Phenylethanolglykoside von Herba Cistanche verbessern die hypoxische Tumormikroumgebung und verstärken die Wirkung von Oxaliplatin über den HIF-1-Signalweg

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

LIMEI WEN, JUNPING HU, JIAWEI ZHANG und JIANHUA YANG

Abstrakt.

Leberkrebs ist eine der häufigsten bösartigen Tumorarten und zeichnet sich durch hohe Malignität, schnelle Progression, hohe Morbidität und Mortalität aus. Es wurde berichtet, dass Oxaliplatin (OXA) eine ausgeprägte Wirksamkeit gegen fortgeschrittenen Leberkrebs bei tolerierbarer Toxizität aufweist. Bei soliden Tumoren fördert die hypoxische Mikroumgebung die epithelial-mesenchymale Transition (EMT), die auch eine Arzneimittelresistenz von Leberkrebs gegenüber Platinarzneimitteln induzieren kann. KräuterCistanche (Cistanche tubulosa) wurde in der Traditionellen Chinesischen Medizin häufig verwendet und die Phenylethanoidglykoside von HerbaCistanche(CPhGs) sind die wichtigsten aktiven Komponenten. Die vorliegende Studie zielte darauf ab, die Auswirkungen von CPhGs auf Lebensfähigkeit, Apoptose, Migration und Invasion von Leberkrebszellen zu untersuchen. HepG2-Leberkrebszellen wurden in die Kontroll-, DMSO-, CoCl2-, OXA-, OXA plus CoCl2- und CPhGs plus OXA plus CoCl2-Gruppen eingeteilt. Anschließend wurden eine quantitative Reverse-Transkription-PCR und eine Western-Blot-Analyse durchgeführt, um die Expressionsniveaus von Hypoxie-induzierbarem Faktor 1 (HIF-1), Lysyloxidase-ähnlichem 2 (LOXL2) und EMT-verwandten Genen und Proteinen (d. h. E ‑Cadherin und Twist), um die Wirkungen von CPhGs auf Leberkrebs zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass CPhGs die Wirkung von OXA auf Leberkrebs verstärken und die Migration, Invasion und Apoptoserate von Leberkrebszellen hemmen könnten. Darüber hinaus induzierte die CPhG-Behandlung effektiv eine Herunterregulierung von HIF-1, LOXL2 und Twist sowie eine Hochregulierung von E-Cadherin. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass CPhGs eine signifikante Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber OXA und eine Unterdrückung der durch Hypoxie induzierten EMT in der Leber auslösten

Cistanche-Vorteil: Anti-Leberkrebs

Einführung

Liver cancer is a malignant tumor that usually involves the digestive system, and consists of primary and secondary types. Primary liver cancer is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >1,000,000 Todesfälle im Zusammenhang mit Leberkrebs bis 2030, und von den neu bestätigten Fällen werden die Fälle in Festlandchina 46,6 Prozent ausmachen .

Es wurde berichtet, dass Oxaliplatin (OXA) hemmende Wirkungen auf das Wachstum von Leberkrebs mit tolerierbarer Toxizität in klinischen Umgebungen ausübt. Dennoch wird die Gesamteffizienz einer platinbasierten medikamentösen Therapie durch die Tumorzellresistenz behindert (4). Es ist allgemein anerkannt, dass Leberkrebs im Vergleich zu anderen Krebsarten eine geringere Empfindlichkeit gegenüber einer Chemotherapie aufweist. Die Multidrug-Resistenz von Leberkrebs hat zu seiner Resistenz gegen zahlreiche Therapeutika beigetragen (5). In einer früheren Studie berichteten Xie und Zhong (6), dass HepG2-Zellen unter hypoxischen Bedingungen eine geringe Empfindlichkeit gegenüber Adriamycin, 5‑Fluorouracil und Cisplatin zeigten. Trotz der Tatsache, dass platinbasierte Chemotherapeutika die wichtigsten Behandlungsoptionen für Krebs sind, gibt es bei Patienten Resistenzen gegen diese Medikamente. Darüber hinaus bleibt die Prognose von Patienten mit Leberkrebs schlecht (7,8). Bis heute wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um die Arzneimittelresistenz zu untersuchen und die Arzneimittelsensitivität bei Patienten mit Leberkrebs zu verbessern.

Unter hypoxischen Bedingungen kommt es in Krebszellen zu einer Revaskularisierung, die zu einer epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) und einer vaskulären Mimikry (VM) führen kann. EMT und VM können anschließend die Invasion und Fernmetastasierung fördern. Darüber hinaus wurde spekuliert, dass EMT eine Rolle als treibende Kraft für das Fortschreiten von Krebs spielt (9). Darüber hinaus sind Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) an der Bildung neuer Gefäße, dem Energiestoffwechsel, der Zellproliferation, Invasion und Metastasierung beteiligt (10).

Lysyloxidase (LOX)-like 2 (LOXL2) Protein ist ein Mitglied der LOX-Familie und eng verwandt mit der kovalenten Vernetzung von Kollagen und Elastin, die zu Fibrose führen kann und entscheidend für die Integrität der extrazellulären Matrix ist ( 11). In einer früheren Studie wurde LOXL2 als eng mit der Metastasierung von Krebszellen verwandt angesehen (12). Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass LOXL2 die Pathogenese und das Fortschreiten zahlreicher bösartiger Krebsarten über extra- und intrazelluläre Wege moduliert, was wichtige Indizien für die Bewertung einer schlechten Prognose waren (13,14).Herba Cistancheist ein Tonikum, das häufig in Wüstenregionen verbreitet ist und häufig in der traditionellen chinesischen Medizin verwendet wird (15,16).Cistanche tubulosa(C. tubulosa)ist eine natürliche Kräutermedizin, die häufig in der Autonomen Region Xinjiang angebaut wird. Die Phenylethanoidglykoside von Herba Cistanche (CPhGs) dienen als eine der wichtigsten aktiven Komponenten von Herba Cistanche. Zuvor wiesen Hu et al. (17) darauf hin, dass CPhGs Leberschäden bei H22-Tumor-tragenden Mäusen abschwächen und das Wachstum von Krebszellen hemmen könnten. Es wurde vermutet, dass der zugrunde liegende Mechanismus mit einer Verringerung des Serum-Fetoproteins zusammenhängt und die Immunität der Mäuse verstärken könnte.

In der vorliegenden Studie wurde ein hypoxisches Modell von HepG2-Leberkrebszellen unter Verwendung von CoCl2 induziert. Auf dieser Grundlage zielte die vorliegende Studie darauf ab, die Auswirkungen von OXA auf die Proliferation, Apoptose, Migration und Invasion von Krebszellen in Gegenwart von CPhGs unter hypoxischen Bedingungen zu untersuchen. Darüber hinaus wurden die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus von HIF-1, LOXL2, E-Cadherin und Twist nachgewiesen. Darüber hinaus wurden die genauen Mechanismen untersucht, die den Wirkungen von CPhGs auf die Pathogenese von Leberkrebs zugrunde liegen.

Der Vorteil von Cistanche-Extrakt: Behandlung von Leberkrebs

Materialen und Methoden

Zelllinie. Die mit der STR-Methode identifizierte Leberkrebszelllinie HepG2 wurde von der Clinical Research Institution, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (Urumqi, China) bereitgestellt. Die Zellen wurden in Hochglukose-DMEM (HyClone; Cytiva) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Hyclone; Cytiva) bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 kultiviert.

Preparation of CPhGs. C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd.. The content of CPhGs was >80 Prozent, wobei der Gehalt an Echinacosid und Verbascose 44,5 bzw. 16,1 Prozent betrug. Stängel von C. tubulosa (Schrenk) Wight wurden im Oktober 2016 in Xinjiang, China, gesammelt. Die Pflanze wurde von Dr. Junping Hu identifiziert. Alle diese Belegexemplare (Nr. 201610) wurden im Plant Herbarium, School of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Xinjiang, China hinterlegt.

Experimentelles Design. HepG2-Zellen (5x104/ml) wurden mit verschiedenen Konzentrationen von CPhGs (5, 25, 50, 100, 200 und 500 µg/ml) für 48 h bei 37 °C (24 h nach der Aussaat) behandelt. zum Screening der CPhGs-L/M/H-Dosis. HepG2-Zellen (5 x 104/ml) wurden in die folgenden Gruppen eingeteilt: i) Kontrollgruppe, kultiviert in DMEM mit hohem Glucosegehalt; ii) DMSO-Gruppe, kultiviert in 0,1 Prozent DMSO (v/v); iii) CoCl2-Gruppe (Hypoxie-Modellgruppe), kultiviert in serumfreiem DMEM mit 100 µM CoCl2; iv) OXA

Gruppe (positive Kontrollgruppe), kultiviert in 5 &mgr;M OXA (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.); v) OXA plus CoCl2-Gruppe, kultiviert in 5 µM OXA kombiniert mit 100 µM CoCl2; und vi) CPhGs-Gruppen, behandelt mit CPhGs-L/M/H (25, 50 bzw. 100 µg/ml), kombiniert mit 5 µM OXA und 100 µM CoCl2.

Zelllebensfähigkeitstest. Die Zelllebensfähigkeit wurde mit einem Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) und wie zuvor beschrieben (18) bestimmt. Zellen (2,0 x 103 Zellen/Vertiefung) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät. Anschließend, ~24 h nach dem Aussäen, wurden die Zellen für 48 h gemäß den Behandlungsbedingungen in jeder Gruppe behandelt. Das Medium wurde dann durch 100 µl DMEM mit hohem Glucosegehalt ersetzt, gefolgt von der Zugabe von 10 µl CCK-8-Reagenz; die Zellen wurden für 1 h bei 37 °C inkubiert. Die optische Dichte wurde mit einem Multi-Detektions-Mikroplattenlesegerät (Thermo Fisher Scientific, Inc.) bei 450 nm gemessen. Für jede Bedingung wurden sechs Wiederholungen hergestellt.

Bestimmung der Apoptoserate. Die Apoptoserate wurde unter Verwendung eines Annexin V/PI Apoptotic Detection Kit (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) bestimmt. HepG2-Zellen (5x105) wurden in Platten mit 6 Vertiefungen bei 37 °C in 5 % CO2 inokuliert. Anschließend, ~24 h nach der Behandlung, wurden die Zellen für 4 h in serumfreiem DMEM kultiviert. Die Zellen wurden dann mit 0,25 % trypsiniertem (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) verdaut, gefolgt von mindestens drei Waschgängen mit vorgekühltem PBS. Nach Zentrifugation bei 167,7 xg für 5 min bei 4°C wurden die Zellen mit 1X Bindungspuffer resuspendiert und die Konzentration auf 1~5x106/ml eingestellt und dann mit 5 µl Annexin V-FITC und 5 µl PI für 15 min gefärbt bei Raumtemperatur. Die Zellen wurden dann einer Durchflusszytometrie unter Verwendung eines BD LSRFortessa-Durchflusszytometers (BD Biosciences) und FlowJo unterzogen

10.6.2-Software (Tree Star, Inc.).

Wundheilungstest. Die hemmenden Wirkungen von CPhGs auf die Zellmigration wurden durch einen Wundheilungstest untersucht (19). Die Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät, bis eine 100-prozentige konfluente Monoschicht erhalten wurde. Anschließend wurden die Zellen mit einer 200-µl-Pipettenspitze verwundet, mit PBS gewaschen und mit Behandlungen in serumfreiem Medium inkubiert. Nach der medikamentösen Behandlung wurde die Wundheilungsgeschwindigkeit nach 0, 12, 24 bzw. 48 h gemessen. Wundbilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon Ti-S, Japan) bei 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Der Wundverschluss wurde anhand der Wundentfernung in jedem Zeitraum gemessen und als Prozentsatz der anfänglichen Wundentfernung bei 0 h ausgedrückt.

Transwell-Assays. Die Zellinvasion wurde durch Transwell-Assays bewertet. Zellen (1x105 Zellen/ml) wurden in 200 µl DMEM mit hohem Glucosegehalt ohne FBS suspendiert. Die Zellen wurden dann auf mit Matrigel beschichtete obere Vertiefungen ausgesät, die mit einer Polyethylenterephthalat-Filtermembran (Porengröße 8,0 µm) bedeckt waren. Insgesamt 500 µl DMEM mit hohem Glucosegehalt und 10 % FBS wurden in die untere Kammer gegeben. Wattestäbchen wurden verwendet, um die Zellen auf der oberen Oberfläche des Filters nach 48 h bei 37 °C zu entfernen. Die durch die Membran eingedrungenen Zellen wurden 30 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurden die Zellen mit 0,1 Prozent Kristallviolett für 15 min bei Raumtemperatur gefärbt. Eingedrungene Zellen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon Ti-S) bei 100-facher Vergrößerung beobachtet.

Quantitative Reverse-Transkriptions-PCR (RT-qPCR). Gesamt-RNA wurde aus HepG2-Zellen unter Verwendung von TRIzol®-Reagenz (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) extrahiert, und cDNA-Synthese wurde unter Verwendung des PrimeScript RT-Reagenzienkits (Takara Bio, Inc.) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. qPCR wurde auf einem 7500 Real-Time PCR-System (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) unter Verwendung von TB green™ Premix Ex Taq™ (Takara Bio, Inc.) gemäß Herstellerprotokoll durchgeführt. Die für die qPCR verwendeten Primer sind in Tabelle I aufgeführt. Die PCR-Bedingungen bestanden aus Denaturierung bei 95 °C für 30 Sekunden, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 5 Sekunden und Annealing bei 60 °C für 30 Sekunden. Abschließend wurden die Amplifikationsergebnisse mit der 2-ΔΔCq-Methode analysiert (20).

Western-Blot-Analyse. Proteine ​​wurden aus Zellen extrahiert, die für 48 h durch Homogenisierung in RIPA-Lysepuffer (Thermo Fisher Scientific, Inc.), der Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthielt, behandelt wurden. Der Zellproteingehalt wurde unter Verwendung des BCA-Verfahrens bestimmt. Proteine ​​(40 µg) wurden dann durch SDS-PAGE auf einem 10-prozentigen Gel aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membran wurde in 5 % fettfreier Milch für 1 Stunde bei 4 °C blockiert und mit den folgenden primären Antikörpern inkubiert: -Actin (1:5,000; Kat.-Nr. bs-0061R; BIOSS), HIF ‑1 (1:1,000; Kat.-Nr. ab179483; Abcam), LOXL2 (1:500; Kat.-Nr. ab179810; Abcam), E‑cadherin (1:1,000 ; Kat. Nr. bs‑10009R; BIOSS) und Twist1 (1:500; Kat. Nr. bs‑2441R; BIOSS) über Nacht bei 4 ˚C. Die Membran wurde dann mit Ziege-anti-Kaninchen-IgG-H&L-Sekundärantikörpern (1:2.000; Kat.-Nr. ab205718; Abcam) für 4 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit TBS-0,05 Prozent Tween-20 wurden die Blots unter Verwendung des Enhanced Chemiluminescence-Systems (Amersham; Cytiva) sichtbar gemacht. Die relative Intensität der Banden wurde durch densitometrische Analyse unter Verwendung der ImageJ2x-Software (Version 2.1.4.7; Rawak Software Inc.) halbquantifiziert, und die densitometrischen Diagramme der Ergebnisse wurden auf die Intensität von ‑Aktin normalisiert.

Statistische Analyse. SPSS 19.0-Software (SPSS, Inc.) wurde für die Datenanalyse verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und wurden durch einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-Hoc-Test, analysiert. P<0.05 was="">als Hinweis auf einen statistisch signifikanten Unterschied angesehen. Alle Experimente wurden mindestens dreifach durchgeführt.

Ergebnisse

Auswirkungen von CPhGs auf die Zelllebensfähigkeit. HepG2-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von CPhGs (5, 25, 50, 100, 200 und 500 &mgr;g/ml) für 48 h (24 h nach der Aussaat) behandelt. Wie in Abb. 1 gezeigt, gab es eine signifikante Abnahme der Lebensfähigkeit von Zellen, die mit 200 und 500 µg/ml CPhGs behandelt wurden, verglichen mit derjenigen der Kontrollgruppe (P<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">

CPhGs verstärken die Wirkung von OXA auf Leberkrebs. Anschließend wurden die Wirkungen von CPhGs auf die Lebensfähigkeit von OXA-modulierten HepG2-Zellen bewertet (Abb. 2). Nach ~48 h verringerte die Kombination von CPhGs und OXA die Lebensfähigkeit von HepG2-Zellen im Vergleich zu OXA plus signifikantCoCl2-Gruppe. Insbesondere CPhGs‑M plus OXA plus CoCl2 und CPhGs‑H plus OXA plus CoCl2 hemmten signifikant die Lebensfähigkeit von HepG2-Zellen im Vergleich zu in der OXA plus CoCl2-Gruppe (P<0.05 and=""><0.01,>

CPhGs hemmen die Migration und Invasion von Leberkrebszellen. Um das Invasionspotenzial und die Migrationsfähigkeit von Leberkrebszellen nach der Behandlung mit CPhGs und OXA weiter zu untersuchen, wurden Wundheilungs- und Transwell-Assays durchgeführt. Der Wundheilungsassay zeigte, dass im Vergleich zur DMSO-Gruppe die Migration von HepG2-Zellen nach Behandlung mit CoCl2, OXA und CPhGs (200 oder 500 µg/ml) reduziert war (P<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co-treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="">

Wirkungen von CPhGs und OXA auf die Apoptose. Nach Behandlung mit der Kombination von CPhGs und OXA für

48 h wurden die HepG2-Zellen mit Annexin V‑FITC und PI gefärbt, gefolgt von Durchflusszytometrie zur Bestimmung der zellulären Apoptose. Wie in Abb. 4A gezeigt, zeigten die Co-Behandlungsgruppen (CPhGs-L/M/H plus OXA plus CoCl2) eine allmähliche Erhöhung des Anteils apoptotischer Zellen mit zunehmender CPhG-Konzentration. Die meisten der mit CPhGs und OXA behandelten Zellen waren in der Q4-Region lokalisiert, was anzeigte, dass die Kombination von CPhGs und OXA Apoptose im frühen Stadium induzierte. Verglichen mit der OXA plus CoCl2-Gruppe wurde eine signifikante Erhöhung der Apoptoserate der Zellen in den Gruppen festgestellt, die mit OXA, CoCl2 und moderaten oder hohen Dosen von CPhG behandelt wurden (P<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">

mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist following CPhGs and OXA co‑incubation. There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist between the control and DMSO groups (P>0.05; Abb. 5A-D). Umgekehrt induzierte CoCl2 einen signifikanten Anstieg der mRNA-Expressionsniveaus von LOXL2, HIF-1 und Twist im Vergleich zu denen in DMSOGruppe (S<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">

Proteinexpressionsniveaus von HIF-1 , LOXL2, E-Cadherin und Twist nach gleichzeitiger CPhGs- und OXA-Inkubation. Die Ergebnisse des Western Blotting zeigten, dass die Proteinexpressionsniveaus von HIF‑1, LOXL2 und Twist unter hypoxischen Bedingungen im Vergleich zu denen in der DMSO-Gruppe hochreguliert waren. Im Gegensatz,

die Proteinexpressionsniveaus von E‑Cadherin wurden unter hypoxischen Bedingungen herunterreguliert (P<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" dmso="" group,="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2="" and="" twist="" induced="" by="">

Diskussion

Hypoxie ist ein häufiges Merkmal in der Mikroumgebung von Krebs; dies hängt vor allem damit zusammen, dass die Verbreitung vonKrebszellen ist schneller im Vergleich zur Gefäßbildung von aberranten Neogefäßen. Darüber hinaus werden andere biologische Prozesse, einschließlich Proliferation, Metastasierung und Arzneimittelempfindlichkeit, durch Hypoxie beeinflusst (21). Die hypoxische Mikroumgebung des Tumors ist entscheidend für die Pathogenese und das Fortschreiten von Krebs, und sie ist auch wichtig für die Arzneimittelresistenz und Vaskularisierung von Leberkrebs (22).

In der vorliegenden Studie wurden HepG2-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von CPhGs behandelt, wobei CPhGs (200 µg/ml) eine signifikante Verringerung der Zelllebensfähigkeit induzieren konnten. Bemerkenswerterweise könnten CPhGs die zelluläre Lebensfähigkeit dosisabhängig modulieren. Unter hypoxischen Bedingungen hemmte die Kombination von OXA und CPhGs (50 oder 100 µg/ml) die Lebensfähigkeit von HepG2-Zellen im Vergleich zur OXA-Behandlung allein signifikant. Ein ähnlicher dosisabhängiger Trend wurde bei den Migrations- und Invasionsassays von Leberkrebszellen beobachtet. Derzeit wurden umfangreiche Studien durchgeführt, um die Rolle der Apoptose von Krebszellen bei der Pathogenese von Lebererkrankungen zu untersuchen (23-26). Es wurden mehrere Strategien zur Behandlung von Leberkrebs durch Förderung der Apoptose entwickelt (27-29); daher Eingriff in

Die Apoptose von HepG2-Zellen könnte ein vielversprechender Kandidat für die Prävention und Behandlung von Leberkrebs sein. Die Apoptose von HepG2-Zellen war nach der Behandlung mit der Kombination von CPhGs‑M/‑H und OXA im Vergleich zu der von Zellen, die nur mit OXA behandelt wurden, signifikant verstärkt. Daher wurde darauf hingewiesen, dass CPhGs die Antitumorwirkung von OXA signifikant verstärken könnten.

HIF‑1 kann die Expressionsniveaus von E‑Cadherin, N‑Cadherin und Vimentin sowie einigen Transkriptionsfaktoren wie Snail1/2, Zeb1 und Twist1 hochregulieren. In der Folge könnte dies zu einem Verlust der zellulären Polarität, einer Lockerung der Zell-Zell-Verbindungen, Veränderungen des Zytoskelettproteins und der Migration und Invasion von Krebszellen führen, was zur Translokation von Krebszellen in das Kreislaufsystem durch die Basilarmembran führen könnte und nachfolgender Metastasierung (30). In der vorliegenden Studie wurde CoCl2 verwendet, um ein Hypoxiemodell zu induzieren, das eine Erhöhung der Lebensfähigkeit von HepG2-Zellen sowie Zellmigration und -invasion auslöste. Darüber hinaus waren die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus von HIF‑1 signifikant erhöht, was darauf hindeutet, dass CoCl2 die Bildung von a induziert

hypoxische Mikroumgebung. Die Behandlung mit der Kombination von CPhGs und OXA hemmte deutlich die durch Hypoxie induzierte mRNA- und Proteinexpression von HIF-1. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CPhGs die Mikroumgebung von Leberkrebs dosisabhängig abschwächen könnten.

E-Cadherin ist ein Ca2 plus -abhängiges Adhäsionsmolekül, das eine Schlüsselrolle bei der Zell-Zell-Adhäsion, der Aufrechterhaltung der Integrität der Gewebestruktur und der Signalübertragung spielt. In Fällen einer Herunterregulierung oder sogar eines Verlusts der Adhäsionsfunktion können Krebszellen eine unkontrollierte Proliferation und Dedifferenzierung zeigen, was eine verstärkte Invasion von Krebszellen und eine nachfolgende Metastasierung fördern kann (31). Darüber hinaus ist E-Cadherin entscheidend für die Hemmung der EMT von Krebszellen, die eng mit der Differenzierung, Invasion, Metastasierung und Prognose multipler epithelialer Malignome verbunden ist. EMT-induzierende Transkriptionsfaktoren (EMT-TFs) wie Twist, Snail und Zeb sind entscheidend für die EMT. Es wurde berichtet, dass Hypoxie Signalwege aktiviert, die die EMT-TF-Expression induzieren; insbesondere könnte es EMT über die transkriptionelle Aktivierung dieser Faktoren direkt fördern (32). Der Twist ist eine hochkonservierte Helix-Ring-Helix

Transkriptionsfaktor, der in den letzten Jahren neu identifiziert wurde. Eine hohe Twist-Expression wurde in zahlreichen Arten von Krebszellen nachgewiesen (33). Daher ist es wichtig, den Zusammenhang zwischen Twist-Expression und der Migration oder Metastasierung von Krebszellen sowie die klinische Prävention und Behandlung von Metastasen zu untersuchen (34). In der vorliegenden Studie wurde festgestellt, dass die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus von E-Cadherin in Gegenwart von Hypoxie herunterreguliert waren, während die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus von Twist erhöht waren. Diese Befunde stimmten mit den Ergebnissen von Invasions- und Migrationsassays überein, die implizierten, dass Hypoxie zum Auftreten von EMT beitragen könnte. Nach der Behandlung mit OXA wurden die Proteinexpressionsniveaus von E‑Cadherin herunterreguliert; dies deutete darauf hin, dass OXA eine geringe Wirksamkeit bei der Hemmung des Wachstums von Leberkrebszellen aufwies, während es EMT fördern könnte. In Kombination mit CPhGs zeigte die Empfindlichkeit von HepG2-Zellen gegenüber OXA jedoch eine deutliche Verbesserung in Anwesenheit von Hypoxie. Darüber hinaus könnte die gleichzeitige Behandlung mit CPhGs und OXA die zelluläre Lebensfähigkeit, Migration und Invasion von HepG2-Zellen hemmen. Die vorliegende Studie nur erkannt

Twist- und E‑Cadherin-Ausdruck; Daher zielen zukünftige Studien darauf ab, sich auf mehr EMT-bezogene Marker zu konzentrieren, um die hemmende Wirkung von CPhGs auf Hypoxie-induzierte EMT bei Leberkrebs zu bewerten.

Es wurde berichtet, dass HIF-1 die Expression von LOXL2 fördert und die Migration und Invasion von Leberkrebszellen verstärkt, was in engem Zusammenhang mit der schlechten Prognose von Leberkrebs stehen kann (30). In einer früheren Studie waren die Expressionsniveaus von LOXL2 in benachbarten Leberkrebsgeweben im Vergleich zu denen in den Krebsgeweben deutlich erhöht (35). Darüber hinaus war es eng mit der Invasion und Metastasierung von Leberkrebs verbunden. Die Stummschaltung des LOXL2-Gens durch kleine interferierende RNA hemmte die Proliferation von HepG2- und SMCC-7721-Zellen, was zu einem Stillstand des Zellzyklus von Krebszellen und einer erhöhten Apoptose führte (36). Shao et al. (35) untersuchten die Korrelation zwischen LOXL2 in Leberkrebsproben und klinisch-pathologischen Faktoren, VM und Prognose bei 201 Fällen, die zur Behandlung operiert wurden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass LOXL2 eine wichtige Rolle bei der Pathogenese und dem Fortschreiten von Leberkrebs spielt, der als Ziel für die Arzneimittelentwicklung dienen könnte. Darüber hinaus zeigten Peng et al. (37), dass LOXL2 die Snail/E‑Cadherin- und Src-Kinase/Focal-Adhäsionskinase-Signalwege aktivieren kann, was zur Pathogenese und zum Fortschreiten der EMT von Magenkrebszellen beitragen kann. In der vorliegenden Studie waren unter hypoxischen Bedingungen die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus von LOXL2 erhöht, während seine Expression nach der Behandlung mit OXA herunterreguliert war. Darüber hinaus führte die Behandlung mit einer Kombination aus CPhGs und OXA zu einer offensichtlichen Herunterregulierung der LOXL2-Expression, was die Antitumorwirkung von OXA auf Leberkrebs wirksam unterstützen könnte.

Es gibt einige Einschränkungen für die vorliegende Studie. Die vorliegende Studie hätte zwei weitere Leberkrebs-Zelllinien verwenden sollen, einschließlich der SMCC-7721-Zelllinie, aber diese konnten nicht verwendet werden, da es nicht möglich war, diese Zelllinien zu kaufen, weil sie falsch identifiziert wurden und von HeLa-Zellen abstammten. Darüber hinaus analysierte die vorliegende Studie nicht die antioxidativen Wirkungen unterschiedlicher Konzentrationen von CPhGs in den Zellen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CPhGs die hypoxische Tumormikroumgebung von Leberkrebszellen verändern könnten, indem sie den HIF-1-Signalweg modulieren. Darüber hinaus war die Empfindlichkeit von Leberkrebszellen gegenüber OXA als Reaktion auf die Behandlung mit einer Kombination aus CPhGs und OXA signifikant erhöht. Diese Ergebnisse könnten eine neue Behandlungsstrategie zur Verbesserung der Empfindlichkeit von Leberkrebs gegenüber einer Chemotherapie bieten.

Danksagungen

Unzutreffend.

Finanzierung

Die vorliegende Studie wurde vom Xinjiang Key Laboratory of Natural Drug Active Components and Drug Release Technology (Grant Nr. XJDX1713), dem Reserve Candidate Project for the Leader of Scientific and Technological Innovation in Xinjiang Uygur Autonomous Region (Grant Nr. 2019XS14), die National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 81860735) und die Bethune Charitable

Stiftung „Bethune·Quest‑Aufbau pharmazeutischer wissenschaftlicher Forschungskapazitäten“ (Fördernummer B‑19‑H‑20200622).

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.

Autorenbeiträge

LMW und JWZ führten die Experimente durch, verfassten das Manuskript und bestätigten die Echtheit aller Rohdaten. JPH und JHY haben die vorliegende Studie entworfen. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Ethik-Zustimmung und Zustimmung zur Teilnahme

Unzutreffend.

Zustimmung des Patienten zur Veröffentlichung

Unzutreffend.

Konkurrierende Interessen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Verweise

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