Phenylethanoidglykoside: Verfahren zur Trennung der Gesamtglykoside von Phenethylalkohol und seine hemmende Wirkung auf Monoaminoxidase-A

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Isolierung und Identifizierung von Phenylethanoidglycosiden aus Aloysia Polystachya und ihre Aktivität als Inhibitoren von Monoaminoxidase-A

Autoren

Ana Maria S. Pereira1, Camila C. Guimarães1, Sarazete IV Pereira1, Eduardo J. Crevelin2, Gustavo HT Pinto1, Lucas JF Morel1, Bianca W. Bertoni1, Suzelei C. França1, Silvia H. Taleb-Contini1

Zugehörigkeiten

1 Departamento de Biotecnologia em Plantas Medicinais, Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP), Ribeirão Preto, SP, Brasilien

2 Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de

São Paulo (USP), Monte Alegre, Ribeirão Preto, SP, Brasilien

Schlüsselwörter:Aloysia polystachya, Verbenaceae, antidepressive Aktivität, Phenylethanoide, Monoaminoxidase-Hemmer, Acteosid

Abstrakt

Aloysia polystachya wird von der indigenen Bevölkerung Argentiniens und Paraguays als Beruhigungsmittel und Antidepressivum verwendet, aber die mit diesen Aktivitäten verbundenen Verbindungen wurden nicht bestimmt. Wir haben die Hauptbestandteile des hydroethanolischen Extrakts von A. polystachya durch Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie getrennt und identifiziert und das Vorhandensein von Acteosid, Isoacteosid, 6'-Acetylacteosid und 4',4''',5 bestätigt. 5''-Tetrahydroxy-6,6'',3'''-trimethoxy-[C7–O–C7'']-biflavon durch NMR-Spektroskopie. Hemmaktivitäten des hydroethanolischen Extrakts und gereinigtPhenylethanoidglykosidegegen Monoaminoxidase-A wurden unter Verwendung eines standardmäßigen fluorometrischen Assays bewertet. Der hydroethanolische Extrakt hemmte die Monoaminoxidase-A-Aktivität dosisabhängig mit einem IC50-Wert von 9,2 µg/ml, während der selektive Monoaminoxidase-Hemmer Clorgylin einen IC50-Wert von 0,06 µg/ml aufwies ( 0,22 µM).Acteosidwar der stärkste Inhibitor der Monoaminoxidase-A (IC50-Wert von 5 µM), während Isoacteosid und 6'-Acetylacteosid IC50-Werte von etwa 10 µM aufwiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass festgestellt wurde, dass Phenylethanoide aus einem hydroethanolischen Extrakt von A. polystachya eine inhibitorische Aktivität gegen Monoaminooxidase-A aufweisen. Es ist wahrscheinlich, dass die Wirkungsweise der Acteoside vielseitig ist und die Herunterregulierung von Entzündungsmolekülen und die Neutralisierung von Oxidationsreaktionen sowie die Hemmung der Monoaminooxidase-A umfasst.

Einführung

Laut einem aktuellen Bericht der Weltgesundheitsorganisation [1] leiden mehr als 320 Millionen Menschen (4,4 Prozent der Weltbevölkerung) an Depressionen und Angststörungen, wobei jährlich etwa 800.000 Selbstmorde aufgrund dieser psychischen Probleme begangen werden . Obwohl Behandlung mit synthetischen Antidepressiva

verfügbar ist, leiden viele Patienten unter Nebenwirkungen wie Mundtrockenheit, Verstopfung, Schwindel, verschwommenem Sehen, gesteigertem Appetit, Gewichtszunahme, Schlaflosigkeit und Nierenproblemen [2]. Aus diesem Grund wurden Ansätze der Komplementär- und Alternativmedizin, einschließlich der Phytotherapie, bei der Behandlung verschiedener Arten von psychischen Störungen eingesetzt [3].

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Verschiedene präklinische und klinische Studien haben den Nutzen pflanzlicher Arzneimittel bei der Behandlung allgemeiner und spezifischer Angststörungen belegt [4, 5]. Von besonderem Interesse sind Untersuchungen zu den anxiolytischen Eigenschaften von Aloysia polystachya (Griseb.) Moldenke (Verbenaceae), einer aromatischen Art, die hauptsächlich in Argentinien und Paraguay vorkommt. Laut ethnopharmakologischen Studien verwendet die lokale Bevölkerung die Pflanze, die allgemein als Burrito bekannt ist, als verdauungsförderndes, beruhigendes und antidepressives Tonikum [6, 7]. Obwohl die anxiolytischen und antidepressiven Eigenschaften von hydroethanolischen Extrakten aus A. polystachya durch vorklinische Studien bestätigt wurden [8–10], wurden keine phytochemischen Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, die mit diesen Aktivitäten verbundenen Verbindungen zu identifizieren.

Es wurde bereits früher gezeigt, dass die antidepressive Aktivität einiger Heilpflanzen, zum Beispiel Hypericum perforatum L. (Hypericaceae) und Peganum harmala L. (Nitrariaceae), mit der Hemmung der Monoaminoxidase-A (MAO-A) verbunden ist [11 –13]. Die MAO-Familie ist über das zentrale und periphere Nervensystem verteilt, und die Überexpression dieser Enzyme fördert die oxidative Desaminierung von Monoaminen mit einer Verringerung der Spiegel der Neurotransmitter Serotonin, Noradrenalin und Dopamin, was zum Auftreten von psychiatrischen Störungen führt. Bei solchen Desaminierungsprozessen entstehen auch Substanzen wie Wasserstoffperoxid, sauerstofffreie Radikale und Aldehyde, die für den oxidativen Stress der Zellen verantwortlich sind. MAOs existieren in zwei Hauptisoformen, die sich hinsichtlich Verteilung, Substratspezifität und Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren unterscheiden. Die Isoform MAO-A spielt eine wichtige Rolle bei Depressionen und Angststörungen, während MAO-B an neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt ist [13–17].

In Anbetracht des oben Gesagten stellten wir die Hypothese auf, dass die anxiolytischen und antidepressiven Eigenschaften von A. polystachya zumindest teilweise auf das Vorhandensein von MAO-A-Inhibitoren zurückzuführen sind. Um diese Hypothese zu testen, identifizierten wir die aktiven Prinzipien, die in dem hydroethanolischen Extrakt aus Blättern von A. polystachya vorhanden sind, und bewerteten die Wirkungen des Rohextrakts und der daraus isolierten Hauptbestandteile auf die MAO-A-Aktivität.

Resultate und Diskussion

Der hydroethanolische Extrakt aus Blättern von A. polystachya wurde einer Ultra-Performance-Liquid-Chromatographie-Massenspektrometrie (UPLC-MS) unterzogen, und das so erhaltene Chromatogramm ist in ▶Abb. 1a. Die Hauptbestandteile des Extrakts wurden durch Säulenchromatographie und Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) gereinigt und als identifiziertActeosid(syn verbascosid), Isoacteosid, 6'-acetylacteosid und 4',4''',5,5''-tetrahydroxy-6,6'',3'''-trimethoxy-[C7–O– C7'']-Biflavon durch Vergleich ihrer 1H- und 13C-NMR-, HSQC-, HMBC- (▶Tabelle 1S, 2S, Hintergrundinformationen) und MS-Daten (▶Abb. 1b-e) mit Werten aus der Literatur [18 –20]. Die Konzentration vonActeosidim hydroethanolischen Extrakt, bestimmt durch HPLC, betrug 108,65 ± 1,3 ug/mg getrockneter Extrakt. Dies stellt die erste Aufzeichnung der Bestandteile von Extrakten aus Blättern von A. polystachya dar, obwohl das ätherische Öl der Pflanze zuvor analysiert wurde und festgestellt wurde, dass es die Monoterpene Carvon und Limonen als Hauptbestandteile enthält [21].

Der hydroethanolische Rohextrakt aus Blättern von A. polystachya hemmte die MAO-A-Aktivität dosisabhängig (▶Abb. 2a) mit einer IC50 von 9,2 µg/mL, während der selektive MAO-Hemmer Clorgylin eine IC5 aufwies 0 von 0,06 µg/ml (0,22 µM). Die gereinigtAkteosidezeigte auch hemmende Aktivitäten gegen MAO-A (▶Abb. 2b), wobei Acteosid den niedrigsten IC50-Wert von 5 µM (3,1 µg/mL) aufwies, gefolgt von Isoacteosid mit einem IC50 von 10,1 µM (6,3 µg/mL) und 6'- Acetylacteosid mit einem IC50 von 9,5 µM (6,3 µg/mL). Die Hemmung von MAO-A führt zur Wiederherstellung der Spiegel von Serotonin, Noradrenalin, Dopamin und Tyramin, die wichtige Neurotransmitter bei der Kontrolle von Angstzuständen und Depressionen sind [16]. Somit erklärt das Vorhandensein verschiedener MAO-A-Hemmer in Blättern von A. polystachya zumindest teilweise die zuvor berichtete antidepressive und anxiolytische Aktivität der Spezies [8–10].

Die Verwendung von Mehrkomponenten-Pflanzenmischungen kann bei der Behandlung von Krankheiten komplexer Ätiologie, wie Angst, Depression und anderen neurologischen Zuständen, vorteilhaft sein. Derzeit basiert die Verwendung von Phytopharmaka bei der Behandlung von Krankheiten, die das Nervensystem betreffen, auf dem Paradigma von Multi-Target-gerichteten Liganden,

dh Arzneimittel mit Multi-Target-Aktivitäten, die aus der Anwesenheit von Substanzen wie Polyphenolen mit entzündungshemmenden, antioxidativen und MAO-hemmenden Eigenschaften resultieren, die in der Lage sind, Neuroprotektion zu verleihen [20, 22–25].

Es ist jedoch erwähnenswert, dass der polare Charakter polyphenolischer Substanzen Wechselwirkungen mit ihren molekularen Zielen behindern könnte. Dennoch haben klinische Studien gezeigt, dass der Kontakt zwischen Polyphenolen und unpolaren Sekundärmetaboliten, die in den Extrakten vorhanden sind, die Permeabilität von Zellmembranen verändern und die Aufnahme polarer Verbindungen erleichtern kann [23]. Somit erzeugen komplexe Pflanzenextrakte, die Multi-Target-Wirkstoffe enthalten, die mit ihren Rezeptoren auf pleiotrope Weise interagieren, einen pharmakologischen Synergismus, der zahlreiche Prozesse beeinflusst, einschließlich der Bewegung polarer Metaboliten durch Zellmembranen. Li et al. [26] verwendeten ein Zebrafischmodell, um dies zu demonstrierenActeosiddie Blut-Hirn-Schranke durchdringen könnten, und schlugen vor, dass das Phenylethanoidglykosid eine potenzielle therapeutische Wirkung bei der Parkinson-Krankheit haben könnte.

Monoaminerge Neurotransmitter sind die Hauptziele moderner Antidepressiva, da ihr Mangel für die schwächenden Symptome der Depression verantwortlich ist. Eine kürzlich durchgeführte In-vivo-Studie zeigte, dass die ethanolischen und wässrigen Extrakte von Lippia citriodora (Verbenaceae) und deren HauptbestandteilActeosidzeigten anxiolytische, hypnotische und muskelrelaxierende Wirkungen, und diese Eigenschaften wurden teilweise einer Wechselwirkung mit dem Typ-A-Gamma-Aminobuttersäure (GABAA)-Rezeptor zugeschrieben [27].

Klinische Studien haben gezeigt, dass Medikamente mit der Fähigkeit, entzündliche Zytokine wie TNF- oder andere Komponenten des Entzündungssignalwegs, wie z. B. Cyclooxygenase-2 (COX-2), zu blockieren, wirksam bei der Reduzierung sind depressive Symptome bei Patienten mit rheumatoider Arthritis, Psoriasis und Krebs sowie bei Patienten mit schweren psychiatrischen Störungen [28]. In diesem Zusammenhang wurde darüber berichtetActeosidkann die Produktion und Freisetzung von Entzündungsmolekülen wie Stickoxid (NO), TNF- und Interleukin 12 (IL-12) in Lipopolysaccharid/Interferon-Gamma (LPS/IFN-)-stimulierten Makrophagen abschwächen [29] , sowie Histamin und Arachidonsäure in RBL-2H3-Mastzellen [30]. Zusätzlich,Acteosidist in der Lage, die Spiegel von TNF-, IL-1, IL-8, IL-6 und NO zu senken und Caspase-1, Kernfaktor-kappa-B, zu aktivieren

(NF-κB), NO-Synthase und Aktivatorprotein-1 [31], induziert durch IL-32 und/oder LPS in TH-1-Zellen und Makrophagen [32].

Einige dieser Entzündungsmediatoren, wie IFNs, IL-6, IL-8 und IL-1, wurden in abnormalen Konzentrationen sowohl in peripheren als auch postmortalen Gewebeproben von depressiven Personen gefunden , und wurden mit den Symptomen einer Depression in Verbindung gebracht [33]. Die Aktivierung dieser Moleküle durch psychosoziale Stressoren kann signifikante funktionelle Veränderungen im Gehirn fördern, die zur Entwicklung von depressivem Verhalten und anderen psychiatrischen Störungen führen. Beispielsweise können IFNs, IL-1 und TNF- die Expression und Funktion von Serotonin-, Noradrenalin- und Dopaminrezeptorpumpen erhöhen und so die Verfügbarkeit dieser Neurotransmitter im synaptischen Spalt verringern [28]. Darüber hinaus können IFN-, IL-6, TNF- und oxidativer Stress Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) aktivieren, ein Enzym, das für den Abbau von Tryptophan verantwortlich ist, und dadurch die Konzentration des primären Vorläufers von verringern Serotoninsynthese [34].

Acteosid, Isoacteosid und 6'-Acetylacteosid enthalten Hydroxyphenylethyl- und Caffeoyl-Einheiten, von denen bekannt ist, dass sie mit antioxidativen Eigenschaften in Verbindung gebracht werden [35, 36], und Acteosid selbst weist eine beträchtliche antioxidative Aktivität auf [37]. Das haben Studien gezeigtActeosidhemmt die Aggregation von -Amyloid-Peptid (A) in dosisabhängiger Weise, fungiert als neuroprotektives Mittel und verbessert das Gedächtnis, und diese Eigenschaften wurden der antioxidativen Aktivität des Mittels zugeschrieben [38, 39]. In Anbetracht dessen, dass zahlreiche phenolreiche Arten mit antioxidativen Eigenschaften bei der Behandlung von neurologischen Störungen verwendet werden [15], wurde vermutet, dass die antidepressiven und anxiolytischen Wirkungen derPhenylethanoidglykosideisoliert aus A. polystachya, kann auch aus ihren antioxidativen Aktivitäten resultieren. Diese Annahme wurde von Xu et al. [40], die Beweise für die Beziehung zwischen erhöhtem oxidativem Stress und Depression/Angst vorlegten.

Auf der Grundlage des oben Gesagten schließen wir, dass die antidepressiven Eigenschaften des hydroethanolischen Extrakts aus Blättern von A. polystachya und der daraus isolierten gereinigten Phenylethanoide durch Multi-Target-Wirkungsmechanismen erklärt werden können, die die Hemmung von MAO-A, Herunterregulierung von MAO-A beinhalten Entzündungsmoleküle und Neutralisierung von Oxidationsreaktionen. Daher unterstützen die hier präsentierten Ergebnisse unsere ursprüngliche Hypothese, dass die anxiolytischen und antidepressiven Aktivitäten des hydroethanolischen Extrakts von A. polystachya zumindest teilweise aus der Hemmung von MAO-A resultieren. Allerdings ist die Struktur-Wirkungs-Beziehung derPhenylethanoidglykosideDas in dieser Studie identifizierte Molekül erfordert weitere Aufmerksamkeit, damit neue Moleküle für die Behandlung spezifischer neurologischer Erkrankungen entwickelt werden können.

Materialen und Methoden

Pflanzenmaterial

Blätter von A. polystachya wurden im Januar 2016 auf der Farmácia da Natureza da Terra de Ismael (Jardinópolis, SP, Brasilien) geerntet. Pflanzenmaterial wurde von Dr. Lúcia Rossi (Instituto Botânico, São Paulo, SP, Brasilien) identifiziert. und ein Belegexemplar wurde im Herbarium of Medicinal Plants bei UNAERP mit Belegnummer hinterlegt

HPM-1213.

HPM-1213. Die Genehmigung zur Bewertung der Bioaktivitäten der Extrakte aus brasilianischen Pflanzen wurde vom Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis ​​(Nr. 02001.005074/ 2011-19) erteilt.

Herstellung des hydroethanolischen Extrakts von Aloysia polystachya

Blätter (1000 g) wurden 72 h in einem Umluftofen bei 45 Grad getrocknet, pulverisiert und durch ein 40--Maschensieb passiert. Das pulverisierte Material wurde 7 Tage in Wasser:Ethanol (20:80; v/v) eingeweicht und anschließend durch Whatman Nr. 41 Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt und zur Ausbeute lyophilisiert

130,2 g trockener Rohextrakt, was ein Drogenextraktverhältnis von 7,6:1 ergibt.

Trennung und Identifizierung von Bestandteilen durch Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie

Chromatographische Analysen wurden unter Verwendung eines Acquity UPLC H-Class-Systems von Waters, ausgestattet mit einem Diodenarray-Detektor (DAD) und einem Xevo TQ-S-Tandem-Quadrupol-Massenspektrometer von Waters mit einer Z-Spray-Quelle, die im negativen Ionenmodus betrieben wurde, durchgeführt. Stammlösungen mit 1,0 mg/ml Extrakt oder den StandardsActeosid, Isoacteosid, 6'-Acetylacteosid und 4',4''',5,5''-Tetrahydroxy-6,6'',3'''- Trimethoxy-[C7–O–C7''] -Flavone in Methanol von LC-Qualität wurden separat hergestellt, mit Beschallung für jeweils 3 0 min, falls erforderlich, und durch 0,45 μm Millipore-Filter (Merck Millipore) filtriert. Lösungen wurden mit Methanol auf 10 µg/ml verdünnt und Aliquots (5 µl) wurden auf eine Sigma-Aldrich Ascentis Express C18-Säule (100 × 4,6 mm ID; 2,7 µm Partikelgröße). Die mobile Phase bestand aus Wasser mit 0,1 % Ameisensäure (Lösungsmittel A) und Methanol mit 0,1 % Ameisensäure (Lösungsmittel B), zugeführt mit einer Flussrate von 0,5 ml/min gemäß dem Elutionsprofil: isokratisch mit 3 % B zwischen 0 und 4 min, gefolgt von linearen Gradienten von 3 bis 60 % B zwischen 4 und 19 min und von 60 bis 90 % B zwischen 19 und 23 min und schließlich zurück zu 3 % B zwischen 23 und 28 min. Der Ausfluss wurde durch DAD im Bereich von 210 bis 720 nm und durch MS mit den optimierten Quellen- und Betriebsparametern wie folgt überwacht: Kapillarspannung

Alter 2,50 kV, Z-Spray-Quellentemperatur 150 Grad, Desolvationstemperatur (N2) 350 Grad, Desolvatationsgasfluss 600 l/h und Massenbereich von m/z 150 bis 600 im Vollabtastmodus.

Reinigung von identifizierten Bestandteilen

Der rohe hydroethanolische Extrakt (10 g) wurde in Wasser:Ethanol (50:50; V/V) gelöst und nacheinander gegen Hexan, Ethylacetat und n-Butanol aufgetrennt. Die Butanolfraktion wurde auf einem Rotationsverdampfer konzentriert und eine 3-g-Probe des fraktionierten Extrakts wurde auf eine Glassäule (10 × 3 cm od) aufgetragen, die mit C-18-RP-Kieselgel (230-400-Mesh; Sigma -Aldrich) und mit Wasser eluiert, gefolgt von aufeinanderfolgenden Mischungen aus Wasser:Methanol (90:10, 50:50 und 10:90; v/v). Die durch Elution mit Wasser:Methanol (90:10; v/v) erhaltene Unterfraktion wurde durch RP-HPLC unter Verwendung eines Shimadzu LC-20AP-Systems, das mit einem SPD-20A-UV/Vis-Detektor gekoppelt war, weiter gereinigt und ausgestattet mit einer Phenomenex Luna® C-18-Säule (250 × 10 mm ID; 5 μm Partikelgröße). Die mobile Phase war Wasser:Methanol, beginnend bei 90:10 (v/v) und sich ändernd auf 30:70 (v/v) in 100 min, um die vier bekannten Verbindungen zu ergebenActeosid(750 mg), Isoacteosid (430 mg), 6'-Acetylacteosid (42 mg) und 4',4''',5,5''-tetradroxy-6,6'',3''' -Trimethoxy-[C7–O–C7'']-flavon (13 mg). Die Flussrate der mobilen Phase betrug 1 ml/min, das Injektionsvolumen betrug 500 μl, das Chromatogramm wurde bei 340 nm aufgenommen und UV-Spektren wurden im Bereich von 240 bis 400 nm erhalten. Die Identität der gereinigten Bestandteile wurde durch ihre 1H- (500 MHz) und 13C-NMR-Spektren (125 MHz), aufgenommen mit einem Bruker-Spektrometer, Modell DPX 500, und Vergleich der Daten mit denen in der Literatur [18, 19, 41]. Die Reinheiten der isolierten Verbindungen wurden durch UPLC-DAD-MS (▶Abb. 1b–d) und NMR (▶Abb. S1–S12, Hintergrundinformationen) bestätigt.

Quantifizierung von Acteosid durch ein HPLC-DiodenarrayDetektor

Diese Lösung wurde auf einem Shimadzu LC{{{{10}}}}APvp-System analysiert, das mit einem SPD-M10Avp DAD gekoppelt und mit einer Phenomenex Luna C18-Säule (250 × 4,6 mm) ausgestattet war id, 5 µm), geschützt durch eine Phenomenex C18-Vorsäule (4,0 × 3,0 mm id, 5 µm). Die Trennungen wurden bei Raumtemperatur (22 ± 1 Grad) unter Verwendung einer mobilen Phase durchgeführt, die 0,1 % Essigsäure in Wasser (Lösungsmittel A) und Methanol (Lösungsmittel B;

JT Baker HPLC Grade) geliefert mit einer konstanten Flussrate von 1,0 ml/min gemäß dem Programm: linearer Gradient von 10 bis 70 % B zwischen 0 und 32 min, von 70 bis 10 Prozent B zwischen 32 und 35 min und eine abschließende isokratische Elution mit 10 Prozent B zwischen 35 und 40 min. Die Detektionswellenlänge wurde auf 330 nm eingestellt.

Der Gehalt an Acteosid im Extrakt wurde unter Verwendung von geschätztActeosid(Sigma-Aldrich; CAS-Nr. 61276-17-3) als externer Standard. Lösungen, die 500, 250, 125, 62,5, 31,2 und 15,6 ug/ml des Referenzstandards enthielten, wurden hergestellt, und Kalibrierungskurven wurden erstellt, indem jede Lösung dreifach einer HPLC-Analyse unterzogen wurde [42 ]. Das Verhältnis der Peakfläche des Standard-Acteosids zur entsprechenden Konzentration des Analyten wurde durch lineare Regression der Standardkurven ermittelt (▶Abb. S13, Hintergrundinformationen). Analytische Daten wurden hinsichtlich Linearität, Präzision und Genauigkeit gemäß den Richtlinien der Agência Nacional de Vigilância Sanitária [42] validiert. Die Nachweisgrenzen (LoD) und Quantifizierungsgrenzen (LoQ) von Acteosid betrugen 0,30 bzw. 0,92 µg/ml.

Monoaminoxidase-A-Inhibitionsassays

Rekombinantes menschliches MAO-A, Tyramin, Clorgylin, Vanillinsäure, 4--Aminoantipyrin und Meerrettichperoxidase wurden von Sigma-Aldrich bezogen. MAO-A-Inhibitionsassays wurden unter Verwendung von 96--Well-Platten nach einer modifizierten Version des von López et al. beschriebenen Verfahrens durchgeführt. [43]. Jede Vertiefung wurde mit 5 0 μl chromogener Lösung (0,8 mM Vanillinsäure, 2,5 mM 4- Aminoantipyrin und 4 U/ml Meerrettichperoxidase in Phosphatpuffer bei pH 7,6), 100 μl 3 beladen mM Tyramin und ein 50- μl-Aliquot des rohen hydroethanolischen Extrakts oder eines der gereinigten Phenylethanoide, gelöst in Methanol. Schließlich wurden 50-ul-Aliquots von 8 U/ml MAO-A zu jeder der Vertiefungen hinzugefügt und die Platte wurde bei 37 Grad für 30 min inkubiert, während dieser Zeit wurden die Extinktionen alle 5 min unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts aufgezeichnet. Clorgylin (größer als oder gleich 97 Prozent GC; Sigma-Aldrich) und Methanol wurden als Positiv- bzw. Negativkontrollen auf jeder Testplatte mitgeführt.

statistische Analyse

Es wurden drei unabhängige Bewertungen der MAO-A-Hemmaktivitäten durchgeführt und die erfassten Daten mit der Graph-Pad Prism-Software analysiert. Die IC50-Werte des hydroethanolischen Extrakts, der gereinigten Phenylethanoide und der positiven Kontrolle wurden durch nichtlineare Regression berechnet, wobei graphische Darstellungen von log (Inhibitorkonzentration) gegen die normalisierte prozentuale Inhibition simuliert wurden.

Zusätzliche Informationen

H- und 13C-NMR-Spektren vonActeosid, Isoacteosid, 6'-Acetylacteosid und 4',4''',5,5''-Tetrahydroxy-6,6'',3'''-trimethoxy-[C7–O– C7''] -Flavone und HSQC/HMBC-Korrelationsanalysen für die drei Phenylethanoide sind als Hintergrundinformationen verfügbar.

erhalten am 04.06.2018

überarbeitet 19.10.2018

angenommen 24.10.2018

Literaturverzeichnis

DOI https://doi.org/10.1055/a-0787-1665

Planta Med Int Open 2019; 6: e1–e6

© Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York ISSN 2509-9264

Korrespondenz

Ana Maria S. Pereira

Departamento de Biotecnologia em Plantas Medicinais

Universidade de Ribeirão Preto Av. Costábile Romano 2201 14096-900 Ribeirânia

Ribeirão Preto, SP

Brasilien

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