Lichtschützende und antimelanogene Eigenschaften verschiedener Kadsura-Coccinea-Extrakte

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Solare ultraviolette (UV) Strahlung, gekennzeichnet durch UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm) und UVC (100–280 nm), ist der kritischste Umweltfaktor, der Hautkrebs und Lichtalterung aufgrund von Zytotoxizität und Genotoxizität verursacht , und Phototoxizität. Insbesondere machen UVA- und UVB-Strahlung über 95 Prozent bzw. 3 Prozent der täglichen UV-Bestrahlung aus [8]. UVA- und UVB-Strahlung kann reaktive Sauerstoffspezies (ROS) indirekt oder direkt induzieren, indem sie die epidermalen und/oder dermalen Schichten der Haut durchdringt, was zu oxidativen Schäden und Zelltod führt. In den letzten Jahrzehnten ist die UV-Strahlung zu einem ernsthaften Problem für die Hautgesundheit geworden und breitet sich immer noch gefährlich weltweit aus [9–11]. UV-Strahlung ist ein direktes und konsistentes Stimulans für Keratinozyten, die etwa 95 Prozent der epidermalen Zellmasse der Haut ausmachen. Keratinozyten wirken als erste Barriere gegen mikrobielle, chemische und physikalische Gefahren und helfen bei der Abwehr von UVA- und UVB-Strahlung. Wenn Keratinozyten UVA und UVB ausgesetzt werden, werden intrazelluläre ROS erzeugt und damit Apoptose ausgelöst [12–14].

Melanozyten sind für die Produktion und Menge von Melaninpigmenten verantwortlich, die wichtige Akteure bei der biologischen Abwehr der Hautepidermis sind; ihre Dysregulation kann Hyperpigmentierungs- oder Hypopigmentierungsstörungen verursachen [15,16]. Melanozyten sind im Stratum basale der Hautepidermis verteilt, das auch durch Sonneneinstrahlung, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Melanozyten-stimulierende Hormone (-MSH) beeinflusst wird [17,18]. Tyrosinase, ein Mitglied der Familie der Kupferproteine ​​vom Typ -3, ist ein evolutionär konserviertes Metalloprotein, das eine entscheidende Rolle bei der Melanogenese und bei den Aktivitäten von Monophenolmonooxygenase, Catecholase und Diphenolen spielt. Die Herunterregulierung von Tyrosinase, Tyrosinase-verwandtem Protein -1 (TRP-1) und Tyrosinase-verwandtem Protein -2 (TRP-2) hat unterschiedliche katalytische Wirkungen. TRP-1 ist eine 5,6-Dihydroxyindol-2--Carbonsäureoxidase und TRP-2 ist eine DOPAchrom-Tautomerase [19,20]. Darüber hinaus sind der Myophthalmose-bezogene Transkriptionsfaktor (MITF) und das cAMP-responsive element-binding protein (CREB) Transkriptionsfaktoren, die primär die Melanogenese regulieren und Informationen über die Art und Intensität der Stimulation kodieren [17,21]. Mehrere Studien haben festgestellt, dass MITF- und CREB-Wege die Melanogenese regulieren. MITF ist ein Schlüsselfaktor bei der Transkription melanogenesebezogener Enzyme und der zentrale Regulator der Melanogenese. -MSH führt zur Expression von MITF über einen Signalmechanismus, an dem das cAMP-Related Binding Protein (CREB) beteiligt ist. Dann dringt MITF mit der M-Box-Sequenz (AGTCATGTGCT) in den Zellkern ein, um die Transkription spezifischer melanogener Gene und Enzyme zu fördern. Es ist auch bekannt, dass phosphoryliertes CREB durch -MSH stimuliert wird, das an das CRE-Konsensuselement im Mitf-Promotor bindet, um die Mitf-Transkription hochzuregulieren [21–24].

In dieser Studie wurden Extrakte aus KC-Wurzel (KCR), Stängel (KCS), Blatt (KCL) und Frucht (KCF) umfassend verglichen und mehrere Bewertungen ihrer lichtschützenden und antimelanogenen Eigenschaften durchgeführt.

2. Materialien und Methoden

2.1. Herstellung von KC-Extrakten

Eine drei Jahre alte KC 15-Pflanze wurde in einem 9-Liter-Plastiktopf auf dem Miryang-Campus der Pusan ​​National University gezüchtet. KC wurde von Professor Young Whan Choi, dem Autor dieser Studie, identifiziert. Diese Proben wurden als Belegexemplare (Zugangsnummer KC-PDRL-1) im Herbarium des Department of Horticultural Bioscience, College of Natural Resources and Life Science, Pusan ​​National University hinterlegt. Die Pflanzen wurden ausreichend mit einer vollständigen Nährlösung mit einer Leitfähigkeit von 1,0 mS·cm−1 und folgenden Elementen (in me·L−1) bewässert: NO3-N, 16; NH4-N, 1,34; P, 4; K, 8; Ca, 8; und S, 4. KC-Gewand im Hafen wurde im Dezember 2020 geerntet, indem Wurzeln, Stängel, Blätter und Früchte klassifiziert wurden (Abbildung 1A). Geerntete Proben wurden sofort in einem Gefriertrockner lyophilisiert und bis zur Analyse in Vinylbeuteln bei 20 ◦C gelagert. Die getrockneten Wurzeln, Stängel, Blätter und Früchte von KC (20 g) wurden zu einem feinen Pulver gemahlen und bei Raumtemperatur mit Ethylalkohol extrahiert. Kurz gesagt, Filtration und Verdampfung von EtOH-Extrakten von KC wurden unter reduziertem Druck bei 45 °C durchgeführt, gefolgt von Lyophilisierung. Schließlich wurde der feste Extrakt (50 mg/ml) für weitere Experimente in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst.

Zistancheherba epimedium sagittatumExtrakt

2.2. Gesamter Polyphenol- und Flavonoidgehalt von KC-Extrakten

Wie zuvor beschrieben [25], wurden die gesamten Polyphenol- und Flavonoidgehalte von KC-Wurzel-, Stängel-, Blatt- und Fruchtextrakten mit den kolorimetrischen Methoden Folin-Ciocalteu (Gesamtpolyphenol) und Aluminiumchlorid (Flavonoid) gemessen. Die Extinktion wurde bei 700 nm (Gesamtpolyphenol) mit Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK) und bei 510 nm (Flavonoid) mit dem VICTOR Multilabel Plate Reader (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) gemessen. .

Standardkurven wurden unter Verwendung von Gallussäure (Gesamtpolyphenol) und Quercetin (Flavonoid) als Standards erstellt, und die Ergebnisse wurden als Gallussäureäquivalente pro Gramm (GAE/g) von KC-Wurzel-, Stängel-, Blatt- und Fruchtextrakten und Quercetinäquivalent ausgedrückt pro Gramm (QE/g) von KC-Wurzel-, Stängel-, Blatt- bzw. Fruchtextrakten.

2.3. DPPH- und ABTS-Assay

Die DPPH- und ABTS-Radikalfängeraktivitäten von KC-Wurzel-, Stängel-, Blatt- und Fruchtextrakten ({{0}},5 mg/ml) wurden gemäß einer zuvor beschriebenen Methode [25] mit leichten Modifikationen gemessen. KC-Wurzel-, Stängel-, Blatt- und Fruchtextrakte (0,5 mg/ml) wurden mit DPPH-Lösung (60 µM) in Mikrotiterplatten gemischt. Nachdem die Proben kräftig geschüttelt wurden, wurden sie im Dunkeln bei 25 °C für 0,5 h aufbewahrt. Stammlösungen von 7 mM ABTS und 2,6 Kaliumpersulfat wurden in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur im Dunkeln für 18 Stunden hergestellt. KC-Wurzel-, Stängel-, Blatt- und Fruchtextrakte (0,5 mg/ml) wurden mit der Arbeitslösung gemischt und dann 0,5 h bei Raumtemperatur im Dunkeln stehengelassen. Die Extinktion der Probengemische wurde bei 510 nm (DPPH) oder 734 nm (ABTS) überwacht.

2.4. Zellkultur

Die anhaftenden Keratinozyten (HaCaT) und anhaftenden Melanozyten (B16F10) wurden in DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)-Kulturlösung inokuliert, die 10 Prozent FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) und 1 Prozent Penicillin/Streptomycin (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) und bei 37 ◦C mit 5 Prozent CO2 kultiviert. Das anhaftende HaCaT- und B16F10-Zellwachstum wurde regelmäßig beobachtet, und das Medium wurde alle zwei bis drei Tage gewechselt. Für nachfolgende Experimente wurden Zellen aus der logarithmischen Wachstumsphase verwendet.

2.5. UVA- und UVB-Bestrahlung

Keratinozyten wurden UVA- oder UVB-Strahlung (Bio-Link BLX-365, Villber-Lourmat, Eberhardzell, Deutschland) mit 5 8 W-Röhren ausgesetzt, die den größten Teil ihrer Energie bei einem Emissionspeak bei entweder 365 nm ( UVA) oder 312 nm (UVB). UVA-Bestrahlungsdosen waren 20 J/cm2 und UVB-Bestrahlungsdosen waren 50 mJ/cm2.

2.6. Messung der Zellviabilität und Zytotoxizität durch CCK-8- und LDH-Analyse

Für die Analyse der Zelllebensfähigkeit wurde die Lösung des Cell Counting Kit-8 (CCK-8) aus dem CCK-8 Assay Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) zu den HaCaT-Keratinozyten gegeben und B16F10-Melanom-Zellsuspensionen gemäß den Anweisungen des Herstellers und bei 37 ◦C für 4 h inkubiert. Kurz gesagt wurden 2 104-Zellen in jede Vertiefung einer 24--Well-Platte ausgesät und mit 5 % CO bei 37 °C für 24 h inkubiert. Kurz gesagt wurden 2 104-Zellen in jede Vertiefung einer 24--Well-Platte ausgesät und mit 5 % CO bei 37 °C für 24 Stunden inkubiert. Nach 24 h Inkubation wurde CCK-8-Reagenz zu jeder Vertiefung gegeben und die Zellen wurden weitere 4 h inkubiert. Ein Zytotoxizitäts-Nachweiskit (Roche Applied Science, Schweiz) wurde verwendet, um die Freisetzung von extrazellulärer Laktatdehydrogenase (LDH) in HaCaT-Keratinozyten-Kulturmedium zu bestimmen. Die Absorption wurde bei 450 nm (CCK-8) und 490 nm (LDH) mit einem VICTOR Multilabel Plate Reader analysiert.

2.7. Bewertung der intrazellulären ROS-Produktion in Keratinozyten

Intrazelluläre ROS-Spiegel wurden unter Verwendung von {{0}}(and-6)-Chloromethyl-2′,7′-dichlorid-hydrofluorescein diacetat acetyl ester (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Alle Verfahren wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, nach der KC-Behandlung mit anderen Teilextrakten (0,5 mg/ml) wurden Keratinozyten (HaCaT) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit CM-H2DCFDA (5 µM) für 0,5 h inkubiert die Dunkelheit. Danach wurde die Erzeugung von intrazellulärem ROS unter Verwendung eines Carl-Zeiss-Fluoreszenzmikroskops sichtbar gemacht; Die Fluoreszenzintensität wurde basierend auf einem Fluoreszenzfarbstoff (CM-H2DCFDA) unter Verwendung eines Durchflusszytometers (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA) gemessen.

2.8. Analyse der Apoptose

Nach Exposition und Behandlung wurden HaCaT-Keratinozyten trypsinisiert und zentrifugiert. Anschließend wurde die Apoptose der erhaltenen Zellen unter Verwendung des Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Annexin V/Dead CellApoptosis Kit (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Kurz gesagt, Keratinozyten wurden zweimal mit PBS gespült, und Keratinozyten im Annexin-Bindungspuffer wurden erhalten und mit FITC/Annexin V (Komponente A) und Propidiumiodid (PI)-Arbeitslösung gemischt. Nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln wurde die Keratinozyten-Apoptose gemessen und der Prozentsatz apoptotischer Zellen unter Verwendung eines Durchflusszytometers (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA) berechnet. Signale wurden für FL1 (FITC/Nexin V)- und FL3 (PI)-Kanäle detektiert, und Quadrantenmarker-Färbung und Dot-Plots der gefärbten Zellen wurden erstellt.

2.9. Analyse des intrazellulären Melaningehalts und der Tyrosinaseaktivität

Der intrazelluläre Melaningehalt und die Tyrosinase-Aktivitätsassays wurden gemessen, indem erklärt wurde, wo sich das leicht modifizierte Verfahren unterschied [24]. Melanozyten wurden mit einer Endkonzentration von 0,5 µM-MSH und den anderen Teilextrakten von 0,5 mg/ml KC für 48 h behandelt. Melanozytenpellets wurden mit 1 N NaOH in 10-prozentigem DMSO bei 80 °C für 1 h lysiert. Der relative Melaningehalt wurde durch Messen der Extinktion bei 475 nm unter Verwendung eines VICTORMultilabel-Plattenlesegeräts bestimmt. Die intrazelluläre Tyrosinase-Aktivität wurde bestimmt, indem die Rate der Dopachrom-Produktion unter Verwendung von L-DOPA gemessen wurde. Melanozyten wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und in PBS lysiert, das 1 Prozent (w/v) Triton X-100 enthielt. Das Tyrosinase-Substrat L-DOPA (2 mg/ml) wurde im gleichen Phosphat-Lyse-Puffer hergestellt. Jeder Extrakt wurde in eine 96--Well-Platte gegeben, und die Enzymanalyse wurde durch Zugabe einer L-DOPA-Lösung initiiert. Nach einstündiger Inkubation wurde die Extinktion bei 475 nm unter Verwendung eines VICTOR Multilabel Plate Reader gemessen, um die Dopachromproduktion zu analysieren. Der Wert jeder Messung wurde als Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt. Arbutin (A, 0,5 mg/ml) wurde als positive Kontrolle verwendet.

CistancheEchinacosidist ein Tyrosinase-Hemmer.

2.10. Quantitative Echtzeit-PCR

Gesamt-RNA wurde aus jeder Gruppe von Melanozyten unter Verwendung des RNeasy Mini Kits (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Reverse Transkription wurde unter Verwendung des Hochleistungs-cDNA-Reverse-Transkriptions-Kits (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, um den ersten cDNA-Strang zu erhalten. Die Stränge wurden dann als Matrizen für quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) unter Verwendung eines Bio-Rad Chromo4TM-Instruments und SYBR Green qPCR-Mastermix (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA) verwendet. Die PCR wurde unter Vordenaturierung bei 95 ◦C für 5 min, Denaturierung bei 95 ◦C für 15 s und Annealing bei 55–58 ◦C für 30 s durchgeführt. GAPDH-mRNA wurde als interne Referenz für Tyrosinase, TRP-1- und TRP-2-mRNA verwendet. Der relative Wert der Zielgenexpression=2−∆∆CT. Die Primersequenzen waren wie folgt: Tyrosinase-Sense (5′-ggccagctttcaggcagaggt-3′), Tyrosinase-Antisense (5′-tggtgcttcatgggc aaaatc-3′), TRP-1-sense (5 ′-agccccaactctgtcttttc-3′), TRP-1-Antisense (5′-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP-2-Sense (5′-tccagaagtttgacagccc-3 ′), TRP-2-antisense (5′-ggaaggagtgagccaagttatg-3′), GAPDH-sense (5′-aggtggtctcctctgacttc-3′) und GAPDH-antisense (5′-taccaggaaatgagcttgac -3′).

2.11. Western-Blotting

Melanozyten wurden geerntet und unter Verwendung eines Säugetier-Proteinextraktionsreagenzes (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) lysiert. Alle Verfahren wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Alle Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Bio-Rad Protein-Assay-Kits (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) bestimmt. Dann wurde der Proteinüberstand mit Ladepuffer versetzt und gemischt. Die Mischung wurde 10 min gekocht und die Proteine ​​wurden unter Verwendung von Mini-PROTEAN Precast Gels (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) getrennt und auf eine Hybond-Polyvinylidendifluoridmembran (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) übertragen. Der Immunnachweis wurde unter Verwendung von Tyrosinase (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF (1:1000), phosphoryliertem CREB (p-CREB 1: 1000), CREB(1:1000) und -Tubulin (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) unter Verwendung des SignalBoost Immunreaction Enhancer Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Die Membran wurde über Nacht mit den Primärantikörpern bei 4 °C inkubiert. Der sekundäre Ziegen-anti-Kaninchen (IgG)-Antikörper (1:5000, Cell Signaling Technology) wurde zu der Membran gegeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Proteinbanden wurden unter Verwendung eines verstärkten Pierce ECL-Western-Blotting-Substrats (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) beobachtet und als das Verhältnis der Intensität der Zielproteinbande zur Intensität der &bgr;-Tubulinbande quantifiziert.

2.12. Statistische Analyse

Alle Assays wurden mindestens dreimal unabhängig voneinander wiederholt. Alle statistischen Parameter werden als mittlerer Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Statistische Analysen wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Dunn's Post-Hoc-Test, durchgeführt. Ein Wert von p < 0.01="" oder="" p="">< 0,05="" wurde="" als="" signifikant="">

Test auf Flavonoide

3. Ergebnisse

3.1. Vergleich der antioxidativen Eigenschaften mehrerer Teilextrakte von KC

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25,7 ± 2,1 Prozent) > KCF (8,7 ± 1,1 Prozent) (Abbildung 1E).

3.2. Vergleich von lebensfähigen und geschädigten Keratinozyten, die mit mehreren Teilextrakten von KC in Gegenwart von UVA, UVB oder Nichtbestrahlung behandelt wurden

Wir führten die folgenden Experimente durch, um die Wirkungen von KCR, KCS, KCL und KCF auf Keratinozyten zu untersuchen. Zuerst wurden alle Extrakte auf HaCaT-Keratinozyten in Anwesenheit von UVA, UVB oder Nichtbestrahlung aufgetragen. Die CCK-8-Analyse zeigte, dass die Extrakte die Lebensfähigkeit der Keratinozyten bei Konzentrationen von 0,5 mg/ml nicht signifikant veränderten. Später wurden Keratinozyten mit KCR, KCS, KCL und KCF in Gegenwart von UVA- oder UVB-Bestrahlung behandelt. Die UVA- und UVB-Bestrahlung hemmte die Lebensfähigkeit der Keratinozyten signifikant, wie die CCK-8-Analyse in Abbildung 2A zeigt. Wir fanden jedoch heraus, dass die Lebensfähigkeit von UVA- und UVB-bestrahlten Keratinozyten in der folgenden Reihenfolge zunahm: KCL, KCR, KCS und KCF (Abbildung 2A). Wir überwachten auch die beschädigten Keratinozyten, indem wir die extrazelluläre LDH-Freisetzung maßen. Die Ergebnisse zeigten, dass die UVA- oder UVB-Bestrahlung die LDH-Freisetzung signifikant erleichterte; jedoch schwächten KCL, KCR, KCS und KCF die LDH-Freisetzung mit UVA- oder UVB-Exposition in dieser Reihenfolge signifikant ab (Abbildung 2B). Die obigen experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die antiproliferativen und zytotoxischen Wirkungen von UVA- oder UVB-Bestrahlung auf Keratinozyten in der Reihenfolge KCL, KCR, KCS und KCF abgeschwächt wurden. Insbesondere kann KCL die Lebensfähigkeit der Zellen auf Kontrollniveaus wiederherstellen.

Abbildung 2. Die Lebensfähigkeit der Keratinozyten und die zytotoxischen Wirkungen von KCR-, KCS-, KCL- und KCF-Extrakt in Gegenwart von UVA-, UVB- oder Nichtbestrahlung.

3.3. Vergleich der intrazellulären ROS-Produktion in Keratinozyten, die mit mehreren Teilextrakten von KC in Gegenwart oder Abwesenheit von UVA- und UVB-Bestrahlung behandelt wurden

Da die intrazelluläre Produktion von ROS schwere Keratinozytenschäden verursacht, gelten sie als potenzielle Mediatoren von durch UVA- oder UVB-Strahlung induzierten Schäden. Mehrere Studien legen nahe, dass UVA- oder UVB-Bestrahlung die endogene ROS-Produktion induziert [12,14]. Wir wollten feststellen, ob es einen Anstieg der endogenen ROS-Spiegel in UVA- oder UVB-bestrahlten Keratinozyten gab. Dementsprechend analysierten wir die intrazelluläre Fluoreszenzintensität der Sonde CM-H2DCFDA mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie. Als Ergebnis der Fluoreszenzmikroskopie zeigten CM-H2DCFDA-Färbungsbilder eine leichte Färbung in Kontroll-, KCR-, KCS-, KCL- und KCF-behandelten Keratinozyten und eine signifikante Färbung in UVA- oder UVB-bestrahlten Keratinozyten (Abbildung 3A). Gemäß den quantifizierten Ergebnissen der Durchflusszytometrie erhöhte UVA- und UVB-Bestrahlung die intrazellulären ROS-Spiegel in Keratinozyten um 27,2 ± 4,5 Prozent bzw. 34,1 ± 4,2 Prozent im Vergleich zu denen in der Kontrolle (5.7 ±0,2 Prozent). Darüber hinaus wurde ähnlich wie bei den Ergebnissen der Fluoreszenzmikroskopie bestätigt, dass der intrazelluläre ROS-Spiegel durch KC-Extrakte in der Reihenfolge KCL > KCR > KCS > KCF in Gegenwart von UVA- oder UVB-Bestrahlung unterdrückt wurde (Abbildung 3B). Diese Ergebnisse zeigen, dass mehrere Teilextrakte von KC die Keratinozytenschädigung signifikant hemmten, indem sie die endogenen ROS-Spiegel reduzierten.

Abbildung 3. Wirkung von KCR-, KCS-, KCL- und KCF-Extrakt auf die intrazelluläre ROS-Produktion in UVA-, UVB- oder nicht bestrahlten Keratinozyten

3.4. Vergleich der Apoptose von Keratinozyten, die mit mehreren Teilextrakten von KC in Gegenwart oder Abwesenheit von UVA- und UVB-Bestrahlung behandelt wurden

Um Apoptose nachzuweisen, die ein zuverlässiger Indikator für Keratinozytenschädigung ist, wurden Keratinozyten mit Annexin V in Kombination mit Propidiumiodid gefärbt. Das Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit wurde verwendet, um die Apoptoserate in Keratinozyten zu testen. UVA- und UVB-Bestrahlung erleichterten die Annexin-V-Färbeaktivität, während KCR, KCS, KCL und KCF die Annexin-V-Färbeaktivitätsrate in Anwesenheit von UVA- und UVB-Bestrahlung verringerten. KCR, KCS, KCL und KCF allein (0,5 mg/ml) induzierten keine Annexin-V-Färbeaktivität. Quantifizierte Daten aus der Durchflusszytometrie zeigten, dass die UVA- und UVB-Bestrahlung den Apoptosespiegel von Keratinozyten um 46,3 erhöhte± 1,5 Prozent und 48,7 ± 1,0 Prozent gegenüber der Kontrollgruppe (5,0 Prozent). ± 0,7 Prozent). Wichtig ist, dass bestätigt wurde, dass das Ausmaß der Apoptose durch KC-Extrakte in der Reihenfolge KCL > KCR > KCS > KCF in Gegenwart von UVA- oder UVB-Bestrahlung unterdrückt wurde (Abbildung 4A,B). Insgesamt verursachten UVA- und UVB-Bestrahlung eine Keratinozytenschädigung und mehrere Teilextrakte von KC schwächten eine durch UV-Bestrahlung induzierte Keratinozytenschädigung ab.

Abbildung 4. Wirkung von KCR-, KCS-, KCL- und KCF-Extrakten auf die Apoptose in UVA-, UVB- oder unbestrahlten Keratinozyten.

3.5. Vergleich des intrazellulären Melaningehalts und der Tyrosinaseaktivität von Melanozyten, die mit mehreren Teilextrakten von KC in Gegenwart oder Abwesenheit einer -MSH-Behandlung behandelt wurden

Vor der Untersuchung des biologischen Potenzials von KCR, KCS, KCL und KCF auf - MSH-induzierte Melanogenese wurde die Zelllebensfähigkeit nach Behandlung mit KCR, KCS, KCL und KCF (0,5 mg/ml) bewertet der CCK-8-Assay in Melanozyten B16F10 mit oder ohne -MSH. KCR, KCS, KCL und KCF (0,5 mg/ml) veränderten die Zelllebensfähigkeit in Gegenwart oder Abwesenheit von -MSH nicht (Fig. 5A). -MSH ist ein wichtiger melanogener Wirkstoff, der den intrazellulären Melaningehalt erhöhen kann, indem er an den Melanocortin-1-Rezeptor bindet und die Adenylatcyclase aktiviert. Um die Wirkung von KCR, KCS, KCL und KCF auf die Melanogenese in Melanozyten zu untersuchen, wurde der intrazelluläre Melaningehalt durch visuelle Beobachtung und biochemische Messungen bestimmt. Wie in Fig. 5B gezeigt, wurde der intrazelluläre Melaningehalt durch -MSH signifikant erhöht. Die gleichzeitige Behandlung mit KCR, KCS, KCL und KCF zeigte jedoch eine bemerkenswerte Verringerung des intrazellulären Melaningehalts im Vergleich zur -MSH-Behandlung. Die Abfolge der biochemischen Messungen, die die Hemmung des intrazellulären Melaningehalts anzeigten, war wie folgt: KCL > KCR > KCS > KCF (Fig. 5B). Der intrazelluläre Tyrosinaseaktivitätsassay wurde gemäß dem intrazellulären Melaningehaltsassay durchgeführt. Die intrazelluläre Tyrosinaseaktivität von -MSH-stimulierten Melanozyten nahm zu, wohingegen die von -MSH-stimulierten Melanozyten, die mit KCR, KCS, KCL und KCF behandelt wurden, abnahm. Die Abfolge der biochemischen Messungen, die die Hemmung der intrazellulären Tyrosinaseaktivität anzeigten, war wie folgt: KCL > KCR > KCS > KCF (Fig. 5C). Diese Ergebnisse zeigen, dass mehrere Teilextrakte von KC den intrazellulären Melaningehalt signifikant verringerten und die Tyrosinaseaktivität hemmten, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu verändern.

3.6. Vergleich der Transkriptions- und Translationsspiegel von Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 in Melanozyten, die mit mehreren Teilextrakten von KC in Gegenwart oder Abwesenheit von behandelt wurden-MSH-Behandlung

Um die Wirkung von KCR, KCS, KCL und KCF auf die Herunterregulierung der Protein- und mRNA-Expressionsniveaus von Melanogenesemarkern (Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2) zu untersuchen, wurden die Melanozyten mit KCR behandelt , KCS, KCL und KCF in Gegenwart oder Abwesenheit von -MSH. Wie in Abbildung 6A–C gezeigt, wurden die mRNA-Spiegel von Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 durch die -MSH-Behandlung signifikant erhöht. Im Gegensatz dazu regulierten KCR, KCS, KCL und KCF im Vergleich zur -MSH-Behandlung die mRNA-Expression von Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 herunter. Darüber hinaus hatten KCR, KCS, KCL und KCF allein keine signifikante Wirkung auf Tyrosinase-, TRP-1- und TRP-2-mRNA-Spiegel. Die Western-Blot-Analyse wurde in Zusammenarbeit mit Real-Time-PCR durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die -MSH-Behandlung die Proteinexpressionsspiegel von Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 erhöhte und diese Spiegel durch gleichzeitige Behandlung mit KCR, KCS, KCL und KCF verringert wurden (Abbildung 6D ). Die Sequenz der quantitativen Echtzeit-PCR und des Western Blot, die die Hemmung der Tyrosinase-, TRP-1- und TRP-2-mRNA und -Proteinexpression anzeigen, war wie folgt: KCL > KCR=KCS > KCF (Abbildung 6). Diese Ergebnisse legen nahe, dass mehrere Teilextrakte von KC das Potenzial haben, die Anti-Melanogenese zu fördern, was durch die Herunterregulierung von Melanogenese-Markern gezeigt wurde.

3.7. Vergleich der MITF-Expression und CREB-Phosphorylierung von Melanozyten, die mit mehreren Teilextrakten von KC in Gegenwart oder Abwesenheit einer -MSH-Behandlung behandelt wurden

Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 sind essentiell für die Melanogenese. Ihre Expression wird durch MITF-Expression und CREB-Phosphorylierung reguliert [17,21]. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass KCR, KCS, KCL und KCF den durch die -MSH-Behandlung verursachten Anstieg des Proteinspiegels von MITF wirksam hemmten. Außerdem detektierten KCR, KCS, KCL und KCF allein kaum die MITF-Proteinexpression. Die Sequenz der quantifizierten Western-Blot-Ergebnisse, die die Hemmung der MITF-Proteinexpressionsniveaus anzeigten, war wie folgt: KCL > KCR > KCS > KCF (Abbildung 7A). Darüber hinaus kehrten KCR, KCS, KCL und KCF die Wirkungen der -MSH-Behandlung auf die CREB-Phosphorylierung um. KCR, KCS, KCL und KCF allein hatten wenig Wirkung auf die CREB-Phosphorylierung. Die Abfolge der quantifizierten Western-Blot-Ergebnisse, die eine Hemmung der CREB-Phosphorylierungsniveaus anzeigten, war wie folgt: KCL > KCR > KCS > KCF (Fig. 7B). Diese Ergebnisse zeigten, dass mehrere Teilextrakte von KC die Melanogenese in Melanozyten zumindest teilweise durch MITF-Expression und CREB-Phosphorylierung unterdrückten.

4. Diskussion

Die Popularität der Hautaufhellung nimmt durch die Zunahme der UV-Bestrahlung weltweit zu und dürfte in den kommenden Jahrzehnten aus ästhetischen Gründen einen hohen Anteil erreichen [8]. Die zahlreichen Arten von Bleichmitteln wie Kojisäure und Arbutin wurden auf dem Kosmetik- und Pharmamarkt verwendet. Darüber hinaus erhalten natürliche Extrakte aufgrund ihrer potenziellen antioxidativen, entzündungshemmenden, antitumoralen, antibakteriellen und anderen Aktivitäten zunehmende Aufmerksamkeit [26,27]. Basierend auf den Eigenschaften von Antioxidantien und Lichtschutz- und Anti-Melanogenese-Eigenschaften wurden mehrere kosmetische und pharmazeutische Kandidaten entwickelt. Es ist allgemein bekannt, dass diese Eigenschaften von Aufhellungskandidaten unverzichtbare Beiträge zur kosmetischen und pharmazeutischen Forschung und Entwicklung leisten [28]. TDM hat Multikomponenten- und Multi-Target-Eigenschaften und verbessert die humanbiologische Wirksamkeit und Lebensqualität erheblich [29]. Moderne phytochemische Forschung zeigt, dass KC eine Vielzahl von Inhaltsstoffen enthält, wobei Lignane und Terpenoide die Hauptbestandteile sind [30]. Mehr als 202 Verbindungen wurden identifiziert, darunter Dibenzocyclooctadien-Lignane, Spirobenzofuranoid-Dibenzocyclooctadien-Lignane, Arylnaphthalin-Lignane, Kadlongilacton-Triterpenoide und Sesquiterpenoide [31,32]. Die getrockneten Wurzeln, Stängel und Blätter von KC haben eine breite Tradition der Verwendung bei TDM zur Behandlung von rheumatoider Arthritis, Zwölffingerdarmgeschwüren, Magen-Darm-Erkrankungen und gynäkologischen Problemen. Die getrockneten Wurzeln von KC mit Wirkungen zur Klärung von Hitze und zur Eliminierung von Toxinen, die eine Diurese zur Entfernung von Ödemen induzieren. Früchte von KC werden hauptsächlich in Form von frischem Obst, Säften und Fruchtwein konsumiert, was darauf hinweist, dass sie der menschlichen Gesundheit zuträglich sind [7,33,34]. Frühere Studien haben auch gezeigt, dass es reich an bioaktiven Inhaltsstoffen wie Lignanen, Triterpenoiden, Flavonoiden, Phenolsäuren, Steroiden und Aminosäuren ist, die einen hohen Nährwert und medizinischen Wert haben [3,35]. In dieser Studie wurden verschiedene Teile von KC extrahiert. Bemerkenswerterweise waren die gesamten Polyphenol- und Flavonoidgehalte von KC-Blättern und -Wurzeln viel höher als die von Stängeln und Früchten. Blätter und Wurzeln enthalten mehr als doppelt so viele Polyphenole und Flavonoide wie Stängel und Früchte. Infolgedessen sind wir der Ansicht, dass die gesamten Polyphenole und Flavonoide einen signifikanten Beitrag zu den lichtschützenden und antimelanogenen Wirkungen von KC leisten.

Die durch UV-Strahlung verursachte kutane Phototoxizität ist hauptsächlich auf Zellzytotoxizität, intrazelluläre ROS-Akkumulation und Apoptose in Keratinozyten zurückzuführen. Daher ist es sinnvoller, sich auf die Hemmung der Zellzytotoxizität, der intrazellulären ROS-Akkumulation und der Apoptose in UVA- und UVB-bestrahlten Keratinozyten zu konzentrieren [36,37]. Wie in dieser Studie beschrieben [10,38], zeigten die Ergebnisse der Intervention mit KC-Extrakten zur Photozytotoxizität (UVA: 20 J/cm2, UVB: 50 mJ/cm2), dass KC-Extrakte die Zellzytotoxizität, die intrazelluläre ROS-Akkumulation und signifikant reduzierten Apoptose. In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen war die Lichtschutzwirkung von KC-Blättern und -Wurzeln viel höher als die von Stängeln und Früchten. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass KC-Extrakte die oben genannten Wirkungen zeigen, indem sie die antioxidative Aktivität fördern. Melanogenese wird häufig nach UV-Bestrahlung beobachtet und ist primär mit Pigmentierung oder Hyperpigmentierung verbunden [39]. Gemäß früheren Studien ist das Verfahren zur Induktion der Melanogenese unter Verwendung von -MSH weithin anerkannt und angewendet worden. Daher basierte diese Studie auf der Konstruktion eines mit -MSH stimulierten Melanozytenmodells [24,39]. Wir fanden heraus, dass KC-Extrakte den -MSH-stimulierten intrazellulären Melaningehalt und die Tyrosinaseaktivität unterdrückten. Darüber hinaus regulierten KC-Extrakte die Transkription und Translation von Melanogenesemarkern wie Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 in -MSH-stimulierten Melanozyten herunter. Darüber hinaus untersuchten wir die MITF-Proteinexpression und die CREB-Phosphorylierung in -MSH-stimulierten Melanozyten. In ähnlicher Weise fanden wir in dieser Studie heraus, dass KC-Extrakte die -MSH-vermittelte MITF-Proteinexpression und CREB-Phosphorylierung in Melanozyten unterdrückten. In Übereinstimmung mit den Lichtschutzergebnissen waren die anti-melanogenen Wirkungen von KC-Blättern und -Wurzeln viel höher als die der Stängel und Früchte.

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5. Schlussfolgerungen

Insgesamt wurden in dieser Studie die potenziellen lichtschützenden und antimelanogenen Wirkungen des KC-Extrakts festgestellt. KC-Extrakt mit hohem Polyphenol- und Flavonoidgehalt kann lichtschützende und antimelanogene Wirkungen auf Keratinozyten und Melanozyten ausüben. Diese Studie liefert eine Begründung und Forschungsstrategie für kosmetische und pharmazeutische Interventionen für natürliche Bleich- und Lichtschutzmittel.