die erfolgreiche Etablierung der Insulinunabhängigkeit bei der Inselzellersatztherapie bei T1DM erforderlich sind, erheblich (mindestens 50 Prozent) reduzieren kann. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit dem vorherigen Bericht, dass die Vorbehandlung der Inseln mit SB-431542, einem Inhibitor von TGFBR1, die Proliferation und Funktion von Zellen nach der Transplantation fördert [15]. Da Smad2 jedoch auch eine wesentliche Rolle bei der durch Glukose stimulierten Freisetzung von Insulin in Zellen spielt [16], könnte die gezielte Behandlung von Smad3, jedoch nicht stromaufwärts von TGFBR1 in Inseln (Zellen), für die Zellersatzbehandlung von Diabetes günstiger sein. Daher könnte die Transplantation von Smad3--defizienten Inseln klinisch eine neuartige Therapie sowohl für T1DM als auch für T2DM darstellen. Darüber hinaus könnte die Behandlung mit Smad3KO-Inseln auch vor einer diabetischen Nierenschädigung in der 16. Woche bei T1DM schützen, obwohl dies bei T2DM aufgrund der minimalen diabetischen Nierenschädigung, die bei db/db-Mäusen im Alter von Woche 12 auftritt, nicht schwerwiegend ist.

Mechanistisch gesehen haben wir herausgefunden, dass Smad3 durch die Unterdrückung von E2F3 funktioniert, um die Zellproliferation zu hemmen. Dies wird durch den Nachweis gestützt, dass der E2F3-Promotor eine funktionelle Smad3-Bindungsstelle enthält, wie durch ChIP und Luciferase-Reporter-Assay bestätigt. Inselzellen ohne Smad3 zeigten eine verstärkte Proliferation in einem E2F3--abhängigen Mechanismus, da der Abbau von E2F3 diese proliferative Aktivität aufhob. E2F3 gehört zur E2F-Familie und ist eine entscheidende Komponente der Rb-E2F-Maschinerie, die den Eintritt in den G1/S-Zellzyklus steuert [13]. E2Fs sind die Transkriptionsfaktoren und letzten Ausführende zur Regulierung von Genen, die den Fortschritt des Zellzyklus steuern [14]. Es wurde nachgewiesen, dass eine Überexpression von E2F3 die Zellproliferation in Inseln von Nagetieren und Menschen fördert [17]. Die Erkenntnisse, dass Smad3 transkriptionell auf E2F3 abzielt, um den Zellzyklus in Zellen zu unterdrücken, liefern einen neuen Regulierungsmechanismus für die Zellproliferation. Somit fördert die Störung von Smad3 in Inselzellen die E2F3--abhängige Zellproliferation, was durch einen deutlichen Anstieg der insulinproduzierenden PCNA plus- oder BrdU plus-Zellen gezeigt wird, was darauf hindeutet, dass die Behandlung mit einer subtherapeutischen Dosis von Smad3KO-Inselzellen ausreicht, um die Zelle zu vergrößern Masse und hemmt sowohl T1DM bei STZ-induzierten Mäusen als auch T2DM bei db/db-Mäusen.

Herba CistancheUndCistanche-Extrakt

Es wird berichtet, dass die TGF-Signalübertragung eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Funktion von Inselzellen der Bauchspeicheldrüse spielt, den Zellzyklus stoppt und Zellapoptose durch die Induktion von CDKIs verursacht [7, 8, 18]. Zu unserer Überraschung zeigten sowohl In-vivo- als auch In-vitro-Experimente, dass die Transkription von CDKIs in Smad3KO-Inseln nicht verändert oder sogar hochreguliert war (Abbildung S4). Diese Diskrepanz kann auf die unterschiedlichen Versuchsbedingungen zurückgeführt werden. Die Ergebnisse der aktuellen Studie wurden von Smad3KO-Mäusen (Inseln) abgeleitet. Die bisherigen Studien basieren jedoch auf der pharmakologischen Hemmung von TGFBR1, die die gesamte TGF-Signalisierung beeinflussen soll [7, 8]. Darüber hinaus verwendeten wir Inselproben von jungen erwachsenen Mäusen (Alter 7 Wochen), während in früheren Studien Inseln von relativ alten Tieren oder Leichenspendern älterer Menschen verwendet wurden [7, 8]. Da Inselzellen eine altersbedingte Akkumulation von CDKIs aufweisen [19], reagieren CDKIs in gealterten Zellen möglicherweise empfindlicher auf die Hemmung des TGF-Signals.

In der vorliegenden Studie gab es mehrere Einschränkungen. Zunächst wird die Wirksamkeit der Inseltransplantation im STZ-induzierten diabetischen Mausmodell ohne Autoimmunreaktion untersucht. Daher sollte der Vorteil von Smad3KO gegenüber der Smad3WT-Inseltherapie bei Diabetes in Zukunft auch in einem authentischen T1DM-Modell überprüft werden. Zweitens basieren die Ergebnisse dieser Studie auf der gesamten Insel, jedoch nicht auf der zellspezifischen Smad3KO-Zelltherapie. Es ist unklar, ob andere Zelltypen als Zellen in der Insel eine Smad3--abhängige Rolle bei der Modulation der Zellproliferation durch interzelluläre Crosstalk-Pfade übernehmen würden. Daher sind weitere Studien mit zellspezifischem Smad3KO gerechtfertigt. Darüber hinaus müssen die Ergebnisse dieser Studie in menschlichen Inselproben verifiziert werden, um ihre klinische Bedeutung zu beweisen.

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Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 und Hui-Yao Lan2,7

1 Forschungszentrum für integrierte Medizin und Abteilung für Nephrologie, angeschlossenes Krankenhaus für traditionelle chinesische Medizin der Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, China.

2. Abteilung für Medizin und Therapeutik und Li Ka Shing Institute of Health Sciences, Chinesische Universität Hongkong, Hongkong, 999077, China.

3. Guangdong-Hong Kong Joint Laboratory on Immunological and Genetic Kidney Diseases, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou, Guangdong, 510080, China.

4. State Key Laboratory of Bioelectronics, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices, School of Biological Sciences & Medical Engineering, Southeast University, Nanjing, China.

5. Schlüssellabor für Prävention und Management chronischer Nierenerkrankungen der Stadt Zhanjiang, Institut für Nephrologie, angegliedertes Krankenhaus der Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong, 524001, China.

6. Nationale klinische Forschungsbasis für traditionelle chinesische Medizin, angeschlossenes Krankenhaus für traditionelle chinesische Medizin der Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, China.

7. Gemeinsames Forschungslabor des CUHK-Guangdong Provincial People's Hospital für immunologische und genetische Nierenerkrankungen, Chinesische Universität Hongkong, Hongkong, 999077, China.