Teil 1: Renovaskuläre Wirkungen von anorganischem Nitrat nach Ischämie-Reperfusion der Niere

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ABSTRAKT

Hintergrund: Verletzung durch renale Ischämie-Reperfusion (IR).ist eine häufige Ursache fürakute Nierenschädigung(AKI), das mit oxidativem Stress und reduzierter Bioaktivität von Stickstoffmonoxid (NO) und einem erhöhten Entwicklungsrisiko verbunden istchronisches Nierenleiden(CKD) und Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD). Neue Strategien, die das Redox-Gleichgewicht wiederherstellen, können während AKI und damit verbundenen Komplikationen therapeutische Auswirkungen haben.

Ziel: Untersuchung des therapeutischen Werts der Verstärkung des Nitrat-Nitrit-NO-Signalwegs während der Entwicklung einer IR-induzierten Nieren- und kardiovaskulären Dysfunktion.

Methoden: Männlichen C57BL/6 J-Mäusen wurde Natriumnitrat (10 mg/kg, ip) oder Vehikel 2 h vor einer warmen Ischämie der linken Niere (45 min) verabreicht, gefolgt von einer Natriumnitrat-Ergänzung im Trinkwasser (1 mmol/kg/ Tag) für die folgenden 2 Wochen. Der Blutdruck und die glomeruläre Filtrationsrate wurden gemessen und Blut und Nieren wurden gesammelt und für biochemische und histologische Analysen sowie Studien zur Reaktivität der Nierengefäße verwendet. Glomeruläre Endothelzellen, die einer Hypoxie-Reoxygenierung mit oder ohne Angiotensin Ⅱ ausgesetzt wurden, wurden für mechanistische Studien verwendet.

Ergebnisse: IR war mit reduzierter Nierenfunktion und leicht erhöhtem Blutdruck verbunden, in Kombination mit Nierenverletzungen, Entzündungen, endothelialer Dysfunktion, erhöhten Ang Ⅱ -Spiegeln und Ang II-vermittelter Vasoreaktivität, die alle durch Nitrat gebessert wurden. Darüber hinaus stellte die Behandlung mit Nitrat (in vivo) und Nitrit (in vitro) die NO-Bioaktivität wieder her und reduzierte mitochondrialen oxidativen Stress und Verletzungen.

Schlussfolgerungen: Die akute Behandlung mit anorganischem Nitrat vor einer renalen Ischämie kann als neuer therapeutischer Ansatz dienen, um AKI und CKD und das damit verbundene Risiko der Entwicklung zu verhindernkardiovaskuläre Dysfunktion.

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1. Einleitung

Eine Ischämie-Reperfusions(IR)-Schädigung der Niere, verbunden mit einer Transplantation, Herzbypassoperation und Schock, ist ein Hauptrisiko für die Entwicklung einer akuten Nierenschädigung (AKI) und einer nachfolgenden chronischen Nierenerkrankung (CKD) [1]. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind komplex und beinhalten Reperfusion-assoziierten oxidativen Stress, Stickstoffmonoxidmangel und Immunzellaktivierung, die zusammen zu einer endothelialen Dysfunktion führen [2, 3]. Die laufende Forschung konzentrierte sich auf die Suche nach neuen und wirksamen Therapien zur Vorbeugung und Behandlung von AKI und seiner Progression zu CKD, wie z. B. ischämische Fernkonditionierung, vorübergehende lokale Hypothermie sowie neue pharmakologische Interventionen [3,4].

Das gasförmige Signalmolekül Stickoxid (NO) trägt wesentlich zur Regulation der kardiovaskulären und renalen Homöostase bei und spielt nachweislich eine schützende Rolle bei IR-Verletzungen [5,6]. Während des ischämischen Ereignisses beeinträchtigt der Sauerstoffmangel jedoch die Funktion der endothelialen NO-Synthase (eNOS), was zu dem "No-Reflow-Phänomen" im ischämischen Gewebe während der Reperfusionsphase beitragen kann. Dies wiederum propagiert Verletzungen von Endothel- und tubulären Epithelzellen [7], die zur Entwicklung einer reduzierten Nierenfunktion beitragen. Zusätzlich zur Hypoxie während der ischämischen Periode fängt die übermäßige Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die im Überschuss durch Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH)-Oxidase und Mitochondrien während der Reperfusionsphase erzeugt werden, NO ab [8]. Neue Ansätze, die oxidativen Stress reduzieren und die Bioaktivität von NO aufrechterhalten, könnten im Kampf gegen IR-induziertes Nierenversagen von therapeutischem Wert sein.

Anorganisches Nitrat (NO3) und Nitrit (NOZ) wurden früher als relativ inerte Produkte angesehen, die aus dem NO-Metabolismus stammen. Jedoch haben über mehr als zwei Jahrzehnte durchgeführte Forschungen gezeigt, dass diese Anionen durch serielle Reduktionen einer Biokonversion unterzogen werden können und wieder NO und andere bioaktive Stickoxidspezies bilden [9]. Die Aktivität dieses alternativen Nitrat-Nitrit-NO-Wegs wird unter Bedingungen mit Hypoxie und niedrigem pH-Wert verstärkt, wenn das klassische NOS-System dysfunktional werden kann [10].

Die Ernährung ist neben dem NOS-System eine wichtige Quelle für zirkulierendes Nitrat und Nitrit, aufgrund hoher Nitratwerte beispielsweise in grünem Blattgemüse. Die Supplementierung mit anorganischem Nitrat und Nitrit wurde sowohl in experimentellen als auch in klinischen Studien mit günstigen kardiovaskulären Wirkungen, einschließlich Blutdrucksenkung, in Verbindung gebracht [11]. Organschützende Wirkungen wurden auch in experimentellen IR-Verletzungsmodellen der Leber [12], des Gehirns [13], der Lunge [14] und des Herzens [12,15] gezeigt. Der potenzielle therapeutische Wert von anorganischem Nitrat und Nitrit bei Nieren-IR-Schäden bleibt jedoch umstritten. Wie kürzlich überprüft [5], können unterschiedliche Ergebnisse in IR-Modellen unter Verwendung einer Nitrittherapie auf Unterschiede in der verwendeten Dosierung, dem Verabreichungsweg, der Behandlungsdauer sowie dem experimentellen Modell selbst zurückzuführen sein [16,17]. Mehrere experimentelle Studien haben die schützenden Wirkungen einer Nahrungsergänzung mit Nitrat in Modellen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen über Mechanismen gezeigt, die die Dämpfung von oxidativem Stress und die Verbesserung der Bioaktivität von NO sowie die Modulation von NO beinhaltenentzündliche Reaktionen[5]. Bisher gibt es nur begrenztes Wissen über die Wirkungen einer Therapie mit anorganischen Nitraten bei renaler IR-Schädigung. Wir haben zuvor gezeigt, dass eine chronische diätetische Vorbehandlung mit Nitrat nachfolgende IR-induzierte Nierenschäden abschwächt [18]. Es gibt jedoch weniger Wissen über den potenziellen Wert einer Verstärkung des Nitrat-Nitrit-NO-Signalwegs zu Beginn der IR, um das Risiko der Entwicklung von AKI und CKD zu verringern. Wenn es schützt, könnte dies breite klinische Anwendungen bei Patienten haben, bei denen das Risiko besteht, AKI zu entwickeln, z. B. bei Patienten, die sich einer größeren Operation unterziehen.

In dieser Studie verwendeten wir ein Mausmodell einer Nieren-IR-Verletzung, um die potenziellen Vorteile einer akuten Nitratbehandlung unmittelbar vor dem ischämischen Ereignis zu untersuchen. Dies wurde mit mechanistischen Ex-vivo-Gefäßstudien und In-vitro-Zellkulturexperimenten mit Nitritbehandlung kombiniert. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Verstärkung des Nitrat-Nitrit-NO-Wegs den Schutz der Nieren vor IR-Schäden durch Modulation von oxidativem Stress und NO-Bioaktivität sowie mitochondriale Funktion fördern würde.

2. Methoden

2.1.Reagenzien

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Reagenzien von Sigma-Aldrich, Schweden bezogen.

2.2. Tier- und Nierenischämie-Reperfusionsmodell

C57BL/6 J-Mäuse (männlich, 10 Wochen) wurden von Janvier Lab-oratories (Frankreich) bezogen und in unseren Tiereinrichtungen am Karolinska Institutet unter klimatisierten Bedingungen mit einem 12- h Hell/Dunkel-Zyklus untergebracht und bereitgestellt mit normalem Nagetierfutter und Leitungswasser. Alle Tierversuche wurden von der Regionalen Ethikkommission für Tierversuche genehmigt (Protokoll-ID: N139/15) und wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) und der EU-Richtlinie 2010/63/EU für die Durchführung von Tierversuchen durchgeführt Experimente an Tieren.

Nach 1 Woche Akklimatisierung wurde den Mäusen Placebo (NaCl) oder Natriumnitrat (NaNO3) intraperitoneal (10 mg/kg) 2 h vor einseitiger Ischämie der linken Niere verabreicht. Die rechte Niere wurde inspiziert, aber ansonsten intakt gelassen. Scheinoperationen wurden auf die gleiche Weise durchgeführt, jedoch ohne Abklemmen der linken Niere. Die Mäuse wurden mit Isofluran betäubt und die Körpertemperatur wurde während der gesamten Operation mit einer Heizlampe und einem selbstüberwachten Heizkissen auf 37 ± 0,5 Grad gehalten. Nach der Operation wurden die Mäuse 2 Wochen lang bis zum Abbruch entweder mit Natriumnitrat (1 mmol/kg/Tag) oder Placebo behandelt.

2.3. Blutdruckmessung

Der Blutdruck wurde bei Mäusen unter Verwendung einer nicht-invasiven Schwanzmanschettenmethode vor der Beendigung gemessen. Die Mäuse wurden 10 Minuten lang auf einer warmen Platte bei 35 Grad C konditioniert und dann in Plastikbehälter gesetzt. Am Schwanz wurde eine Manschette mit einem pneumatischen Pulssensor angebracht und die Blutdruckwerte mit dem CODA-System (Kent Scientific, Torrington, CT, USA) aufgezeichnet. Die Tiere wurden mindestens drei Tage vor den Blutdruckaufzeichnungen mit den Restrainern auf der Wärmeplatte trainiert. Systolischer, diastolischer und mittlerer arterieller Druck wurden über 3 aufeinanderfolgende Tage gesammelt und individuelle Mediane aller akzeptierten Werte wurden zur Bewertung zusammengestellt.

2.4. Gewebeentnahme

Vor der Beendigung wurden die Mäuse in Stoffwechselkäfige gesetzt, um Urin zur Berechnung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) zu sammeln. Die Tiere wurden dann mit Isofluran anästhesiert und Blutproben wurden durch die untere Hohlvene entnommen. Alle Proben wurden sofort bei 6000 × g, 4 Grad C für 5 Minuten in Gegenwart von EDTA (Sigma-Aldrich, Stockholm, Schweden), einer Endkonzentration von 2 mM, zentrifugiert. Plasmaproben wurden in neue Röhrchen überführt und sofort in Trockeneis schockgefroren und schließlich bei -80 Grad gelagert. HE- und PAS-Färbung) und Quantifizierung von Apoptose und Entzündung (Tissue-Tek-Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) einbetten und einfrieren für TUNEL- und F4/80-Färbung).

2.5. Messungen von Nitrat, Nitrit, cGMP, Kreatinin, Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) und Angiotensin II

Nitrit und Nitrat wurden durch HPLC (ENO-20) analysiert, wie zuvor beschrieben 【19】. Plasmaproben (10 ul) wurden mit einer Hamilton-Spritze in das HPLC-System injiziert. Anschließend wurden Nitrit und Nitrat durch Umkehrphasen/Ionenaustauschchromatographie getrennt, gefolgt von Nitratreduktion zu Nitrit durch Cadmium und reduziertes Kupfer. Nitrit wurde unter Verwendung von Griess-Reagens derivatisiert, um Diazoverbindungen zu bilden, und bei 540 nm nachgewiesen. Um den Abbau von cGMP zu verhindern, wurde das Plasma in Röhrchen überführt, die einen PDE-Inhibitor, BMX(3-Isobutyl-1methylxanthin; Sigma-Aldrich Nr. I5879), enthielten, um eine Endkonzentration (10 μM) zu ergeben danach eingefroren und bei -80 Grad gelagert, bevor cGMP mit einem ELISA-Kit (GE Healthcare #RPN226) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert wird.

Die Plasma- und Urin-Kreatininspiegel wurden unter Verwendung von Creatinine Colorimetric Assay Kits (Cayman Chemical, Nr. 700460 und Nr. 500701) nachgewiesen. Die Kreatinin-Clearance-Formel (CLcr=Urinecrx Urine flow/Plasmacr) wurde zur Schätzung der GFR verwendet. Die Plasma-BUN-Spiegel wurden unter Verwendung des BUN Colorimetric Detection Kit (Invitrogen, #EIA-BUN) nachgewiesen. Die Ang-Spiegel in Plasma- und Nierengeweben wurden unter Verwendung eines Ang 2/8 ELISA-Kits (Cloud-Clone Corp., Nr. CEA005Mu) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Herstellung des Gewebeextrakts weicht jedoch geringfügig von der Empfehlung ab. 10 Vol. 50 mM HCl in 50 Prozent EtOH wurden dem Gewebe zugesetzt und 10 min bei 100 Grad erhitzt, zentrifugiert 10 000 × g 10 min. Danach wurden die Proben eingefroren und bei -80 Grad gelagert, bevor sie analysiert wurden. Alle Extinktionsmessungen wurden in SpextraMax iD3 von Molecular Devices durchgeführt.

2.6. Isolierung und Perfusion interlobärer Arterien

Die Nieren wurden nach der Tötung geerntet und in eiskalter physiologischer Salzlösung (PSS) bis zur Isolierung der interlobären Arterien gehalten. Renale interlobäre Arterien wurden präpariert (2 mm lang) und in a montiert

Myographenkammer (Modell 62 0 M, Danish Myo Technology, Dänemark) mit PSs wie zuvor beschrieben [20]. Die isometrische Spannung wurde mit einem Powerlab-System (Powerlab 4/30, AD Instruments, Australien) aufgezeichnet. Nach dem Montieren wurden die Gefäße 20 Minuten lang in PSs äquilibriert, die mit Carbogen (95 Prozent O2; 5 Prozent CO2) bei 37 Grad, pH 7,4, sprudelten. Dann wurde die Ruhespannung der Arterien wie zuvor beschrieben eingestellt [21]. nach dem Normalisierungsverfahren von Mulvany [22]. Nach einer zweiten Äquilibrierung wurden 0,1 mol/l KCl aufgetragen, um die Lebensfähigkeit des arteriellen Rings zu beurteilen.

2.7. Isolation und Mikroperfusion afferenter Arteriolen

C57BL/6 J-Mäuse wurden mit inhaliertem Isofluran anästhesiert, und die Nieren wurden entnommen und wie zuvor beschrieben schnell in Scheiben geschnitten [23-25]. Nierenscheiben wurden in eiskaltes Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) gegeben. Eine einzelne afferente Arteriole mit anhängendem Glomerulus wurde unter einem Stereomikroskop mikropräpariert und in a übertragen

temperierte Kammer auf dem Objekttisch eines inversen Mikroskops. Der Glomerulus wurde mit einer haltenden Mikropipette fixiert und die zuführende Arteriole wurde kanüliert und mit einem Satz Mikropipetten perfundiert. Der intraluminale Druck der perfundierten afferenten Arteriole wurde während der Experimente auf 60 mmHg gehalten. Die Zeit für die Dissektion und die folgende Mikroperfusion wurde auf 120 min begrenzt, nachdem die Maus wie zuvor beschrieben getötet wurde [26]. Nach einer 30-minütigen Äquilibrierungsperiode bei 37 Grad wurden kumulative Dosis-Wirkungs-Kurven auf Ang II (10-12 bis 10-8 mol/L) erhalten. Jede Konzentration von Ang II wurde für 2 min perfundiert, die konstriktive Reaktion aufgezeichnet und dann der Durchmesser der zuführenden Arteriole gemessen.

2.8. Histologische Untersuchung

Die Nierenproben wurden geerntet und in 4-prozentiger Paraformaldehydlösung fixiert. Fixiertes Nierengewebe wurde in Paraffin eingebettet und danach in Scheiben geschnitten und mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) oder Periodic Acid Schiff (PAS) zur histologischen Beurteilung gefärbt. Vier zufällig ausgewählte Tiere aus jeder Versuchsgruppe wurden für die Analyse verwendet. Zehn zufällig ausgewählte Felder aus jedem Abschnitt wurden unter 400-facher Vergrößerung aufgenommen. Alle morphometrischen Analysen wurden verblindet durchgeführt.

2.9. TUNEL-Färbung

OCT-eingebettete Nierenproben wurden für die TUNEL-Färbung verwendet. 6- μm dicke Schnitte wurden mit 20 ug/ml Proteinase K für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und TUNEL-Reaktionen wurden unter Verwendung des Click-iTTM Plus TUNEL-Assays (Invitrogen C10618, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Am Ende des Protokolls wurde die DAPI-Färbung durchgeführt. Zur Quantifizierung wurden drei Tiere und drei Feldbereiche des Bildes (200 ×) zufällig ausgewählt und mit dem konfokalen Mikroskop Zeiss LSM 800- Airy fotografiert, die positiven Signale wurden mit der Software ImageJ/Fiji quantifiziert und als berechnet Verhältnis der positiven Signale zu DAPI.

2.10. Gewebeimmunfluoreszenzfärbung und konfokale Mikroskopie (F4/80)

Die Nieren wurden in OCT (Tissue-Tek, Torrence, CA, USA) eingefroren und Schnitte (6 μm) wurden präpariert und weiter verarbeitet. Gefrorene Schnitte wurden mit 1 × PBS gewaschen und mit 2 % BSA in PBS für 30 min blockiert und dann mit Anti-F4/80 (1:50, BIO-RAD Cl: A3-1) über Nacht bei 4 Grad inkubiert Kühlraum und anschließend mit einem sekundären Antikörper (1:200 Cell Signaling Tech #4417) bei Raumtemperatur für 1 h, gefolgt von Gegenfärbung mit 300 nmol/L DAPI(4'6-diamidino-2-phenyl). -Indol, Dihydrochlorid, Invitrogen) für 3 min. Die Immunfluoreszenzsignale wurden unter dem konfokalen Mikroskop Zeiss LSM 800- Airy sichtbar gemacht. drei Tiere und drei Feldbereiche des Bildes (200×) wurden zufällig ausgewählt. Positive F4/80-Signale wurden unter Verwendung von ImageJ/Fiji-Software quantifiziert und als Verhältnis der positiven Signale zu DAPI berechnet.

2.11. Zellkultur

Glomeruläre Endothelzellen (GECs) von Ratten (DSMZ ACC262, Deutschland) wurden in RPMI1640(Gibco 21870-076)-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum und 2 m ML-Glutamin (Gibco 25030-082), Penicillin und Streptomycin kultiviert (50 mg/l, Gibco 15140-122). Die Zellen wurden bei 37 Grad in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 Prozent CO 2 gehalten. In Hypoxie-Experimenten wurden Zellen in HBSS (Gibco 14025-092) anstelle des serumfreien Mediums in einer Kammer mit 1 Prozent Sauerstoff bei 37 Grad C für 2 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden mit Nitrit (10 μM) mit/ohne dem Xanthin-Oxidoreduktase(XOR)-Inhibitor Febuxostat (100 nM) für 30 Minuten vor der Hypoxie vorinkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem PrestoBlue⑧-Assay (Invitrogen, A13261 und A13262) bewertet, und die Zellmortalität wurde mit dem Trypan Blue Exclusion Assay (Sigma, T8154-20 ML) bewertet.

2.12. Nachweis von mitochondrialen ROS

Mitochondriale Superoxidspiegel wurden mit einem fluorogenen Farbstoff (MitoSOXTM, Invitrogen M36008) nachgewiesen. Nach der Behandlung wurden die Endothelzellen mit 2 &mgr;mol/L MitoSox in einem Kulturmedium bei 37 Grad für 10 min inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit 1x HBSS gewaschen und das Fluoreszenzsignal gemessen (SpectraMax iD3 reader, Molecular Devices, USA) und auf die Zelllebensfähigkeit normalisiert.

2.13. Immunoblot-Analyse

Gefrorene Nierenproben oder Endothelzellen wurden in Puffer lysiert, der 10 mmol/L Tris-HCl pH 8, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 60 mmol/L N-Octyl-Glucosid, 1 Prozent Triton X{{9 }}, Protease-Inhibitor-Cocktail und Protein-Phosphatase-Inhibitoren. Die Zell- oder Gewebelysate wurden für 5 min bei 10,000×g bei 4 Grad zentrifugiert. Die Überstände/Proteine ​​wurden in neue Röhrchen überführt und mit dem Bio-Rad quantifiziert

Protein-Assay. Proteinextrakte, die eine äquivalente Menge an Proteinen enthielten, wurden unter Verwendung von {{0}} Prozent Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. Proteine ​​wurden 1 Stunde lang bei 300 mA auf eine Immobilon-Polyvinylidendifluoridmembran übertragen. Membranen wurden in 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl und 0,1 % Tween 20 (TBS-T) mit 5 % fettfrei blockiert Milchpulver für 1 h und immundetektiert mit Antikörpern gegen Anti-TFAM (1:2000, ab131607), Anti-OXPHOS (1:1000, ab110413), Anti-Vinculin (1:5000, ab129002) (Abcam Cambridge, UK) und Anti -Gespaltene Caspase-3 (1:1000, #9664) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Alle sekundären Antikörper für die Immunoblot-Analyse stammten von Cell Signaling Technology. Für Western Blots werden unbeschnittene, kommentierte Bilder in voller Länge mit MW-Markern in der ergänzenden Datei gezeigt.

2.14. statistische Analyse

Mehrere Vergleiche zwischen den Gruppen wurden durch ein- oder zweifache ANOVA analysiert, gefolgt von einem empfohlenen Post-Hoc-Test. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Alle statistischen Berechnungen wurden mit Graphpad Prism 8 durchgeführt.0. Die statistische Signifikanz wurde als p definiert<>