Teil 3: Auswirkungen von Isorhamnetin auf Diabetes und die damit verbundenen Komplikationen: Eine Überprüfung von In-vitro- und In-Vivo-Studien und eine Post-hoc-Transkriptomanalyse des beteiligten molekularen Signalwegs

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5. Eine Post-hoc-Transkriptomanalyse prognostiziert die potenzielle Wirkung des Isorhamnetins auf Diabetes in einem stammzellbasierten Werkzeug

Wir haben ein stammzellbasiertes Werkzeug mit einem perinatalenStammzelle, humane Amnionepithelzellen (hAECs), zur Bewertung der Bioaktivitäten natürlicher Verbindungen mittels Ganzgenom-Microarray-Analyse [71,140-144]. In den letzten Jahren wurde eine immer größere Anzahl bioaktiver Verbindungen in Heilpflanzen auf ihre potenziellen therapeutischen und präventiven Wirkungen untersucht. In diesem Zusammenhang erhalten stammzellbasierte Ansätze, die humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) verwenden, große Aufmerksamkeit als physiologisch relevantere In-vitro-Humanmodelle für das Wirkstoffscreening und die Validierung von Tausenden von Verbindungen sowohl in der akademischen Forschung als auch in der pharmazeutischen Industrie [145-147]. hPS-Zellen, einschließlich embryonaler Stammzellen (hESCs) und induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs), haben jedoch begrenzte Zellressourcen, erfordern invasive Extraktionsverfahren, teure Zellumprogrammierung und kritische Erhaltungsverfahren sowie ethische Einschränkungen und sind daher als praktische Quelle für das Arzneimittelscreening weniger günstig. Auf der anderen Seite werden hAECs aus dem weggeworfenen Begriff Plazenta, einem medizinischen Abfallprodukt, entfernt. Sie erfordern keine invasiven Ernteverfahren und haben minimale ethische Bedenken. Darüber hinaus werden hAECs aus den pluripotenten Epiblasten entrieben und erhalten so ein ESC-ähnliches Multilineage-Differenzierungspotential und können in Zellen aus allen drei Keimschichten differenziert werden [148-151].

Es ist erwähnenswert, dass hAECs bei entsprechendem Differenzierungsprotokoll in hepatozytenähnliche Zellen [152-155], Cholangiozyten [156] und vor allem pankreasartige β-ähnliche insulinproduzierende Zellen[157-160] differenziert werden können. Die Transplantation von hAEC-induzierten Pankreaszellen in Streptozotocin-induzierte diabetische Mäuse könnte den Blutzuckerspiegel normalisieren[161]. hAECs[162] sowie Exosomen, die von hAECs abgeleitet sind [163], könnten die diabetische Wundheilung beschleunigen, indem sie die Angiogenese und die Fibroblastenfunktion fördern und Entzündungen reduzieren. Die Integration von hAECs in Inselorganoide [164] und die Abschirmung nativer Inseln mit einer Schicht von hAECs [165] könnte die Inseltransplantation und Revaskularisierung in diabetischen Mäusemodellen verbessern. Darüber hinaus wurde berichtet, dass hAEC-abgeleitete hepatozytenähnliche Zellen sowie hAEC selbst eine therapeutische Wirksamkeit bei Lebererkrankungen haben, einschließlich Leberfibrose [166,167], Zirrhose [168] und Leberversagen [169].

In Anbetracht der komplexen Pathophysiologie von DM ist hAEC möglicherweise kein ideales In-vitro-Modell, um die ant-diabetischen Wirkungen von Verbindungen zu untersuchen. Aufgrund seiner stammzellähnlichen Eigenschaften kann es jedoch für das anfängliche Screening von Zielverbindungen verwendet werden. Wir haben zuvor das antifibrotische[71] und hepatische Differenzierungspotenzial [170] von Isorhamnetin in hAECs untersucht. In der vorliegenden Studie haben wir eine gezielte Sekundäranalyse unserer bisher veröffentlichten Daten [71] durchgeführt, um die potenziellen Funktionalitäten von Isorhamnetin inDiabetes(Abbildung 4). Die Datenanalyse wurde für drei biologische Replikate von Tag 10 Kontroll- (n = 3) und Isorhamnetin-behandelten (n = 3) hAECs durchgeführt. Die Zellen wurden in 3D-Zellkultur gezüchtet. Kontrollzellen wurden in plazentarem Basalepithelzellmedium (Promo Cell, Kat.#C-26140) in Abwesenheit von Differenzierungsmedium oder Wachstumsfaktoren gehalten, während die Behandlungszellen 10 Tage lang mit 20 mM Isorhamnetin (Sigma-Aldrich, Japan) ergänzt wurden. Differentiell exprimierte Gene (DEGs) werden als Gene mit linearer Faltenänderung>2 und p-Wert bezeichnet.<0.05(one-way between-subjects="" anova).="" a="" total="" of="" 303="" degs="" were="" identified;="" among="" them,="" 60="" were="" upregulated="" and="" 243="" were="" downregulated.="" details="" of="" methodology="" have="" been="" explained="" elsewhere="" [71,170].="" all="" microarray="" data="" are="" available="" at="" gene="" expression="" omnibus(geo)="" under="" accession="" number:="" gse153149="" (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc="GSE153149,accessed" on="" 24="" november="">

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5.1. Zelltyp-Signatur-Gensätze

In unseren früheren Studien zu hAECs fanden wir heraus, dass verschiedene Arten von Verbindungen die Differenzierung von hAECs auf verschiedene Zelllinien lenken könnten, wie z.B. einen Kaffeesäureester, Rosmarinsäure [142] und ein Caffeoylchininsäurederivat3,4,5-Tri-O-Caffeoylchinasäure (TCQA)[140], das die Differenzierung neuronaler Zellen verbessern könnte, während ein Anthocyanin, Cyanidin-3-O-glucosid (Cy3G), eine Adipozytendifferenzierung [143] in hAECs induzierte. Wir beobachteten, dass die Bioaktivitäten oder Funktionalitäten von Naturstoffen im Allgemeinen von den angereicherten Zelltypen durch die DEGs vorhergesagt werden konnten.

Wir untersuchten die signifikant angereicherten Zelltyp-Signaturdatensätze mit der Molecular Signatures Database (MSigDB)ver. 7.4 der GSEA-Online-Software (https://software. broadinstitute.org/gsea/index.jsp; abgerufen am 26. November 2021)[171]. Diese Gensätze enthalten Clustermarker-Signaturgene für Zelltypen, die in Einzelzellsequenzierungsstudien für menschliches Gewebe identifiziert wurden, und erleichtern die Zelltypzuweisungen in Datensätzen, wie z.B. Experimente zur Entwicklung von Organoidmodellen.

Wir fanden heraus, dass der am stärksten angereicherte Zelltyp-Gensatz pankreatische mesenchymale Stromazellen waren [172] (Abbildung 4A). Zusätzlich wurden duktale und Endothelzelltypen der Bauchspeicheldrüse signifikant angereichert [172]. Pankreas-Signaturgene in Isorhamnetin-behandelten hAECs sind am epithelial-mesenchymalen Übergang, der TGF-β-Signalgebung, der TNF-α-Signalgebung über NF-kB, der KRAS-Signalgebung und dem Fettsäurestoffwechsel beteiligt. Mehrere hepatische Signatur-Gensätze wurden ebenfalls signifikant angereichert, wie HSCs, Kupferferzellen, Gallengangszellen [173] und fetale Lebermesothelzellen [174]. Es gab auch mehrere signifikant angereicherte Skelettmuskel-Signatur-Gensätze, darunter Fibrillin1 + fibro-adipogene Vorläuferzellen (FBN1 + FAP), fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAP) und Perizyten der Skelettmuskulatur [175]. Die biologischen Funktionen von hepatischen Signaturgenen in Isorhamnetin-behandelten hAECs umfassen mehrere Entzündungsreaktionswege, während Skelettmuskelsignature-Gene die Wundheilung, die Kollagenfibrillenorganisation und die MAPC-Kaskade regulieren. Die Signifikanz wurde als falsche Entdeckungsrate gemessen, ein Analogon des hypergeometrischen p-Wertes nach Benjamini und Hochberg-Korrektur für mehrere Hypothesentests (FDR q-Wert)<>

5.2.Signifikant angereicherte Hallmark-Gensätze

Als nächstes untersuchten wir die signifikant angereicherten Hallmark-Gensätze auf MSigDB (abgerufen am 26. November 2021). Hallmark-Gensätze repräsentieren spezifische, gut definierte biologische Zustände oder Prozesse, die auf der Identifizierung von Gensatzüberlappungen und der Beibehaltung von Genen mit kohärenter Expression erzeugt werden. Die Kennzeichen haben eine Sammlung von 50 Gensätzen, die aus über 4000 überlappenden Gensätzen kondensiert sind und somit Rauschen und Redundanz reduziert haben [176].

Zu den signifikant angereicherten Kennzeichen-Gensätzen gehören Gene, die den epithelial-mesenchymalen Übergang definieren, Gene, die als Reaktion auf Hypoxie hochreguliert werden, Gene, die durch NF-kB als Reaktion auf TNF reguliert werden, Gene, die durch KRAS-Aktivierung hoch- und herunterreguliert werden, Gene, die die Apoptose durch Aktivierung von Caspasen vermitteln, Gene, die an der Myogenese beteiligt sind, Gene, die als Reaktion auf TGF-β1 hochreguliert wurden, Gene, die durch STAT5 als Reaktion auf die IL-2-Stimulation hochreguliert wurden, Gene, die die Entzündungsreaktion definieren, Gene, die an p53-Signalwegen und -Netzwerken beteiligt sind, und Gene, die für Proteine kodieren, die an der Glykolyse und Glukoneogenese beteiligt sind (Abbildung 4B). Die Signifikanz wurde bei FDR q-Wert berücksichtigt<>

Ein interessantes Ergebnis ist die Anreicherung der KRAS-Aktivierung durch die DEGs der Isorhamnetin-behandelten hAECs. Es wurde festgestellt, dass mehrere KRAS-induzierte Genexpressionen durch Isorhamnetin signifikant herunterreguliert wurden, wie MMP9, TSPAN1 und ITGBL1. Hyperglykämie löst genomische Instabilität aus, die zu KRAS-Mutationen in Bauchspeicheldrüsenzellen führt [177] und wurde auch mit einem erhöhten Risiko und einer erhöhten Invasivität von Bauchspeicheldrüsenkrebs [178] und Darmkrebs [179] in Verbindung gebracht. Wang et al. berichteten, dass Isorhamnetin die Proliferation der pankreatischen Adenokarzinom-Zelllinie PANC-1 durch Herunterregulierung der Ras/MAPC-Signalwegaktivität unterdrückt [134]. Wie in Abschnitt 4.2.4 erwähnt, ist die Wirkung von Isorhamnetin auf das KRAS-induzierte Risiko für Krebserkrankungen bei Diabetes, insbesondere Bauchspeicheldrüsenkrebs, eine weitere Untersuchung wert.

5.3. Erheblich angereicherte Wege

Weitere Pathway-Analysen der DEGs wurden unter Verwendung der Comparative Toxicogenomics Database (CTD)(http://ctdbase.org/; abgerufen am 29. November 2021)[180] durchgeführt. CTD repräsentiert die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) und REACTOME pathways. Wir fanden heraus, dass mehrereaufrührerischSignalwege, Kollagenbildung und -assemblierung, PI3K-Akt-Signalweg und AGE-RAGE-Signalweg bei diabetischen Komplikationen waren signifikant angereichert (Abbildung 4C).

Advanced Glycation End Products (AGEs) werden durch die nicht-enzymatische Glykation und Oxidation von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren hergestellt. Die Rezeptoren für Advanced Glycation End Products (RAGE) gehören zur Immunglobulin-Superfamilie. AGE/RAGE-Signalisierung ist eine komplexe und komplizierte Kaskade, die mehrere intrazelluläre Signalwege aktiviert, die Proteinkinase C, NADPH-Oxidase und MACKs beinhalten, was zu einer NF-kB-induzierten Expression von IL-1, IL-6, TNF-α, VCAM-1 und VEGF führt. Insbesondere wurde die AGE/RAGE-Signalgebung mit der Diabetes-vermittelten Gefäßverkalkung durch Aktivierung von TGF-β-vermittelten Fibrose-, NFkB- und ERK1/2-Signalwegen in Verbindung gebracht [181-184]. Wir fanden heraus, dass Isorhamnetin die AGE/RAGE-Signalisierungs-bezogene Genexpression wie COL1A1, COL1A2, COL4A6, FN1, MMP2 und SERPINE1 signifikant verringerte. Wie im vorherigen Abschnitt diskutiert, wurden die antifibrotischen Wirkungen von Isorhamnetin gut dokumentiert [71,74,99,119], und daher kann behauptet werden, dass Isorhamnetin auch positive Auswirkungen auf die diabetesinduzierte vaskuläre Pathologie haben kann.

5.4.Signifikant angereicherte Stoffwechselerkrankungen und verwandte Genexpressionen

Kuratierte Daten zur Assoziation von Generkrankungen wurden aus der CTD abgerufen (abgerufen am 29. November 2021). Wir kuratierten nur signifikant angereicherte Stoffwechselerkrankungen. Die Bedeutung der Anreicherung wurde durch die hypergeometrische Verteilung berechnet, die nach der Bonferroni-Methode angepasst wurde. Zu den signifikant angereicherten Stoffwechselerkrankungen gehörten DM, Glukose- und Fettstoffwechselstörungen, Hyperglykämie und Fettleibigkeit (Abbildung 4D). Die Heatmap zeigt, dass PPARs, TGFs, TNFs, ILs, Kollagen und Apoptose-induzierende Genexpressionen in Isorhamnetin-behandelten hAECs signifikant herunterreguliert waren (Abbildung 4E). Auf der anderen Seite wurden Insulinrezeptoren, Lipoproteinlipasen und Apoptosehemmer in Isorhamnetin-behandelten hAECs signifikant hochreguliert.

Unsere gezielte Microarray-Datenanalyse von Isorhamnetin-behandelten hAECs bestätigte auch das Potenzial von Isorhamnetin bei der Regulierung biologischer Funktionen im Zusammenhang mit DM und den damit verbundenen Komplikationen.

6. Bioverfügbarkeit und intestinale Absorption von Isorhamnetin-Aglycon und seinen glykosylierten Derivaten

Mit dem Vorhandensein verschiedener Kategorien vonFlavonoideIn der Natur ist es interessant, das Vorhandensein dieser Verbindungen im Körper zu analysieren. Wenn wir über den Stoffwechsel von Isorhamnetin und seine Verfügbarkeit im menschlichen Körper nach dem Verzehr sprechen, sprechen wir über den Ursprung, den Stoffwechsel und den Transport. Dies basiert auf einer chromatographischen Beobachtung einiger Flavonoide wie Flavonole im menschlichen Serum. Die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie gibt Einblick in die Bioverfügbarkeit bestimmter Flavonoide in ihren Aglycon- und Glykosidformen im Körper [49]. Mit Hilfe der Massenspektrometrie können Flavonoide in biologischen Proben bestimmt werden [185]. Eine Studie berichtete über 23 gemischte Sulfat-, Methyl-, Glucuronid- und Glukosederivate vonQuercetinsowohl im Urin als auch im Plasma von menschlichen Freiwilligen 1 h nach Einnahme von leicht gebratenen roten Zwiebeln. Diese Studie wies Glykoside sowohl von Quercetin als auch von Isorhamnetin im Plasma nach [186].

Mehrere Faktoren spielen eine Rolle beim Eintritt von Nährstoffen durch den Verdauungstrakt. Zum Beispiel beeinflussen Enzyme aus der Darmmikrobiota den Eintritt phenolischer Verbindungen.

Eine Studie, die an den Ginkgo-Blattextrakten in einem Mäusemodell durchgeführt wurde, zeigte die Bedeutung der Darmmikrobiota für die Bioverfügbarkeit und Absorption einiger bioaktiver Moleküle, insbesondere Isorhamnetin, aus dem Magen-Darm-Trakt [187]. In diesem Schritt produzieren Enzyme der DarmmikrobiotaflavonoidAglycone und eine Vielzahl von Ringspaltungsprodukten. Analysen der Vollblutproben zeigten, dass die Aufnahme von Isorhamnetin durch antibakterielle Behandlung erhöht wurde, was darauf hindeutet, dass Darmmikrobiota-Enzyme einen negativen Einfluss auf die Pharmakokinetik natürlicher Moleküle wie Isorhamnetin haben.Antibakterielloder der Verzehr von Probiotika kann die Bioverfügbarkeit der Glykosidform von Isorhamnetin erhöhen. Darüber hinaus unterschieden sich die In-vitro-Biotransformationsraten und Verweilzeiten bioaktiver Moleküle zwischen normalen, diabetischen und diabetischen Nephropathie-Ratten [188].

Auf der anderen Seite steuern verschiedene Membrantransporter den Transport von Flavonoiden, wie der natriumabhängige Glukosetransporter 1 (SGLT1) und die Multidrug-Resistenz-assoziierten Proteine 2 und 3 (MRP2 und MRP3)[189]. In diesem Zusammenhang regulieren MRP-Transporter die transzellulären und parazellulären Transportwege von Isorhamnetin [190]. Innerhalb der Zellen war der Transport von Isorhamnetin von der apikalen zur basalen Seite 6,8-9,3-fach höher. In Abbildung 5 sind die antidiabetischen Wirkungen von Isorhamnetin zusammengefasst.

7. Schlussfolgerungen

Isorhamnetin ist eine phenolische Verbindung der Familie der Flavonoide, genauer der Flavonole. Ursprünglich ist es ein Quercetin-Molekül, wurde aber einer Methylierung unterzogen. Isorham-Netin ist im Pflanzenreich in vielen Wild- und Kosmetikpflanzen verbreitet. Darüber hinaus produzieren mehrere Heilpflanzen dieses Molekül und mehrere Studien haben seine antidiabetische Wirkung unter anderen biologischen Aktivitäten bezeugt. All diese Daten zeigen somit das Interesse von Isorhamnetin an der therapeutischen Industrie. Aus dieser Perspektive wäre es sehr interessant, die Wirkung von Isorhamnetin und seinen Derivaten, insbesondere isoliert aus natürlichen Ressourcen, auf Stoffwechselstörungen zu untersuchen. Es ist auch notwendig, die in diesem Zusammenhang durchgeführten klinischen Studien mit flavonoidreichen Fraktionen und Naturprodukten hervorzuheben und zu überprüfen, um die Auswirkungen von Nebenwirkungen zu vermeiden, die durch synthetische und chemische Drogen verursacht werden.

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