Phenylethanoid-Oligoglykoside und acylierte Oligozucker mit gefäßerweiternder Aktivität aus Cistanche Tubulosa

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Masayuki Yoshikawaet al

Abstrakt

Der methanolische Extrakt aus den getrockneten Stielen vonCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight zeigte in isolierten Aortenstreifen von Ratten eine hemmende Wirkung auf durch Noradrenalin induzierte Kontraktionen. Aus dem Extrakt wurden neue Phenylethanoid-Aminoglykosid-Bestandteile, Kankanoside F und G, und ein acylierter Oligozucker, Kankanose, zusammen mit 14 bekannten Verbindungen isoliert. Die Strukturen dieser neuen Verbindungen wurden auf der Grundlage ihres chemischen und physikalisch-chemischen Nachweises bestimmt. Außerdem zeigten die Hauptbestandteile Kankanosid F, Kankanose, Echinacosid, Acteosid und Cistanosid F gefäßerweiternde Aktivität, und mehrere strukturelle Voraussetzungen für die Aktivität wurden geklärt. 2006 Elsevier Ltd. Alle Rechte vorbehalten.

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Einführung

Die Parasitenpflanze Orobanchaceae,Cistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight, ist weit verbreitet in Nordafrika, Arabien und asiatischen Ländern, und die Stämme vonCistanche tubulosa, sowie C. salsa und C. deserticola, wurden traditionell als Mittel zur Förderung der Blutzirkulation und zur Behandlung von Impotenz, Sterilität, Hexenschuss, Körperschwäche und Stärkungsmittel verwendet.2,3 Medikamente1,4–14 haben wir über die Isolierung und Strukturaufklärung von fünf Iridoiden, Kankanosiden A–D und Kankanol, und einem Monoterpenglykosid, Kankanosid E, zusammen mit 16 bekannten Verbindungen aus den Stämmen von berichtetCistanche tubulosa1 Als Fortsetzung der Studie zu diesem pflanzlichen Arzneimittel wurde festgestellt, dass der ethanolische Extrakt eine hemmende Wirkung auf durch Noradrenalin induzierte Kontraktionen in isolierten thorakalen Aortenstreifen von Ratten zeigte. Aus diesem Methanolextrakt isolierten wir zusätzlich Phenylethanoid-Oligoglykoside, Kankanoside F (1) und G (2) und anacylierten Oligozucker, Kankanose (3) und 14 bekannte Verbindungen, Echinacosid (4), Acteosid (5), Isoacteosid (6). ),20-Acetylacteosid (7), Tubuloside A (8) und B (9), Cistanosid F (10), Salidrosid (11), (2R,3R)-Butan-2,{{18 }}Diol 2-ObD-Glucopyranosid,Meso-Butan-2,3-Diol2-ObD-Glucopyranosid, Ethyl-bD-Glucopyranosid,3-Methylbutanol-bD-Glucopyranosid, ( plus )-Pinoresinol40-ObD -Glucopyranosid und ( plus )-Syringaresinol 40-ObD-Glucopyranosid. Diese Arbeit befasst sich mit der Strukturaufklärung neuer Verbindungen (1–3) sowie den gefäßerweiternden Wirkungen der Hauptbestandteile (1, 3–6, 10 und 11) auf Kontraktionen, die durch Noradrenalin in isolierten Rattenaortenstreifen induziert werden, basierend auf der traditionellen Anwendung für Blutkreislauf (Abb. 1).

Resultate und Diskussion

2.1. Vasorelaxierende Wirkung von methanolischem Extrakt aus Stängeln vonCistanche tubulosaüber die durch Noradrenalin induzierte Kontraktion in der isolierten Brustaorta der Ratte

Wie in Tabelle 1 gezeigt, wird der methanolische Extrakt aus den Stämmen vonCistanche tubulosa(gekauft in Urumqi, Provinz Xinjiang, China) zeigte in isolierten Rattenaortenstreifen zeit- und konzentrationsabhängig eine vasorelaxierende Wirkung auf durch Noradrenalin induzierte Kontraktionen(30–3{{10}} 0 lg/ml). Der methanolische Extrakt wurde durch Normal- und Umkehrphasen-Säulenchromatographie und schließlich HPLC weiter gereinigt, um 1 (0.016 Prozent), 2(0.{{31}) zu ergeben. }25 Prozent ), 3 (0.020 Prozent ), 4 (3.09 Prozent ),3 5 ({{64} },68 Prozent),3 6(0,096 Prozent),3 7 (0,017 Prozent),3 8 (0,052 Prozent), 3 9 (0,0036 Prozent), 3 10 (0,025 Prozent), 15 11 (0,044 Prozent), 16 (2R,3R)-Butan-2, {{44 }}Diol2-ObD-Glucopyranosid (0,0087 Prozent),17 meso-Butan-2,3-Diol 2-ObD-Glucopyranosid (0,0065 Prozent),17 Ethylb-D- Glucopyranosid (0,055 Prozent), 17 3-Methylbutanol, bD-Glucopyranosid (0,0030 Prozent),17 (plus)-Pinoresinol 40-ObD-Glucopyranosid (0,016 Prozent),18 und (plus)-Syringaresinol{{81} }ObD-Glucopyranosid (0,022 Prozent).15

2.2. Strukturen der Kankanoside F (1) und G (2)

Kankanosid F (1) wurde als weißes Pulver mit negativer optischer Drehung (½a -28D -44.8- in MeOH) erhalten. Das IR-Spektrum von 1 zeigte Absorptionsbanden bei 156{{69} }, 1508 und 1458 cm-1, die einem aromatischen Ring zuzuschreiben sind, und starke Absorptionsbanden bei 3432, 1075 und 1044 cm-1, was auf eine Aminoglykosidstruktur hindeutet Negativionen-FAB-MS von 1, quasimolekulare Ionenpeaks wurden bei m/z 647 (M plus Na) plus und 623 (MH) beobachtet, und eine hochauflösende FAB-MS-Analyse ergab, dass die Summenformel von 1 C26H40O17 ist. Die 1H- und 13C-NMR-Spektren (CD3OD, Tabelle 2) von 1, die durch verschiedene NMR-Experimente zugeordnet wurden,19 zeigten Signale, die zwei Methylenen zugeordnet werden konnten [d 2.78 (2H, m, H2-7), 3.70, 4.{{ 39}} (je 1H, beide m, H2-8)] und ortho- und meta-gekoppelte aromatische Protonen vom ABC-Typ [d 6.56 (1H, dd, J=1.9,7.9 Hz, H-6), 6,67 (1H, d, J=7,9 Hz, H-5), 6,69 (1H, d, J=1,9 Hz, H{ {64}})] zusammen mit drei Glucopyranose-Einheiten [d 4,30 (1H, d, J=8,0 Hz, H-10), 4,37 (1H, d, J=8). 0 Hz, H-1000), 5.16 (1H, br s, H-100)]. Die Aminoglycosidstruktur in 1 wurde durch ein Experiment zur heteronuklearen Mehrfachbindungskonnektivität (HMBC) charakterisiert, das langreichweitige Korrelationen zwischen den folgenden Protonen- und Kohlenstoffpaaren zeigte (H-10 und C-8; H-100 und C-30, H-1000 und C-60), wie in Abbildung 2 gezeigt. Die enzymatische Deacylierung von Echinacosid (4), dessen absolute Stereostruktur zuvor berichtet wurde,3 mit Tannase13,14 ergab 1. Auf der Grundlage der oben erwähnten Beweise wurde die Struktur von Kankanosid F als 2-(3,4- Dihydroxyphenyl)ethyl OaL-rhamnopyranosyl(1-3)[bD-glucopyranosyl(1-6)]-b-D-glucopyranosid (1).

Kankanosid G (2) wurde auch als weißes Pulver mit negativer optischer Drehung (½a-26D-35.0- in MeOH) erhalten. Das IR-Spektrum von 2 zeigte Absorptionsbanden bei 3432, 1709, 1638, 1518, 1447 und 1040 cm-1, zuschreibbar auf Hydroxyl-, konjugierte Estercarbonyl- und Etherfunktionen und einen aromatischen Ring. Die Summenformel, C29H36O14, von 2 wurde aus Positiv- und Negativionen-FAB-MS [m/z 631 (M plus Na) plus und 607 (MH)-] und durch hochauflösendes FAB-MS bestimmt. Die enzymatische Deacylierung von 2 mit Tannase ergab Cistanosid G(12), dessen absolute Stereostruktur zuvor beschrieben wurde.16 v/v), Kaffeesäure wurde durch HPLC-Analyse identifiziert. Die 1H- und 13C-NMR-Spektren (CD3OD, Tabelle 2)19 von 2 zeigten das Vorhandensein der folgenden Funktionen: 4-Hydroxyphenylethylalkohol-Teil {zweiMethylene [d 2,82 (2H, m, H2-7), 3,70, 3,96 ( jeweils 1H, beide m, H2-8)] und ortho-gekoppelte aromatische Protonen vom Typ A2B2- [d 6,65, 7,03 (jeweils 2H, beide d, J=8,6 Hz, H{ {62}},5 und H-2,6)]} und zwei Glucopyranose-Einheiten [d4.33 (1H, d, J=7.9 Hz, H-10), 5.19 (1H, br s, H-100)] zusammen mit einer Caffeoyl-Einheit {ein trans-Olefin [d 6.29,7.56 (jeweils 1H, beide d, J=15.9 Hz, H{{84 }} und H-7)] und Dihydroxybenzol vom Pyrocatechin-Typ [d 6,78 (1H, d,J=8,3 Hz, H-5), 6,89 (1H, dd, J {{ 96}}.9, 8.3 Hz, H-6),7.04 (1H, d, J=1.9 Hz, H-2)]}. Im HMBC-Experiment an 2 wurde eine langreichweitige Korrelation zwischen dem 60--Proton [d 4,36 (1H, dd, J=6.1, 11,6 Hz), 4,50 (dd, J {{ 119}}.8, 11,6 Hz)] und der Caffeoyl-Carbonylkohlenstoff (dC 169,1). Folglich wurde die Struktur von Kankanosid G als 4--Hydroxyphenyl-OaL-rhamnopyranosyl(1 ! 3)-(6-O-caffeoyl)-bD-glucopyranosid (2) bestimmt.

2.3. Struktur von Kankanose (3)

Kankanose (3), ½a- 27D-35.3- (MeOH), wurde ebenfalls als weißes Pulver erhalten. Das IR-Spektrum von 3 zeigte Absorptionsbanden bei 343{{30}}, 1702, 1639, 1611, 1458 und 1071 cm-1, die zuzuschreiben sind Hydroxyl-, konjugierte Estercarbonyl- und Etherfunktionen und ein aromatischer Ring. Das Positiv- und Negativionen-FAB-MS von 3 zeigte quasimolekulare Ionenpeaks bei m/z 673 (M plus Na) plus bzw. m/z 649 (MH). Das hochauflösende FAB-MS von 3 ergab die Summenformel C27H38O18. Alkalische Hydrolyse von 3 mit 10 Prozent KOH–50 Prozent wässrigem 1,4-Dioxan setzte Kaffeesäure frei, die durch HPLC-Analyse identifiziert wurde, zusammen mit einem Oligozucker. Die Säurehydrolyse dieses Oligozuckers mit 1,0 M Salzsäure (HCl) setzte L-Rhamnose und D-Glucose frei, die durch HPLC-Analyse unter Verwendung eines optischen Rotationsdetektors identifiziert wurden.1,13,14 Die 1H- und 13C-NMR-Spektren (CD3OD, Tabelle 3)19 von 3 zeigte Signale, die der Trisaccharideinheit {d [5,11 (d, J=3,4 Hz), 4,57 (d, J{=7,9 Hz), a- und b-Form-Mischung von H{ {52}} (ca. 1:1)], 4.25, 4.27 (beide d, J=7.7 Hz, H-1000), 5.13, 5.18 (beide br s, H{{66 }})} zusammen mit einer Caffeoylgruppe [d 6.28, 6.29 (beide d, J=15.9 Hz, H-9), 6.78 (d,J=8.0 Hz, H -5), 6.96 (dd, J=2.0, 8.0 Hz, H-6), 7.06(d, J=2.0 Hz, H{{90} }), 7,60 (d, J=15,9 Hz, H-7)]. In den HMBC-Experimenten an 3 wurden langreichweitige Korrelationen zwischen dem 40--Proton [d 5.04, 4.99 (beide dd,J=9.5, 9.8 Hz)] und dem Caffeoyl-Carbonyl-Kohlenstoff (dC168.53) beobachtet , 168,65). Auf der Grundlage der oben erwähnten Beweise wurde die Struktur von Kankanose zu bea-L-rhamnopyranosyl(1-3)[bD-glucopyranosyl(1-6)]-O-(4- O-Caffeoyl)-D-glucopyranose (3).

2.4. Gefäßrelaxierende Wirkung der Hauptbestandteile (1, 3–6, 10, 11) ausCistanche tubulosaauf die durch Noradrenalin und hohe K plus induzierte Kontraktion in der isolierten thorakalen Aorta von Ratten

Wie in Tabelle 4 und Abbildung 3 gezeigt, sind die Hemmwirkungen der Hauptbestandteile Kankanosid F (1) und Kankanose (3), Echinacosid (4), Acteosid (5), Isoacteosid (6), Cistanosid F (10) und Salidrosid ( 11) auf Noradrenalin-induzierte Kontraktionen in isolierten Rattenthorakalaorten untersucht. Als Ergebnis hemmten die Verbindungen 3–5 und 10 mit einer Caffeoylgruppe in der 40--Position signifikant die Kontraktionen, zeit- und/oder konzentrationsabhängig (10–100 lM), während 6 mit der 60- Die O-Caffeoyl-Einheit zeigte eine schwache Aktivität als 4 und 5. Andererseits zeigte die Verbindung 1 mit einer Catechol-Gruppe eine signifikante Hemmung, aber 11 mit einer Phenol-Gruppe zeigte keine solche Wirkung. Diese Ergebnisse führten uns zu der Annahme, dass die 40--O-Caffeoyl-Einheit und die 10--O-Dihydroxyphenethyl-Einheit für eine starke vasorelaxierende Aktivität wesentlich sind. Andererseits zeigten die Verbindungen 1, 3–6 und 10 (100 μM) im Unterschied zu Nifedipin, einem spannungsabhängigen Calciumkanalblocker, keine Wirkung auf Kontraktionen, die durch eine hohe Konzentration an Kaliumkation (hohes K plus ) ausgelöst wurden gleichen Geweben (Daten nicht gezeigt). Dieser Befund legte nahe, dass diese aktiven Bestandteile die Kontraktionen über den rezeptorgesteuerten Calciumkanal hemmten, aber nicht über den spannungsabhängigen Calciumkanal. Kürzlich berichteten Iizuka et al., dass ein Phenylethanoid, Forsythiasid, aus der Frucht von Forsythia suspensa die Noradrenalin-induzierten Kontraktionen in Ratten-Aortenring-Präparaten hemmte, und schlugen vor, dass die Hemmung der Noradrenalin-induzierten Kontraktion durch Forsythiasid teilweise auf einer Abnahme der Noradrenalin-induzierten Kontraktion beruht Kalziumeinstrom.20 In der vorliegenden Studie wurden jedoch die relaxierenden Wirkungen der aktiven Bestandteile ca. beobachtet. 30 min nach Zugabe von Noradrenalin auf andere Weise als Prazosin, einem Adrenalin-a1--Rezeptor-Antagonisten. Die Wirkungsmechanismen von Wirkstoffen müssen weiter untersucht werden.

3. Experimentell

3.1. Allgemeine experimentelle Vorgehensweise

Die folgenden Instrumente wurden verwendet, um physikalische Daten zu erhalten: spezifische Drehungen, Horiba SEPA-300 digitales Polarimeter (l=5 cm); UV-Spektren, Shimadzu UV-1600-Spektrometer; IR-Spektren, Shimadzu FTIR-8100-Spektrometer; 1 H-NMR-Spektren, JEOL JNM-LA500 (500 MHz) Spektrometer; 13C-NMR-Spektren, JEOLJNM-LA500 (125 MHz) Spektrometer mit Tetramethylsilan als internem Standard; FABMS und HR-FAB MS, JEOL JMS-SX 102A Massenspektrometer; HPLC-Detektor, Shimadzu RID-6A Brechungsindex und SPD 10A UV-Vis-Detektoren. HPLC-Säulen, YMC-PackODS-A-Säulen (250 · 4,6 mm Innendurchmesser) und (250 · 20 mm Innendurchmesser) wurden für analytische bzw. präparative Zwecke verwendet

Die folgenden experimentellen Bedingungen wurden für die Chromatographie verwendet: Normalphasen-Kieselgel-Säulenchromatographie, Kieselgel BW-200 (Fuji Silysia Chemical, Ltd., 150–350 mesh); Umkehrphasen-Kieselgel-Säulenchromatographie, Chromatorex ODS DM1020T (FujiSilesia Chemical, Ltd, 100–200 mesh); DC, vorbeschichtete DC-Platten mit Kieselgel 60F254 (Merck, 0,25 mm) (Normalphase) und Kieselgel RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm) (Umkehrphase); Umkehrphasen-HPTLC, vorbeschichtete TLC-Platten mit Kieselgel RP-18 WF254S (Merck, 0,25 mm); Der Nachweis erfolgte durch Besprühen mit 1 Prozent Ce(SO4)2–10 Prozent wässriger H2SO4, gefolgt von Erhitzen.

Cistanche tubulosa

3.2. Pflanzenmaterial

Getrocknete Stiele vonCistanche tubulosawurden im Januar 2005 in Urumqi, Provinz Xinjiang, China, über EishinTrading Co., Ltd, Osaka, Japan, wie zuvor beschrieben erworben.1

3.3. Extraktion und Isolierung

Fraktionen {{0}} (590 mg), 2-1 (466 mg), 2-3 (3931 mg), 3-3(3610 mg), 3-4 (190 mg), 4-5 [=Echinacosid (4, 2595 mg, 0,44 Prozent)], 4-6 (1635 mg), 5-2 (1114 mg), {{ 20}} (306 mg), 5-4 (347 mg), 5-5 (=4, 1620 mg, 2,03 Prozent) und 5-6 (1453 mg) wurden erhalten aus der methanolische Extrakt der StemsofCistanche tubulosawie zuvor berichtet.1 Fraktion 1–2 (590 mg) wurde durch HPLC [MeOH/H2O (35:65, v/v)] gereinigt, um 3-Methylbutanol-bD-glucopyranosid (18 mg , 0.0030 Prozent ), ( plus )-Pinoresinol 40-ObD-Glucopyranosid (96 mg, 0. 016 Prozent) und (plus)-Syringaresinol 40-O bD-Glucopyranosid (129 mg, 0.022 Prozent) zusammen Cistanochlorin (21 mg, {{ 76}}.{{80}}035 Prozent ). Fraktion 2-1 (466 mg) wurde durch HPLC [MeOH/H2O (5:95, v/v)] getrennt, um (2R,3R)-Butan-2,{{40 zu ergeben }}Diol 2-ObD-Glucopyranosid (12 mg, {{1{{108}}4}}.0087 Prozent), (2R, 3S)-Butan-2,3-Diol 2-ObD-Glucopyranosid (9 mg, 0.0065 Prozent) und Ethyl-bD -Glucopyranosid (76 mg, 0.055 Prozent) zusammen mit Uridin (0.0069 Prozent). Fraktion 2-2 (535 mg) wurde durch HPLC [MeOH/H2O (5:95, v/v)] gereinigt, um Salidrosid (11, 41 mg, 0,022 Prozent) zusammen mit Antirrhide (15 mg, 0,0079 Prozent) zu ergeben. und 6-Desoxycatalpol (214 mg, 0,11 Prozent). Fraktion 2-3 (535 mg) wurde durch HPLC [MeOH/H2O (5:95, v/v)] getrennt, um 11 (17 mg, 0,022 Prozent) zusammen mit Gluroseite (110 mg, 0,14 Prozent) und zu liefern Bartsiosid (164 mg, 0,21 Prozent). Die Fraktion 3-3 (510 mg) wurde einer HPLC [MeOH/H2O (40:60, v/v)] unterzogen, um Acteosid (5, 257 mg, 0,31 Prozent) zu ergeben. Isoacteosid (6, 79 mg, 0,096 %) und 20-acetylacteosid (7, 14 mg, 0,017 %). Fraktion 3-4 (190 mg) wurde durch HPLC [MeOH/H2O (40:60, v/v)] weiter gereinigt, um Kankanosid G (2, 17 mg, 0,0029 Prozent) und Tubulosid B (9, 21 mg, 0,0036) zu ergeben Prozent). Fraktion 4-6 (75 mg) wurde durch HPLC [MeOH/H 2 O (35:65, v/v)] gereinigt, um 5 (18 mg, 0,065 Prozent) zu ergeben. Fraktion 5-2 (1114 mg) wurde HPLC[MeOH/H2O (10:90, v/v)] unterzogen, um 2 (24 mg, 0,030 Prozent) zu ergeben. Fraktion 5-3 (306 mg) wurde gereinigt durch HPLC [MeOH/H2O (15:85, v/v)], um Kankanosid F (1, 13 mg, 0,016 Prozent) zu ergeben. Fraktion 5-4 (347 mg) wurde HPLC [MeOH/H2O (10:90, v/v)] unterzogen, um Kankanose (3, 30 mg, 0,038 Prozent) und Cistanosid F (10, 20 mg, 0,025) zu ergeben Prozent). Die Fraktion 5-6 (530 mg) wurde durch HPLC [MeOH/H2O (35:65, v/v)] gereinigt, um 4 (185 mg, 0,62 Prozent), 5 (91 mg, 0,30 Prozent) und Tubulosid A zu ergeben (8, 16 mg, 0,052 Prozent).

3.3.1. Kankanosid F (1).

Ein weißes Pulver, ½a{{0}}D -44.8- (c0.50, MeOH). Positiv-Ionen-FAB-MSm/z mit hoher Auflösung: Berechnet für C26H40O17Na (M plus Na) plus 647,2163. Gefunden: 647,2160. UV [MeOH, nm (log e)]: 224 (3,83), 283 (3,37). IR (KBr): 3432, 2940, 1560, 1508, 1458, 1075, 1044 cm-1. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: angegeben in Tabelle 2. 13 C-NMR-Daten (125 MHz, CD3OD) dC: angegeben in Tabelle 2. Positiv-Ionen-FAB-MS m/z: 647 (M plus Na) plus . Negativionen-FAB-MS m/z: 623 (MH) , 477 (M-C6H11O4)-, 623 (M-C6H11O5)-, 623(M-C12H21O9)-.

3.3.2. Kankanosid G (2).

Ein weißes Pulver, ½a{{0}}D -35.0-(c 0,80, MeOH). Hochauflösendes Positiv-Ionen-FAB-MSm/z: Berechnet für C29H36O14Na (M plus Na) plus 631,2003. Gefunden: 631,1996. UV [MeOH, nm (log e)]: 329 (4,10). IR (KBr): 3432, 2924, 1709, 1638, 1518, 1447, 1264, 1040 cm-1. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: angegeben in Tabelle 2. 13C-NMR-Daten (125 MHz, CD3OD) dC: angegeben in Tabelle 2. Positiv-Ionen-FAB-MS m/z: 631 (M plus Na) plus .Negativ-Ion FAB-MS m/z: 607 (MH)-, 461 (M-C6H11O4).

3.3.3. Kankanose (3).

Ein weißes Pulver, ½a{{0}}D -35.3- (c0.50, MeOH). Hochauflösendes Positiv-Ionen-FAB-MSm/z: Berechnet für C27H38O18Na (M plus Na) plus 673,1956. Gefunden: 673,1959. UV [MeOH, nm (log e)]: 219 (4,10), 247 (3,96), 333 (4,21). IR (KBr): 3430, 2962, 1702, 1639, 1611, 1458, 1264, 1071 cm-1. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) d: angegeben in Tabelle 3. 13 C-NMR-Daten (125 MHz, CD3OD) dC: angegeben in Tabelle 3. Positiv-Ionen-FAB-MS m/z: 673 (M plus Na) plus . Negativ-Ionen-FABM-Sm/z: 649 (MH) , 487 (M-C9H8O3)-, 325(M-C15H18O8)-.

Cistanche tubulosa

3.4. Enzymatische Deacylierung von 2 und 4 mit Tannase

Eine Lösung von 2 (4,8 mg, 0.008 mmol) in H2O (1,0 mL) wurde mit Tannase (3,7 mg, aus Aspergillus oryzae) behandelt , Wako Pure Chemical Ind., Ltd., Osaka, Japan) und die Lösung wurde 24 h bei 37 Grad gerührt. Nachdem EtOH zu der Reaktionsmischung gegeben worden war, wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch HPLC [MeOH/H 2 O (35:65, v/v)] gereinigt, um Cistanosid G (12, 2,8 mg, 80 Prozent) zu liefern Bei einem ähnlichen Verfahren wurde eine Lösung von 4 (9,2 mg, 0,012 mmol) in H 2 O (2,0 ml) mit Tannase (7,5 mg) behandelt und die Lösung bei 37 Grad für 24 h gerührt. Die Aufarbeitung der Reaktionsmischung wie oben beschrieben ergab einen Rückstand, der durch HPLC [MeOH/H 2 O (15:85, v/v)] gereinigt wurde, um 1 (4,7 mg, 62 Prozent) zu liefern.

3.5. Alkalische und saure Hydrolyse von 2 und 3

Eine Lösung von 2 und 3 (jeweils 3,5 mg) in 5{8}}-prozentigem wässrigem 1,4--Dioxan (1,0 ml) wurde mit 10-prozentiger wässriger KOH behandelt (1,{{30}} mL) und das Ganze wurde 1 h bei 37°C gerührt. Die Entfernung des Lösungsmittels unter reduziertem Druck ergab eine Reaktionsmischung, die einer HPLC-Analyse unterzogen wurde [Säule: YMC-Pack ODS-A, 250 · 4,6 mm id; mobile Phase: MeOH/H2O (30:70, v/v); Detektion: UV (254 nm); Flussrate: 1,0 ml/min], um Kaffeesäure zu identifizieren (tR: 13,1 min). Dann wurde die Reaktionsmischung aus 3 in 1 M HCl (2,0 ml) gelöst und 3 h unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionsmischung mit EtOAc extrahiert. Die wässrige Schicht wurde jeweils einer HPLC-Analyse unter den folgenden Bedingungen unterzogen: HPLC-Säule, KaseisorbLC NH2-60-5, 250 · 4,6 mm Innendurchmesser (Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokio, Japan); Detektion, optische Rotation [ShodexOR-2 (Showa Denko Co., Ltd, Tokyo, Japan); mobile Phase, CH3CN/H2O (85:15, v/v); Flussrate 0,8 ml/min]. Die Identifizierung der in der wässrigen Schicht vorhandenen L-Rhamnose und D-Glucose erfolgte durch Vergleich ihrer Retentionszeit und optischen Drehung mit denen echter Proben, tR: 9,9 min (L-Rhamnose, negative optische Drehung) und 17,9 min (D-Glucose, positive optische Drehung).

3.6. Vasorelaxierende Wirkung

3.6.1. Gewebevorbereitung.

Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250–350 g wurden getötet, indem beide Halsschlagadern unter Anästhesie durchtrennt wurden, und die Brustschlagader wurde isoliert und in spiralförmige Streifen (2–3 mm ·15–2{{25 }}mm). Physiologische Salzlösung enthielt NaCl (118,0 mM), KCl (4,7 mM), KH2PO4 (1,2 mM), MgSO4 (1,2 mM), CaCl2 (2,5 mM), NaHCO3 (25,0 mM) und D-Glucose (10,0 mM). Die Lösung wurde mit einem Gasgemisch aus 95 Prozent O2 und 5 Prozent CO2 belüftet und auf 37 Grad gehalten. Zur Untersuchung der mechanischen Reaktion wurde jede Präparation in einem Organbad (6 ml) suspendiert und einer Anfangsbelastung von etwa 1 g ausgesetzt. Vor Beginn der Experimente wurde eine Äquilibrierungsperiode von einer Stunde zugelassen. Kontraktionen wurden isometrisch über einen Kraft-Weg-Wandler (AD Instruments) gemessen und auf einem Polygraphen aufgezeichnet.

3.6.2. Hemmende Wirkung auf die durch dl-Noradrenalin oder hohes K plus induzierte Kontraktion.

Nach der Äquilibrierung wurde dem Bad dl-Nor-Adrenalin (Endkonzentration: 1 lM) oder 3 M KCl (0,1 ml, Endkonzentration von K plus : 54 mM) zugesetzt. Die Gewebe wurden dreimal gewaschen und erneut äquilibriert, nachdem die Kontraktion das maximale Niveau erreicht hatte. Die anhaltende Kontraktion wurde erneut durch die Zugabe von dl-Noradrenalin oder KCl induziert, und dann wurde die Testverbindung mit 10–100 &mgr;M (Noradrenalin) oder 100 &mgr;M (hohes K plus ) aufgetragen. Die kontraktile Reaktion vor dem Auftragen der Testprobe wurde mit 100 % angenommen . Als Referenzverbindungen wurden Prazosinhydrochlorid und Nifedipin verwendet.

3.6.3. Statistische Analyse.

Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. Für die statistische Analyse wurde eine Einweg-Varianzanalyse, gefolgt von einem Dunnett-Test für eine Mehrfachvergleichsanalyse, verwendet. Wahrscheinlichkeitswerte (p) kleiner als 0,05 wurden als signifikant betrachtet.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom 21. COE-Programm, dem Academic Frontier Project und einem Grant-in-Aid forScientific Research des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie unterstützt.

Referenzen und Notizen

1. Dieses Papier ist die Nummer 19 in der Reihe „Bioaktive Bestandteile aus chinesischen Naturheilmitteln“. Zu Papier Nr. 18 siehe Xie, H.; Morikawa, T.; Matsuda, H.; Nakamura, S.; Muraoka, O.; Yoshikawa, M.Chem. Pharm. Stier. 2006, 54, 669–675.
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