Körperliches Training hemmt die Fibrosebildung bei der Alzheimer-Krankheit und beeinflusst die TGFB-Signalwege

edmund.chen@wecistanche.com

EINLEITUNG 

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Form der Demenz, ihr systemisches Auftreten wird jedoch erst in den letzten Jahrzehnten diskutiert. Obwohl große Anstrengungen unternommen wurden, um Medikamente und krankheitsmodifizierende Therapien zu entwickeln, stehen bisher keine kurativen Verfahren zur Verfügung [1–3]. Die Bildung von Amyloid-Plaques und Funktionsstörungen von Amyloid-Protein-Vorläufern (APP) gelten nicht nur im Zentralnervensystem (ZNS), sondern auch in der Peripherie als erste Anzeichen der Erkrankung [4]. Überzeugende Beweise unterstützen die zentrale Rolle von Amyloid-B (AB) in der Pathogenese von AD [5] und weisen darauf hin, dass die verringerte Clearance von AB einer der Schlüsselprozesse im Pathomechanismus ist. Bei AD sind mehrere periphere Organe wie der Hoden [5], die Bauchspeicheldrüse [6] und andere beteiligtNiere[7], die die Entwicklung einer komplexen systemischen Erkrankung mit mehreren Zielen hervorhebt [8]. Es ist erwiesen, dass dieNiereist an der AB-Clearance beteiligt [9]. Darüber hinaus ist die Serumkonzentration von AB bei chronischen signifikant erhöhtNierenerkrankung (CKD)-Patienten [10, 11]. AB-Akkumulation wurde auch im nachgewiesenNiere[12], was zu einer Filtrationsstörung führt. Die richtige Filtration wird teilweise durch den transformierenden Wachstumsfaktor B (TGFB) reguliert, der ein Hauptzytokin in der Pathogenese von istNieren-Entzündung und Fibrose [13], und es ist auch als wichtiger Faktor in der AD-Pathogenese bekannt [14]. Bei AD spielt die TGFB-Signalgebung eine Rolle bei der Mikroglia-Aktivierung und der Astrozyten-vermittelten Neuroprotektion [15]. Darüber hinaus wirkt sich eine veränderte Expression von TGFB auch auf die Entzündung im ZNS und in peripheren Geweben aus [13, 16].

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TGFB hat drei Isoformen: TGFB1, TGFB2 und TGFB3 [17]. TGFB1 ist an mehreren Prozessen wie der fötalen Entwicklung, der Kontrolle des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung, der Bildung von Fibrose und Narbengewebe, dem Tumorwachstum und der Immunantwort beteiligt [18]. Es ist ein wichtiges Zytokin bei der Fibrosebildung in verschiedenen Organen wie Leber uNiere[19]. TGFB1 bildet Dimere, die zuerst an den TGFB-Typ-II-Rezeptor (TGFRII) binden, dann die Ser/Thr-Kinase des TGFB-Rezeptors Typ I (TGFRI) aktivieren und die intrazelluläre Signalkomplexbildung von Smad-Transkriptionsfaktoren einleiten. Im kanonischen TGFB-Signalweg werden Smad2/3-Transkriptionsfaktoren phosphoryliert und translozieren nach Komplexbildung mit Smad4 in den Zellkern [20]. Mehrere Gene können durch die TGFB1-Aktivierung beeinflusst werden, da sie die Expression verschiedener Kollagene induziert, die Zellproliferation kontrolliert, die Apoptose beeinflusst [20] und die Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Expression reguliert [21]. Der nicht-kanonische TGFB-Signalweg initiiert die Aktivierung von MAPKes durch Phosphorylierung, die wiederum eine weitere TGFB-Expression induzieren kann [22]. JNK- und p38-Kinasen als TGFB-Targets werden in identifiziertNieren-Fibrose und regulieren die Apoptose [23].

Es hat sich gezeigt, dass körperliche Aktivität positive Wirkungen bei menschlichen Patienten ausübt. Sport kann die Manifestation von AD regulieren und hinauszögern [24, 25] und es wurde auch über eine Reduktion von AD-Biomarkern wie Tau und AB im Plasma berichtet [25]. Es wurde festgestellt, dass körperliche Aktivität die Inzidenz von AD, AD-assoziierter neuropathologischer Belastung und kognitivem Verfall reduziert [26]. Obwohl zahlreiche Studien über die Vorteile körperlicher Aktivität auf die AD-Bildung veröffentlicht wurden [27], wurden die intrazellulären Mechanismen, die an diesen positiven Effekten beteiligt sind, nicht im Detail diskutiert. Es gibt einige Tiermodelle, in denen genetisch veränderte Mäuse mit Tau- und AB-Überexpression während körperlicher Betätigung getestet wurden. In diesen Modellen konnte nachgewiesen werden, dass erhöhte körperliche Aktivität die Manifestation der AD hinauszögern konnte [28, 29]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ein langfristiges Training dieser Mäuse positive Auswirkungen auf Funktionsstörungen peripherer Organe bei AD hatte. Körperliche Aktivität veränderte das PACAP-BMP-Crosstalk bei ADNierenüber die Normalisierung der Expression von Kollagen Typ IV und A Akkumulation [30]. Darüber hinaus wurde eine detaillierte Analyse der Schutzfunktion des Trainings auf Sox9-Expression in AD-Hoden veröffentlicht [31]. Aktives Training wirkt sich auch auf die TGFB-Signalisierung aus, da es unterdrückt wirdNieren-Entzündung und anschließender Fibrose [32]. Darüber hinaus sind TGFB und seine Signalübertragung wichtig für den Knochenumbau bei Erwachsenen, der gestört istNiereFibrose [33]. Anschließend war unsere Haupthypothese, dass langfristiges körperliches Training eine systemische Wirkung auf die TGFB-Signalgebung hat, die regulieren kannNiereMatrixproduktion in AD. Die Veränderungen dieser Signalwege können zu einer Abnahme führen NiereFibrose und Normalisierung der AD-Clearance. Daher war unser Ziel, die Beziehung zwischen TGFB-Signalisierung und wohltuenden Wirkungen von körperlichem Training aufzuklärenNiereFifibrose bei AD. In unseren Experimenten präsentieren wir Beweise dafür, dass langfristiges Training direkte Auswirkungen auf die TGFB-Signalisierung in hatNierenvon AD-Mäusen. Darüber hinaus zeigen wir, dass eine erhöhte körperliche Aktivität abnimmtNiereFibrose durch Normalisierung der kanonischen und nicht-kanonischen TGFB-Signalisierung.

Schlüsselwörter:Alzheimer-Krankheit, Fibrose, körperliche Aktivität, Smad, Nierenerkrankung; Nieren-

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MATERIAL UND METHODEN

TierMännliche Alzheimer-transgene (n=5) (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/J)-Mäuse wurden verwendet, um die Wirkung von AD zu verfolgen. Drei Monate alter Wildtyp (WT) (keine transgene Modulation und kein Training) (n=5), transgene Alzheimer-Mäuse (AD) (n=5) und trainierte AD (TAD) (n=5)-Mäuse wurden unter Hell/Dunkel-Zyklen von 12/12 h mit Nahrung und Wasser nach Belieben gehalten. Intervalllauf auf dem Laufband wurde für die Übungs- und die kombinierte Gruppe angewendet. Zuvor wurden alle Trainingstiere 2 Wochen lang an das motorbetriebene Laufband (Columbus Inst., Columbus Ohio, USA) und die Laufgeschwindigkeit gewöhnt. Das Training wurde viermal pro Woche für 60 Minuten durchgeführt. Jede Trainingseinheit dauerte 10 Zyklen, jeder Zyklus bestand aus 4 Minuten Laufen mit hoher Intensität und 2 Minuten Laufen mit niedriger Intensität. Die Laufgeschwindigkeit bei niedriger Intensität war während des Experiments dauerhaft, was eine Geschwindigkeit von 10 m/min bedeutet. Während des Laufens mit hoher Intensität begann die Geschwindigkeit bei 16 m/min und wurde jede dritte Woche um 1 m/min erhöht, bis 20 m/min erreicht waren. Die Kontroll- und die Ernährungsgruppe wurden ebenfalls an das Laufband gewöhnt und blieben dort für 5 Minuten/Tag auf einem stehenden Laufband [28]. Die Experimente wurden mit 3- Monaten alten Tieren begonnen und im Alter von 10 Monaten beendet. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit ethischen Richtlinien durchgeführt (ethische Zulassungsnummer für diese Studie: PEI/001/2105-6/2014, Semmelweis-Universität, Ungarn). Zur Genotypisierung der Tiere wurde das Phire Animal Tissue Direct PCR Kit (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) gemäß den Herstellerangaben verwendet.

Lichtmikroskopische MorphologieNachdem alle kognitiven Tests abgeschlossen waren, wurden {{0}} Monate alte Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (Richter, Konzentration: 100 mg/ml)/Xylazin (Produlab Pharma, Konzentration: 20 mg/ml) anästhesiert. ml) Cocktail in einer Dosis von 0,1 ml/10 g Körpergewicht und transkardial perfundiert mit heparinisierter eiskalter Kochsalzlösung [28] undNierenwurden entfernt. Gewebeproben wurden dreimal in PBS gewaschen und in einer 4:1-Mischung aus absolutem Ethanol und 40 Prozent Formaldehyd fixiert und dann in Paraffin eingebettet. Für die Masson-Trichrom-Färbung (Sigma-Aldrich, MO, USA) wurden serielle Schnitte angefertigt und fibrotisches Gewebe sichtbar gemacht. Das Färbeprotokoll wurde nach Herstellerangaben durchgeführt. Eine DP74-Kamera (Olympus Corporation, Tokio, Japan) auf einem Olympus Bx53-Mikroskop (Olympus Corporation, Tokio, Japan) wurde verwendet, um Mikrofotografien aufzunehmen.

Immunhistochemiedurchgeführt wurdeNiereGewebeproben von WT-, AD-Mäusen und TAD-Mäusen zur Visualisierung der Lokalisierung von Smad2, PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) und Kollagen Typ I (Spalte I) [30].Nierenwurden in einer 4:1-Mischung aus absolutem Ethanol und 40-prozentigem Formaldehyd fixiert und in 70-prozentigem Ethanol gewaschen. Nach Anfertigung von Einbettungsserienschnitten folgte der Entparaffinierung ein Spülen in PBS (pH 7,4). Unspezifische Bindungsstellen wurden mit 1 Prozent Rinderserumalbumin, gelöst in PBS (Amresco LLC, Solon, OH, USA), blockiert. Schnitte wurden mit polyklonalem Smad2 (Sigma-Aldrich, MO, USA) bei einer Verdünnung von 1:500, PCNA (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) bei einer Verdünnung von 1:800 oder Col. I (Sigma-Aldrich, USA) inkubiert. MO, USA) Antikörper in einer Verdünnung von 1:500 bei 4◦C über Nacht. Primäre Antikörper wurden sichtbar gemacht, indem sekundärer Anti-Kaninchen-Antikörper Alexa Fluor 555 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet wurde. Die Proben wurden in Vectashield-Montagemedium (Vector Laboratories, Peterborough, England) mit DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid) für die Kern-DNA-Färbung fixiert. Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555 wurde ohne die primären Antikörper als Negativkontrolle verwendet. Mikrofotografien wurden mit einer DP74-Kamera (Olympus Corporation, Tokio, Japan) auf einem Olympus Bx53-Mikroskop (Olympus Corporation, Tokio, Japan) zur Visualisierung von Col. I aufgenommen. Die Bilder wurden mit der cellSense Entry 1.5-Software (Olympus, Shinjuku, Tokio, Japan) erfasst ) mit konstanten Kameraeinstellungen, um einen Vergleich der FL-Fluoreszenzsignalintensitäten zu ermöglichen. Für den Smad2- und PCNA-Nachweis wurde ein konfokales Mikroskop Olympus FV3000 (Olympus Co. Tokio, Japan) unter Verwendung eines 60 × Ölimmersionsobjektivs (NA: 1,42) verwendet. Zur Anregung wurden Laserlinien von 543 nm verwendet. Die durchschnittliche Pixelzeit betrug 4 Bs. Z-Bildserien von 1 m optischer Dicke wurden im sequentiellen Scanmodus aufgenommen. Bilder von Alexa555 und DAPI wurden mit Adobe Photoshop Version 10.0 Software überlagert. Der Kontrast der Bilder wurde gleichermaßen erhöht, ohne die konstanten Einstellungen zu ändern.

RT-PCR-AnalyseNierenvon WT (n=5), AD (n=5) und TAD (n=5) wurden mechanisch gemahlen und in Trizol (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) gelöst ), nach 30-minütiger Inkubation bei 4 °C wurde die gesamte RNA isoliert [30]. Die RNA wurde in RNase-freiem Wasser geerntet und bei –70 °C gelagert. Für die reverse Transkription wurde ein High Capacity RT-Kit verwendet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Für die Sequenzen der aufgebrachten Primerpaare und Einzelheiten der Polymerase-Kettenreaktionen siehe Tabelle 1. Die Amplifikationen wurden in einem Thermocycler (Labnet MultiGene™ 96-well Gradient Thermal Cycler; Labnet International, Edison, NJ, USA) als durchgeführt folgt: 95◦C, 2 min, gefolgt von 35 Zyklen (Denaturierung, 94◦C, 30 s, Annealing für 45 s bei optimierten Temperaturen wie in Tabelle 1 angegeben; Verlängerung, 72◦C, 90 s) und dann 72◦C ,

7min. Actin wurde als interne Kontrolle verwendet. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung eines 1,2-prozentigen Agarosegels analysiert, das Ethidiumbromid enthielt, und mit dem FluorchemE Geldocumetary-System (ProteinSimple, CA, USA) dokumentiert. Optische Dichten von PCR-Produktsignalen wurden unter Verwendung von ImageJ 1,40 g Freeware bestimmt. Vor den Messungen der optischen Dichte haben wir auf jeder Mikrofotografie individuelle Kalibrierungen vorgenommen. Dann haben wir die Vergrößerung der Fotos erhöht, um eine individuelle Pixelgröße zu erreichen, und mit der Freihandmethode wurden Bahnen präzise umkreist und die integrierte Dichte des Bereichs gemessen. Die Pixel wurden in 5 unabhängigen Experimenten von 3 unabhängigen Bedienern gemessen. Für einen besseren Vergleich der Expressionsunterschiede in AD- und TAD-Mäusen wurden die Signale zunächst mit dem WT-Aktin verglichen. Die Zahlen unter den Bahnen zeigen die statistische Analyse der Experimente, bei denen jedes separate Experiment (mindestens 5) auf sein eigenes Aktinsignal normalisiert und dann statistische Unterschiede berechnet wurden.

Western-Blot-Analyse

Nierenvon WT- (n {0}}), AD- (n=5) und TAD-Mäusen (n=5) wurden in physiologischer Kochsalzlösung N gewaschen und bei –7{{1) gelagert 0}}◦C. Die Proben wurden mechanisch in flüssigem Stickstoff gemahlen und in 100 ml Homogenisierungs-RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay)-Puffer (150 mM Natriumchlorid; 1,0 % NP40, 0,5 % Natriumdeoxycholat; 50 mMTris, pH 8,0) gesammelt, der Protease-Inhibitoren (Aprotinin ( 10 g/ml), 5 mM Benzamidin, Leupeptin (10 ug/ml), Trypsin-Inhibitor (10 g/ml), 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 8 mM NaFluorid, 1 mM Na-orthovanadat). Die Pellets wurden durch Impulsstoß für 30 s bei 40 A beschallt (ColeParmer, IL, USA). Es wurden Gesamtzelllysate für Westernblot-Analysen hergestellt [30]. 20 g Protein wurden in 7,5-prozentigen SDS-Polyacrylamidgelen zum Nachweis von TGF-1, TGF R1, TGF-R2, Smad2, Smad3, ERK1/2, P-ERK1/2, p38, P-p38 aufgetrennt,

JNK, PP2A, PP2B, p21, PCNA, gespaltene Caspase3, MMP9, Kollagen Typ I (Spalte I) und Aktin. Das PhosphoSer/Thr-Nachweiskit (Millipore, Billerica, MA, USA) wurde verwendet, um das Phosphorylierungsniveau der Ser/Thr-Aminosäureseitenketten nachzuweisen. Die Proteine ​​wurden auf Nitrozellulosemembranen geblottet und den primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C in der in Tabelle 2 angegebenen Verdünnung ausgesetzt. Der Inkubation folgte ein 30-minütiges Waschen mit PBST, dann wurden die Membranen mit dem Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörper Anti-Kaninchen-IgG in einem 1 :1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) oder Anti-Maus-IgG in 1:1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) Verdünnung. Für den Nachweis wurde verstärkte Chemilumineszenz (Advansta Inc., Menlo Park, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Actin wurde als interne Kontrolle verwendet. Signale wurden mit einer gekühlten Kamera auf einem Geldokumentationssystem (Fluorchem E, ProteinSimple, CA, USA) erfasst. Optische Dichten von Signalen wurden unter Verwendung von ImageJ 1.40g Freeware gemessen. Vor den Messungen der optischen Dichte haben wir auf jeder Mikrofotografie individuelle Kalibrierungen vorgenommen. Dann haben wir die Vergrößerung der Fotos erhöht, um eine individuelle Pixelgröße zu erreichen, und mit der Freihandmethode wurden Bahnen präzise umkreist und die integrierte Dichte des Bereichs gemessen. Die Pixel wurden in 5 unabhängigen Experimenten von 3 unabhängigen Bedienern gemessen. Für einen besseren Vergleich der Expressionsunterschiede in AD und TAD wurden die Signale zunächst mit dem WT-Aktin verglichen. Die Zahlen unter den Bahnen zeigen die statistische Analyse der Experimente, bei denen jedes separate Experiment (mindestens 5) auf sein eigenes Aktinsignal normalisiert und dann statistische Unterschiede berechnet wurden.

statistische AnalyseAlle Daten sind repräsentativ für mindestens fünf unabhängige Experimente. Für alle Abbildungen wurden zum besseren Vergleich die Proben der gleichen WT-, AD- und TAD-Tiere mit ihrer inneren Kontrolle gewählt. In jeder Abbildung wurde nur ein demonstratives Foto derselben Tiergruppe verwendet. Die statistische Analyse wurde durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt von Tukey's HSD Post-Hoc-Test. Der Schwellenwert für statistisch signifikante Unterschiede im Vergleich zu Kontrollproben wurde auf ∗p < 0.05="" und="" auf="" ad-proben="" #p="">< 0,05="" festgelegt.="" *="" gibt="" die="" unterschiede="" wt="" im="" vergleich="" zu="" ad="" und="" tad="" an,="" #="" gibt="" die="" unterschiede="" ad="" im="" vergleich="" zu="" tad="">

ERGEBNISSE

Körperliche Aktivität normalisierte den kanonischen TGF-Signalweg in den Nieren von AD-MäusenDie Expression der Elemente des kanonischen TGFB-Signalwegs wurde eingehend untersucht. Die Protein- und mRNA-Expression von TGFB1 zeigte keinen signifikanten Unterschied, wennNierenvon WT- und AD-Mäusen wurden verglichen, aber die erhöhte Expression wurde in TAD-Proben gefunden ( 1A , B). Die Expression von TGFRI verringerte sich bei AD, aber körperliche Aktivität normalisierte sie (Abb. 1A, B), während die Expression von TGFBRII bei AD anstiegNierenvon AD-Mäusen, verringerte sich jedoch nach körperlicher Aktivität (Abb. 1A, B). In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen nahm die Expression von Smad2 in AD-Proben zu und normalisierte sich nach der körperlichen UntersuchungAktivität (Abb. 1A, B). Im Gegensatz dazu zeigte die Expression von Smad3 einen moderaten Rückgang inNierenvon AD-Mäusen, die in TAD-Proben kompensiert wurde (Fig. 1A, B). Eine Erhöhung von Smad2-positiven Signalen wurde im tubulären System des Kortex, aber nicht im Röhrensystem gesehenNieren-Blutkörperchen in AD-Mäusen. Diese Erhöhung war in Tubuli von TAD-Tieren reduziert (Fig. 1C).

Nicht-kanonische Signalwege wurden in Nieren von AD-Mäusen nach körperlicher Aktivität modifiziertMAPK-es wie ERK, p38 und JNK bilden einen wichtigen Teil der nicht-kanonischen TGF-Signalübertragung [22]. Die mRNA-Expression von ERK wurde nicht verändertNierenvon AD-Mäusen, zeigte jedoch eine Abnahme in TAD-Proben (Fig. 2A). Die Proteinexpression dieser Kinase korrelierte nicht mit der mRNA-Expression und es wurde eine starke Reduktion festgestelltNierenvon AD-Mäusen mit einer moderaten Normalisierung nach erhöhter körperlicher Aktivität (Abb. 2B). Die aktive, phosphorylierte Form war in AD-Proben interessanterweise erhöht und zeigte eine ähnliche Abnahme inNierenvon TAD-Mäusen (Abb. 2B). Die mRNA-Expression von p38 wurde in keiner Probe signifikant verändert (Fig. 2A). Die Proteinexpression von p38 nahm stark zu inNierenvon AD-Mäusen, die teilweise durch körperliche Aktivität kompensiert wurde (Abb. 2B). Interessanterweise zeigte die aktivere phosphorylierte Form eine Verringerung der AD-Proben, die

wurde in TAD-Tieren normalisiert (Fig. 2B). Die mRNA-Expression von JNK war sowohl in AD- als auch in TAD-Proben reduziert (Fig. 2A). Die Proteinexpression der 2 Isoformen von JNK wurde durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Nicht-redundante Funktionen für JNK1 und JNK2 wurden aufgedeckt [34] und es wurde eine signifikante Abnahme der 57-kDa-Isoform und der 46-kDa-Isoform in AD-Proben nachgewiesen (Abb. 2B). 57-kDa- und 46-kDa-Isoformen zeigten eine Erhöhung nach körperlicher Aktivität inNierenvon TAD-Mäusen (Abb. 2B).

Veränderte Expression von Ser/Thr-Phosphatasen und modifizierte Proteinphosphorylierung bei ADEine veränderte Expression und Funktion der Ser/Thr-spezifischen Proteinphosphatase wurde bei AD nachgewiesen [35, 36]. Wir fanden eine erhöhte Expression von PP2B inNierenvon AD-Mäusen, wurde jedoch durch körperliche Aktivität reduziert (Abb. 2A, B). Im Gegensatz dazu erschien die Expression der anderen wichtigen zellulären Ser/Thr-spezifischen Phosphatase, PP2A, mit einer starken Verringerung inNierenvon AD-Mäusen (Abb. 2A, B). In TAD-Proben nahm die mRNA- und Proteinexpression der katalytischen PP2A-Untereinheit zu (Abb. 2A, B). Die Untersuchung der Proteinphosphorylierung an Ser/Thr-Resten zeigte ein starkes Signal bei 55 kDa inNierenvon AD-Mäusen, die das Molekulargewicht von Tau darstellen (Fig. 2C). Eine weitere erhöhte Bande erschien bei 10 kDa, was dem Molekulargewicht des gespaltenen C-Terminus von APP entspricht (Fig. 2C). Die Phosphorylierung dieser beiden Proteine ​​wurde bei Belastung reduziert (Abb. 2C).

TGF signalisiert beeinflussten Zellzyklus und ApoptoseAls Marker der Zellproliferation wurden p21- und PCNA-Expressionsniveaus überwacht. Es ist bekannt, dass die TGFB-Aktivierung die Expression von p21 induziert [37]. Darüber hinaus führt die TGFB1-Aktivierung zu einer veränderten Zellproliferation [38]. Daher wurde die Expression des proliferierenden Zellkernantigens (PCNA) untersucht. Der Proteinspiegel von p21 war bei AD signifikant erhöht, aber bei TAD-Proben reduziert (Fig. 3A, B). PCNA reagierte unterschiedlich: AD verursachte eine Verringerung der Proteinexpression, während das PCNA-Protein bei Belastung zunahm (Abb. 3A, B). Immunhistochemie wurde durchgeführt, um PCNA-positive Zellen zu identifizieren, und führte zu einer verringerten Immunreaktivität in tubulären Zellen in Nieren von AD-Mäusen. Interessanterweise wurde in den tubulären Zellen von TAD-Mäusen eine normalisierte PCNA-Positivität gezeigt. Es wurden keine PCNA-positiven Zellen nachgewiesenNieren-Blutkörperchen (Abb. 3C). Da die TGF1-Signalgebung die Apoptose beeinflussen kann [39], wurde die aktive Form der proapoptotischen Caspase3 untersucht. Obwohl in WT-Proben eine leichte mRNA-Expression von Caspase3 nachgewiesen wurde, wurde keine gespaltene, aktive Capase3 gezeigt. Im Gegensatz dazu traten in AD-Proben eine starke mRNA und gespaltene Caspase3 auf, während eine erhöhte körperliche Aktivität die Expression des proapoptotischen Proteins reduzierte (Abb. 3A, B).

Die Nierenfibrose wurde durch körperliche Aktivität herunterreguliertFrühere Ergebnisse weisen auf eine mögliche Fibrose in den Nieren von AD-Tieren hin. Zunächst wurde die MMP9-Expression untersucht, die über die TGFB1-Aktivierung reguliert werden kann [21]. mRNA von MMP9 wurde in allen Proben exprimiert, zeigte aber nur in den Nieren von TAD-Mäusen einen signifikanten Anstieg. Die Proteinexpression der Matrix-Metalloproteinase lag bei WT-Proben an der Nachweisgrenze, zeigte jedoch eine signifikante Erhöhung bei AD-Tieren. Überraschenderweise erhöhte aktive körperliche Betätigung die MMP9-Expression dramatisch (Abb. 4A, B). Die andere Komponente fibrotischer Prozesse ist die vermehrte Ablagerung von Kollagen Typ I imNiere[40]. In WT-Proben wurde eine geringe mRNA- und Proteinexpression von Kollagen Typ I festgestellt, aber ein starker Anstieg wurde in AD-Tieren gezeigt. Aktive körperliche Bewegung normalisierte sowohl die mRNA- als auch die Proteinexpression von Kollagen Typ I (Abb. 4A, B). Kollagen Typ I umgibt normalerweise die Tubuli und ist auch im Interstitium lokalisiert. Bei routinemäßiger pathohistologischer Färbung von Massons Trichrom stellt die blaue Farbe das Vorhandensein jeglicher Art von Kollagen dar, das um die Tubuli herum sichtbar war.Nieren-Blutkörperchen und eine kleine Menge im Interstitium in WT-Nieren. In AD-Proben war eine starke Akkumulation im Interstitium und in einigen Tubuli sichtbar. Nach körperlicher Aktivität war die Kollagenmenge reduziert und es wurde keine Akkumulation im Interstitium festgestellt (Abb. 4C). Kollagen-Typ-I-Immunhistochemie wurde durchgeführt, um das akkumulierte Kollagen zu spezifizieren. Im WTNieren, ähnlich wie bei der Masson-Färbung, erschienen Signale um die Tubuli,Nieren-Blutkörperchen und ein schwaches interstitielles Signal waren ebenfalls sichtbar. In Proben von AD-Mäusen wurde eine starke Immunpositivität im Interstitium und um das tubuläre System herum gezeigt. Überraschenderweise war eine Reduktion im interstitiellen Gewebe sichtbar, aber ein signifikantes Signal erschien im apikalen Teil der Tubulus-Epithelzellen bei TAD-Tieren (Fig. 4D).

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DISKUSSION

Obwohl der Prozess der AD-Bildung im ZNS breit diskutiert wird, werden Veränderungen und mögliche periphere Begleitpathologien nicht im Detail untersucht. Das war unsere HaupthypotheseNiereFibrose ist ein möglicher Prozess, der die AD-Manifestation und die A-Akkumulation beeinflusst. Andererseits wirkt sich langfristiges körperliches Training positiv auf AD aus, was möglicherweise mit der systemischen Veränderung des TGFB-Signalwegs korreliert. Eine Beteiligung peripherer Organe an der AD-Pathogenese wurde nachgewiesen, da unter anderem eine veränderte metabolische Enzymaktivität bei AD-Patienten nachgewiesen wurde [41] und eine Akkumulation in der Bauchspeicheldrüse [42] und im Pankreas nachgewiesen wurdeNiere[30]. Diese systemische Erkrankung, die verschiedene Organe betrifft, erschwert die Früherkennung und Heilung von AD. Die Clearance von AD aus dem ZNS wird teilweise durch Astrozyten und Mikroglia reguliert, aber ein Teil davon kann nach Passieren der Blut-Hirn-Schranke in der Peripherie entfernt werden [43]. Diese periphere Clearance wird als eines der möglichen Arzneimittelziele angesehen, um die AD-Konzentration im Plasma zu reduzieren [44]. Die Sekretion kleiner Moleküle durch die proximalen Tubuli der Nieren stellt eine lebenswichtige homöostatische Funktion dar und kann an der Sekretion von Toxinen oder Proteinen in den Urin beteiligt sein [45]. Es wurde gezeigt, dass AD im Urin ausgeschieden wird und ein diagnostisches Zeichen für Demenz sein kann [46]; Darüber hinaus kann eine Nierenfunktionsstörung bei älteren Menschen das Demenzrisiko erhöhen [47], und es wurde festgestellt, dass die Serum-AD-Spiegel bei CKD-Patienten signifikant höher waren [10]. Diese Daten weisen auf eine mögliche Funktion desNierein der AD-Clearance in der Peripherie. Es hat sich gezeigt, dass körperliche Betätigung positive Auswirkungen auf die Nierenfunktion hat, da sie die richtige glomeruläre Morphologie bewahrt und die tubuläre Sekretion schützt [48]. Es hat sich gezeigt, dass eine erhöhte körperliche Aktivität die TGFB-Signalisierung in den Nieren verringert, und körperliche Bewegung kann eine gute antifibrotische Strategie sein [32]. Insgesamt kann die TGF-Aktivierung eine direkte Verbindung zu körperlicher Aktivitätssignalisierung haben, die die AD-Clearance in der Peripherie aufrechterhalten kann. Daher untersuchten wir den TGFB-Signalweg in WT-, AD- und langzeittrainierten AD-Mäusen.

In der aktuellen Studie wurde gezeigt, dass die TGFFRII-Expression in den Nieren von AD-Mäusen erhöht und in TAD-Proben teilweise normalisiert war. Der erhöhte TGFBRII weist auf eine verstärkte Aktivierung des TGFB-Signalwegs bei AD hin [49]. Die verringerte TGF RI-Expression zeigte, dass TGF mit höherer Affinität an TGFBRII bindet und eine Homodimerbildung bei AD wahrscheinlich ist [50]. Ähnlich wie diese Ergebnisse wurde die Bildung von TGFFRII-Homodimeren in Makrophagen in gezeigtNieren-Fibrose [51]. Andererseits gleicht langfristiges Training die Expression von TGFB-Rezeptoren aus, was auf eine heterodimere Rezeptorkomplexbildung hindeutet, die durch die erhöhte TGFB1-Expression stabilisiert werden kann [50]. Darüber hinaus wurde die Smad2- und Smad3-Expression bei AD kontrovers verändert. Smad2 wird bekanntermaßen klassisch durch TGF-Rezeptoren aktiviert und in den Zellkern transloziert, während Smad3 eine eigene Funktion hat [52]. Es wurde veröffentlicht, dass die Herunterregulierung von Smad3 die Fibrose beeinflusst [53]. Die normalisierte Expression von Smad-Transkriptionsfaktoren in TAD-Proben weist darauf hin

dass körperliche Aktivität die TGFB-Signalgebung wieder ins Gleichgewicht brachte und ihre pathobiochemische Aktivierung reduzierte. Die Familie der mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK), die p38MAPK, JNK und ERK enthält, hat eine Wechselwirkung mit der TGF-Signalisierung [54]. Eine erhöhte Expression von p38 wurde in tubulären Epithelzellen gezeigt, die eine Nierenfibrose induzieren, und ihre Blockierung kann ein gutes Ziel der Fibrosebehandlung sein [55]. In AD-Mäusen wurde eine erhöhte p38-Proteinexpression nachgewiesen, was die Fifibrosebildung weiter unterstützt. Im Gegensatz dazu war die p38-Phosphorylierung in AD-Nieren reduziert, was auf eine vom Fibrosestadium abhängige Aktivierung von p38 MAPK hindeutet [56]. Andererseits normalisierte erhöhte körperliche Aktivität teilweise sowohl das in der Niere vorhandene p38 als auch die phosphorylierte Form, was auf eine ausgleichende Funktion des Trainings bei der p38--vermittelten Fibrosebildung hindeutet. Ähnlich wie bei p38-Kinase kann die Hemmung von JNK die Fibrosebildung unterdrücken [57]. Die JNK-Aktivierung hat verschiedene Funktionen in verschiedenen Teilen der Niere, wie z. B. die glomeruläre Filtration und interstitielle fibrotische Prozesse [58]. Der Proteinextrakt in unseren Experimenten, der aus Gesamtnierenlysat stammt, weist darauf hin, dass JNK während der AD-Entwicklung wahrscheinlich eine unterschiedliche Funktion in den tubulären und glomerulären Teilen mit zellspezifischer Isotyp-Aktivierung in AD-betroffenen Nieren hat. Die TGFB1-induzierte MMP-Aktivierung wurde in Abhängigkeit von der p38-Funktion berichtet [59], während die Hemmung der ERK-Aktivität die interstitielle Fibrose reduzierte [60]. Diese Daten unterstützen deutlich die unterschiedlichen Funktionen der Mitglieder der MAPK-Familie bei der Pathogenese der Nierenfibrose bei AD. Wir entdeckten eine niedrige ERK-Expression in den Nieren von AD-Mäusen, während die Menge seiner phosphorylierten, aktiven Form signifikant erhöht war. In der experimentellen Gruppe von Mäusen, die an langfristigem körperlichen Training teilnahmen, stellten wir eine normalisierte ERK- und Phospho-ERK-Expression und eine positive Wirkung auf festNierenfunktion.Diese Beobachtungen unterstützen den Beitrag von ERK zur fibrotischen Transformation von Nieren bei AD und zeigen einen überraschend offensichtlichen positiven Einfluss von körperlichem Training auf die Nierenmorphologie und -funktion von AD-Mäusen. Kürzlich hat unser Labor die Beteiligung von ERK an der Mechanotransduktion sich entwickelnder Knorpelzellen nachgewiesen [61].

TGFBRII-, Smad-, JNK-, p38- und ERK-Phosphorylierung treten an Ser-Resten auf [62], was eine mögliche Aktivierung von Ser/Thr-Phosphatasen nahe legt. Eine PP2B-Dysregulation wurde bei AD nachgewiesen [35, 63]. Andererseits reguliert PP2B die Phosphorylierung von Tau im Gehirn nicht signifikant, obwohl es in der Lage ist, es an mehreren Phosphorylierungsstellen zu dephosphorylieren [35]. Die andere wichtige zelluläre Ser/Thr-Phosphatase, PP2A, dephosphoryliert ebenfalls Proteine ​​an Ser-Resten und ihre Aktivität ist bei AD reduziert und sie ist in der Lage, die Tau-Phosphorylierung mit höherer Affinität als PP2B zu regulieren [64]. In Nieren von AD-Mäusen wurde, ähnlich wie im ZNS, eine reduzierte PP2A-, aber eine erhöhte PP2B-Expression nachgewiesen. Erhöhte Phosphorylierung an Ser-Resten als Ergebnis einer Abnahme der PP2A-Expression kann die Hyperphosphorylierung von Tau-Protein oder APP induzieren, wie es in den Nieren von AD-Mäusen vorhergesagt wurde. Die Dephosphorylierung von JNK und p38 kann direkt durch PP2B reguliert werden [65], daher kann die verringerte Aktivierung dieser Kinasen bei AD die Folge einer erhöhten PP2B-Expression sein. Andererseits kann die ERK-Kinase-Dephosphorylierung dominant durch PP2A-Aktivierung erfolgen [66], eine anschließend reduzierte Expression von PP2A kann zu einer erhöhten ERK-Phosphorylierung bei AD führen. Langfristiges Training von AD-Mäusen wirkte auf die Normalisierung der PP2B- und PP2A-Expression, was wiederum den Ser/Thr-Phosphorylierungsspiegel von MAPK-Enzymen näher an den Normalwert zu verschieben schien. Die mechanische Belastung übte durch die Beteiligung von PP2B und PP2A auch an differenzierenden Chondrozyten einen ausgleichenden Effekt auf die reversible Phosphorylierung aus [61].

Die Aktivierung des nicht-kanonischen TGFB-Signalwegs reguliert die Zellproliferation und Apoptose. Ähnlich wie bei unseren Ergebnissen wurden p21-positive Zellen im tubulären System der Niere gezeigt [67], und wir zeigten auch ihre erhöhte Expression bei AD. Diese Erhöhung deutet auf einen durch MAPK-Aktivierung vermittelten Zellzyklusarrest bei AD hin, während p21 mit PCNA interagiert und Zellen in der S-Phase des Zellzyklus blockiert [68]. Wir haben eine p21-Aktivierung und eine wahrscheinlich daraus resultierende starke PCNA-Reduktion im tubulären System von AD-Mäusen nachgewiesen. Ähnlich wie bei unseren früheren Erkenntnissen normalisierte eine verstärkte körperliche Aktivität den Zellzyklus in den Zellen des tubulären Systems. Andererseits hat p21 auch einen Zusammenhang mit Caspase-Aktivierung und JNK, während ERK auch Caspase3-Spaltung induziert [69, 70]. Es wurde festgestellt, dass die Caspase3-Aktivierung eine wichtige Rolle in der AD-Pathogenese über A-Akkumulation und Caspase-vermittelte ABPP-Spaltung-induzierte synoptische Störungen spielt [71]. In den Nieren von AD-Mäusen entdeckten wir hohe Expressionen von gespaltener Caspase 3, was auf eine erhöhte Apoptose und den Funktionsverlust von tubulären und glomerulären Zellen hinweist. Diese Prozesse können die Akkumulation von AD im Niereninterstitium fördern, wie wir bereits gezeigt haben [30].

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENINFEKTIONEN VERBESSERN

Es wurde gezeigt, dass die TGFB-vermittelte Signalisierung die Kollagenexpression und -akkumulation im Interstitium erhöht [40]. Gemäß diesen Ergebnissen zeigten wir in Nieren von AD-Mäusen eine signifikant erhöhte Kollagen-Typ-I-Expression, die im Interstitium akkumuliert war. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass eine veränderte kanonische und nicht-kanonische TGFB-Signalisierung bei AD eine entscheidende Rolle bei der Nierenfibrose spielt [18, 72]. Im Gegensatz dazu reduzierte langfristiges Training die interstitielle Kollagen-Typ-I-Lokalisierung zumindest teilweise durch eine Neuausrichtung der TGFB-Signalisierung. Reduzierte Fifibrose kann AD-Clearance induzieren und verringernNieren-Akkumulation, wie wir früher gezeigt haben [30]. Diese Hypothese wurde durch unsere Ergebnisse gestützt, da körperliches Training zu einer Akkumulation von Kollagen Typ I in tubulären Epithelzellen führte, was in den Nieren von TAD-Mäusen nachgewiesen wurde, was den Kollagenabbauprozess impliziert. MMP9 kann durch TGFB-Signalisierung in der Niere aktiviert werden [73] und führt zum Abbau von Matrixfibrillen. Obwohl MMPs sowohl eine hemmende als auch eine stimulierende Rolle bei der Fibrose spielen, wird MMP9 als profibrotisches Mittel angesehen, das durch die TGFB-Aktivierung vermittelt wird [74]. Im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass MMP9 eine regulatorische Rolle beim Kollagen-Typ-I-Abbau in der Niere spielen kann [75]. In den Nieren von AD-Mäusen zeigten wir eine erhöhte MMP9-Expression, was auf seine Funktion im fibrotischen Prozess hindeutet, der durch die TGFB-Signalkaskade kontrolliert wird. Andererseits wurde nach langem Training eine weitere Erhöhung gemessen, was der Grund für die starke Verringerung der Expression und des tubulären Auftretens von Kollagen Typ I sein kann. Bei mechanischem Stimulus hat unser Labor gezeigt, dass die MMP9-Expression in primären chondrogenen Kulturen erhöht war [76], und ähnliche Ergebnisse wurden bei der Bildung von Narbengewebe veröffentlicht, wo mechanische Kompression die Expression von MMP9 erhöhte [77]. Bei akuter Nierenschädigung hat die Erhöhung von MMP9 eine antiapoptotische Funktion und schützt den S3-Teil der proximalen Tubuli [78]. Darüber hinaus wurde auch in der Lunge ein durch Scherstress aktivierter TGFB-Signalweg und eine verminderte Fibrosenbildung nachgewiesen [79]. Darüber hinaus induzierte mechanischer Stress in Lungenepithelzellen den Umbau von ECM über die Aktivierung von MMP9 und veränderte die Kollagenexpression [80]. Daher können wir schlussfolgern, dass eine erhöhte körperliche Aktivität die Umgestaltung der Matrixproduktion durch Modulation der TGFB-Signalisierung nicht nur lokal, sondern auch systemisch induziert. Die Einschränkungen unserer Arbeit bestehen darin, dass transgene Mäuse möglicherweise eine schnellere AD-Bildung aufweisen und die Nierenfunktion nicht im Detail untersucht wird. Es muss weiter untersucht werden, dass nur die TGFB-induzierte Matrixproduktion in fibrotischen Nieren von AD-Mäusen verändert wird oder die Regulierung des Natrium- und Kaliumhaushalts und der AD-Clearance auch am Langzeittraining beteiligt ist. Darüber hinaus kann auch die Akkumulation von Kollagen Typ I im Urin weiter verfolgt werden, um zu verbessern, dass langfristiges körperliches Training bei AD zu einer Verringerung der Nierenfibrose führt. Andererseits haben wir in vivo bewiesen, dass langfristiges körperliches Training einen systemischen Effekt auf die kanonische und nicht-kanonische TGFB-Signalgebung hat. In vivo konnten wir zeigen, dass körperliches Training die Bildung von Nierenfibrose bei AD reduziert, was sich positiv auf die Manifestation der Krankheit auswirkt. Zusammenfassend legen unsere Daten nahe, dass die Aktivierung von TGFB-Signalwegen eine ursächliche Rolle bei der fibrotischen Transformation der Nieren von AD-Mäusen spielt. Als sehr einfachen Ansatz, um positive Veränderungen in diesem Zustand zu erreichen, empfehlen wir langfristiges körperliches Training, da es die Expression und Phosphorylierung von Mitgliedern der kanonischen und nicht-kanonischen TGFB-Signalwege normalisieren und zu einer Verbesserung der Nierenfibrose führen konnte. Darüber hinaus kann körperliche Betätigung, die die Fibrose hemmt, die Nierenfunktion wieder ins Gleichgewicht bringen und eine erhöhte Clearance von systemischer AD bei AD induzieren.