Phytochemische Analyse, In-vitro-Proliferationshemmer, Antioxidans Teil 1

Kontaktieren Sie bitteoscar.xiao@wecistanche.comfür mehr Informationen

Hintergrund:Rumex rothschildianus ist das einzige Mitglied einer einzigartigen Sektion der Gattung Rumex in der Familie Polygonaceae. Diese Art ist eine sehr seltene kleine zweihäusige einjährige Pflanze, die in Palästina endemisch ist und traditionell als Nahrung und zur Behandlung verschiedener Krankheiten verwendet wird. Daher zielte die aktuelle Untersuchung darauf ab, die chemischen Bestandteile, Antioxidantien, Anti-a-Amylase, Anti-a-Glucosidase, Antizipation und zytotoxische Wirkungen von vier Lösungsmittelfraktionen von R. rothschildianus-Blättern zu untersuchen.

Methoden:Getrocknetes Pulver von R. rothschildianus-Blättern wurde in vier Lösungsmitteln mit unterschiedlichen Polaritäten extrahiert. Zur Bestimmung der Inhaltsstoffe der Extrakte wurden mehrere qualitative und quantitative phytochemische Tests durchgeführt. Die kolorimetrische Analyse diente der quantitativen Bestimmung von Phenolen, Flavonoiden und Tanninen. In-vitro-Assays wurden durchgeführt, um die Extrakte auf Antioxidantien, Anti-a-Amylase, Anti-a-Glucosidase und antizipative inhibitorische Aktivitäten sowie Zytotoxizität durch MTS-Assay gegen die Zervixkarzinom-Zelllinie (HeLa) und die Brustkrebs-Zelllinie zu bewerten (MCF7).

Bitte klicken Sie hier, um mehr zu erfahren

Ergebnisse:Die Acetonfraktion der Blätter von R. rothschildianus zeigte die signifikantesteAntioxidansAktivität, aufgrund des höchsten Gehalts an Flavonoiden und Phenolen, mit einem ICso-Wert von 6,3±0,4 ug/ml, verglichen mit 3,1±0,9 ug/ml für Trolox, und ungefähr Lipase-Inhibitionsaktivität Die Acetonfraktion zeigte die stärkste Aktivität mit einem ICso-Wert von 26,3±{{1{0}},6 ug/ml, im Vergleich zur Orlistat-Positivkontrolle ICso 12,3 ug/ml. Derselbe Extrakt war der stärkste Inhibitor von a-Amylase und a-Glucosidase mit ICso-Werten von 19,1 ± 0,7 ug/ml bzw. 54,9 ± 0,3 ug/ml im Vergleich bis 28,8, 37,1 ± 0,3 ug/und Acarbose. Die Hexanfraktion zeigte eine 99,9-prozentige Hemmung von HeLa-Zellen und eine 97,4-prozentige Hemmung von MCF7-Zellen.

Fazit:Die Acetonfraktion von R. rothschildianus-Blättern könnte eine Quelle für bioaktive Verbindungen zur Behandlung von oxidativem Stress darstellen. In ähnlicher Weise weist der Hexananteil auf das vielversprechende Antitumorpotential von R. rothschildianus hin. Diese anfänglichen Indikationen erfordern eindeutig eine weitere Reinigung potenziell aktiver Verbindungen und letztendlich In-vivo-Studien, um ihre Wirksamkeit zu bestimmen.

Schlüsselwörter:Rumex rothschildianus, Antioxidans, Lipase, Amylase, Trolox, Phytochemie, antiproliferative Aktivität

Hintergrund

Pflanzen werden seit der Antike als Heilmittel eingesetzt. Wurzeln, Samen, Rinde, Blätter und Blüten wurden alle für Heilzwecke verwendet. Heutzutage sind synthetische Arzneimittel verfügbar und bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten wirksam; Einige Menschen bevorzugen jedoch immer noch pflanzliche Arzneimittel, da sie als weniger schädlich für den menschlichen Körper angesehen werden [1,2]. Heilpflanzen sind per Definition die Quelle von phytochemischen Verbindungen, die therapeutische Aktivitäten besitzen. Diese Eigenschaften beruhen auf dem Vorhandensein verschiedener sekundärer Metaboliten wie Phenole, Terpenoide und Alkaloide [3]. Rumex rothschildianus Aarons. ist das einzige Mitglied einer einzigartigen Sektion der Gattung Rumex in der Familie Polygonaceae. Diese Art ist eine sehr seltene kleine zweihäusige einjährige Art, die in Palästina endemisch ist. Sie hat eine durchschnittliche Höhe von 45 cm und zeichnet sich durch aufrechte Stängel aus, die radikal gestielte Blätter tragen, die an der Basis kurz behaart und an der Spitze kurz zugespitzt sind. Blüten haben einen Durchmesser von 3-4 mm, während Pistillatblüten einen Durchmesser von etwa 2 mm mit einer lederartigen Membranschicht haben [4]. Rumex spp. sind in verschiedenen Regionen der Türkei weit verbreitet und mit 22 Arten vertreten. Einige der häufigsten Arten sind R. patientia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus und R. caucasicus sind mehrjährige Pflanzen, die in Mittel- und Ostanatolien in einer Höhe von {{10 }} m über dem Meeresspiegel. Die Gattung Rumex wird in der traditionellen Medizin in der Türkei häufig zur Behandlung von Erkrankungen wie Verstopfung, Durchfall und Ekzemen eingesetzt [5, 6]. Die Gattung hat auch einige abführende, harntreibende, fiebersenkende, wundheilende und entzündungshemmende Wirkungen. Viele Menschen im östlichen Teil der Türkei verwenden die jungen Blätter von Rumex spp. als Konservierungsmittel in Käse sowie als Lebensmittelaroma [7].

An Rumex-Spezies wurde eine Vielzahl von Untersuchungen durchgeführt, z. B. über antimikrobielle Aktivitäten, die für einige Arten berichtet wurden. Einige bioaktive Phytochemikalien wurden zuvor in Rumex Vicarious L gefunden, wie Carotinoide, Tocopherole, Polyphenole, Flavonoide und Ascorbinsäure, die eine Rolle als Antioxidantien und natürliche Entgiftungsmittel spielen. Die Nahrungsaufnahme von antioxidativen sekundären Pflanzenstoffen, wie Carotinoiden,Phenole, undFlavonoidekann beim Menschen vor nicht übertragbaren Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und anderen Gesundheitsproblemen im Zusammenhang mit oxidativem Stress schützen [5, 8]. Schädliche freie Radikale spielen bekanntermaßen eine wichtige Rolle bei vielen großen Gesundheitsproblemen wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, rheumatoider Arthritis, Katarakt,Alzheimer-Krankheit, und andere degenerative Erkrankungen im Zusammenhang mit dem Altern. Antioxidantien sind nützliche Komponenten, die diese freien Radikale neutralisieren, bevor sie Zellen angreifen können, und somit Schäden an Zellproteinen, Lipiden und Zellproteinen verhindernKohlenhydrate. Eine Vielzahl sowohl natürlicher als auch synthetischer Antioxidantien wurde für die Behandlung menschlicher Krankheiten vorgeschlagen. Dieses Interesse an der Rolle von Antioxidantien für die menschliche Gesundheit hat zu Forschungen in den Bereichen Lebensmittelwissenschaft und Heilkräuter geführt, bei denen die Funktion von Kräutern als Antioxidantien bewertet wurde. Die antioxidative Wirkung umfasst die Fähigkeit zum Abfangen freier Radikale, die Hemmung der Lipidperoxidation, die Fähigkeit zur Chelatisierung von Metallionen und auch die Reduktionskapazität [9,10].

Krebs ist eines der globalsten Gesundheitsprobleme. Die Entwicklung und Entdeckung neuartiger Krebsmedikamente bleibt aufgrund verschiedener Faktoren äußerst wichtig. Zu diesen Faktoren gehören Behandlungen, die schwerwiegende Nebenwirkungen verursachen oder ziemlich teuer sein können. Alternativen, die biologisch sicherer und erschwinglicher sind, sind nach wie vor sehr wünschenswert [11-14].

Mehrere Pflanzenarten gelten als potenzielle Quellen für bioaktive Moleküle wie Atropin aus Belladonna-Blättern, Kokain aus Kokablättern, Vincristin aus der Vinca-Pflanze und viele andere, die in der modernen Medizin immer noch eine wichtige Rolle spielen [15,16].

Nützliche therapeutische Wirkungen können durch das Mischen von Sekundärprodukten erzielt werden, die in Heilpflanzen enthalten sind. Diese Verbindungen sind meist Sekundärmetaboliten, wie Alkaloide, Steroide, Tannine, Flavonoide und Phenole, die in bestimmten Teilen dieser Pflanzen synthetisiert und abgelagert werden [17,18]. Die vorliegende Studie untersucht die In-vitro-Anti-a-Amylase-, Anti- --Glucosidase-, Antilipase-, antiproliferativen und antioxidativen Aktivitäten verschiedener Fraktionen, die aus R. rothschildianus-Blättern extrahiert wurden.

Methoden

Pflanzenmaterial, Chemikalien und Instrumente

R. rothschildianus-Blätter wurden zwischen Februar und März 2018 in den westlichen Regionen Palästinas geerntet. Sie wurden von Dr. Nidal Jaradat vom Pharmacognosy Laboratory der An-Najah National University unter dem Gutscheinmustercode Pharm-PCT identifiziert{{3} }. Alle Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Ein Spektrophotometer-UV/Visible (Jenway Degree 7135, Stafford-shire, UK), Filterpapiere (Whitman No. 1, Washington, USA), Schüttelgerät (Memmert 531-25-1, Stockholm, Schweden), Rotavap-Apparat (Heidolph -VV 2000, Schwabach, Deutschland), Mühle (Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, China), elektronische Waage (Radwag, AS 220/c/2, Torunska, Polen), Gefriertrockner-BT85 (Millrock Technology, China) und Kryo-Exsikkator (Millrock Technology, BT85, Kingston, USA) verwendet.

Herstellung von Extrakten und Fraktionierung

Getrocknetes Pulver von R. rothschildianus-Blättern wurde durch Zugabe von Lösungsmitteln nacheinander basierend auf ihrer Polarität extrahiert, beginnend mit dem unpolaren Lösungsmittel Hexan und dann Aceton (ein polares aprotisches organisches Lösungsmittel), Methanol (polarer Alkohol) und schließlich destilliertes Wasser (a polar protisches Lösungsmittel). Für jede Extraktion wurden etwa 25 g gemahlene getrocknete Blätter in 0,51 Hexan für 72 Stunden in einer Schüttelvorrichtung bei 100 Umdrehungen pro Minute bei 25 Grad gegeben. Zuerst wurde das Hexan durch 0,5 l Aceton ersetzt, und der anschließende Austausch umfasste äquivalente Volumina an Methanol und Wasser. Die Inkubationen in den Lösungsmitteln waren wie oben für Hexan beschrieben. Jede organische Fraktion wurde filtriert und unter Vakuum auf einem Rotationsverdampfer konzentriert, während die wässrige Fraktion unter Verwendung eines Gefriertrockners getrocknet wurde. Schließlich wurden alle Rohfraktionen bei 4 Grad gelagert [19,20].

Die Ausbeute jeder Fraktion wurde nach folgender Formel berechnet:

Vorläufige phytochemische Bewertung

Phytochemische Screening-Tests von R. rothschildianus-Blättern in vier Fraktionen wurden durchgeführt, um aktive sekundäre Metaboliten zu identifizieren. Die qualitativen Ergebnisse wurden als ( plus ) für das Vorhandensein und (-) für das Fehlen von bioaktiven Phytochemikalien ausgedrückt [10,21].

Bestimmung des Gesamtphenolgehalts (TPC)

Das Verfahren zur Bestimmung von TPC basierte auf dem von Cheung et al. TPC wurde in Milligramm Gallussäureäquivalenten pro Gramm Trockengewicht der Blätter (mg GA/g Trockengewicht) ausgedrückt. Eine frisch zubereitete 7,5-prozentige Natriumcarbonatlösung wurde hergestellt, indem 7,5 g Na2CO3 in einen Messkolben gegeben und das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml eingestellt wurde. Eine Standardreferenzlösung (Gallussäurelösung) wurde durch Auflösen von 100 mg Gallussäure in destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml hergestellt. Daraus wurde eine Reihenverdünnung durchgeführt, um Lösungen von Gallussäure mit 100, 70, 50, 40 und 10 ug/ml） zu erhalten. Die Stammlösungen der Fraktionen aus Blättern wurden durch Auflösen von 100 mg Pflanzenextrakt in destilliertem Wasser hergestellt und auf ein Gesamtvolumen von 100 ml eingestellt. Reaktionsmischungen wurden hergestellt durch Mischen von 0,5 ml jeder Fraktionslösung mit 2,5 ml 10-prozentigem Folin-Ciocalteu-Reagens, das in Wasser mit 2,5 ml 7,5-prozentigem Natriumbicarbonat gelöst wurde. Die Probenröhrchen wurden für 45 min bei 45 Grad inkubiert. Dann wurde die Extinktion von jedem in einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 765 nm gemessen. Die Arbeitsproben wurden für jeden analytischen Versuch in dreifacher Ausfertigung hergestellt, aus denen die mittleren und Standardabweichungswerte berechnet wurden [21].

Bestimmung des Gesamtflavonoidgehalts (TFC)

Der TFC in den vier R. rothschildianus-Blattfraktionen wurde unter Verwendung einer Kalibrierungskurve von Rutin (Standardreferenzverbindung) bewertet. Die Ergebnisse wurden als Milligramm Rutinäquivalent pro Gramm Trockengewicht des Blattextrakts (mg RU/g Trockengewicht) ausgedrückt. Eine Kalibrierungskurve für Rutin wurde unter Verwendung von Reihenverdünnungen erstellt, die aus einer Stammlösung von 1 {{1{0}} 0 ug/ml erzeugt wurden. Zur Herstellung der Stammlösung wurden 10 mg Rutin in 10 ml destilliertem Wasser gelöst und dann auf 100 ml verdünnt. Anschließend wurde die Stammlösung verdünnt, um Rutin in Konzentrationen von 10, 30, 40, 50, 70 und 100 ug/ml bereitzustellen. Zur Herstellung der Arbeitslösung wurden 0,5 ml jeder Fraktionslösung mit 3 ml Methanol, 0,2 ml 10 % AlCl 3 , 0,2 ml 1 M Kaliumacetat und 5 ml destilliertem Wasser gemischt und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die vorherigen Schritte wurden für jede der Fraktionen wiederholt, wonach die Extinktion bei einer Wellenlänge von 415 nm gemessen wurde. Für eine Blindkontrolle wurde anstelle des Probenextrakts eine Arbeitslösung mit destilliertem Wasser angesetzt. Die Proben wurden für jeden analytischen Versuch in dreifacher Ausfertigung hergestellt, aus denen die mittleren und Standardabweichungswerte berechnet wurden [22].

Bestimmung des Gesamttanningehalts (TTC) Das Protokoll von Sun et al. wurde verwendet, um TTC in den vier Blattfraktionen von R. rothschildianus zu bestimmen, was das am häufigsten verwendete Verfahren ist. Catechin wurde als Referenzverbindung verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen. Eine 100 ug/ml-Stammlösung in Methanol wurde hergestellt, aus der eine Verdünnungsreihe hergestellt wurde, um Catechin-Konzentrationen von 10, 30, 50, 70 und 100 ug/ml zu ergeben. Eine 4-prozentige Lösung von Vanillin in Methanol wurde frisch hergestellt. Vorratslösungen der Fraktionen mit 100 ug/ml wurden unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel hergestellt. Für die Arbeitslösung wurden 0,5 ml jeder Fraktionslösung mit 3 ml Vanillinlösung und 1,5 ml konzentrierter HCl gemischt. Das Gemisch wurde 15 min stehengelassen und dann wurde die Extinktion bei 500 nm gemessen, wobei eine Arbeitslösung verwendet wurde, die mit Methanol anstelle des Probenextrakts als Blindprobe angesetzt wurde. Alle Arbeitsproben wurden dreifach analysiert, woraus die mittleren und Standardabweichungswerte berechnet wurden. Das Gesamttannin in jeder Fraktion wurde in Form von Catechin-Äquivalenten (mg CAE/g Trockengewicht der Blätter) ausgedrückt[23].

Methode der antioxidativen Aktivität

Der freie 2,2--Diphenyl-picrylhydrazyl (DPPH)-Radikalfänger-Assay wurde verwendet, um die antioxidative Aktivität in den verschiedenen Fraktionen von R. rothschildianus-Blättern zu messen. Eine Stammlösung von 1000 ug/ml jeder Pflanzenfraktion wurde in Methanol hergestellt. Zusätzlich wurde auch eine 1000 ug/ml Lösung von Trolox hergestellt (der Referenzstandard). Eine Verdünnungsreihe wurde aus den Stammlösungen für jede Fraktion hergestellt, was sechs Reihenverdünnungen mit 2, 5, 10, 20, 50 und 100 ug/ml ergab. Ein ml jeder Extraktverdünnung wurde mit 1 ml 0,002 g/ml DPPH in Methanol gemischt. 1 ml Methanol wurde zugegeben, um ein endgültiges Arbeitsvolumen von 3 ml zu ergeben. Die DPPH-Lösung wurde frisch hergestellt, da sie sehr lichtempfindlich war. Die Blindkontrolle der Konzentrationsreihen war DPPH in Methanol im Verhältnis 1:2, ohne Zusatz eines Extraktes. Alle Arbeitslösungen wurden bei Raumtemperatur (25 Grad) im Dunkeln für etwa 30 min inkubiert. Optische Dichten wurden dann mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 517 nm gemessen. Die folgende Gleichung wurde verwendet, um die prozentuale DPPH-Hemmung für jede Pflanzenfraktion mit Trolox als Standardverbindung zu berechnen:

wobei Ag die aufgezeichnete Extinktion der Blindlösung und Ats die aufgezeichnete Extinktion der getesteten Probenlösung ist [21].

Pankreaslipase-Inhibitionsassay aus Schweinen

Stammlösungen von 500 ug/ml wurden von jeder Pflanzenfraktion in 10 Prozent DMSO hergestellt. Daraus wurde eine Verdünnungsreihe von fünf Konzentrationen von 50,100,200, 300 und 400 ug/ml hergestellt. Eine 1 mg/ml Stammlösung von Schweinepankreaslipase in Tris-HCl-Puffer wurde unmittelbar vor der Verwendung frisch hergestellt. Das Substrat p-Nitrophenylbutyrat (PNPB) wurde durch Auflösen von 20,9 mg in 2 ml Acetonitril hergestellt. Für jede Arbeitslösung wurden 0,1 ml Schweinepankreaslipase mit 0,2 ml Pflanzenfraktion von jedem Mitglied der Verdünnungsreihe gemischt. Tris-HCl wurde zugegeben, um das Endvolumen der Arbeitslösungen auf 1 ml einzustellen, und sie wurden 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 0,1 ml p-Nitrophenylbutyrat-Lösung zu jedem Reagenzglas gegeben. Die Mischung wurde dann für weitere 30 min bei 37 Grad inkubiert. Pankreaslipaseaktivität wurde durch Messen der Hydrolyse von PNPB zu p-Nitrophenolat bei 410 nm unter Verwendung eines UV-Spektrophotometers bestimmt. Das gleiche Verfahren wurde unter Verwendung von Orlistat als Standardreferenzverbindung wiederholt. Die prozentuale Lipasehemmung durch Pflanzenfraktionen wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:

wobei Ap die aufgezeichnete Extinktion der Blindlösung und Ats die aufgezeichnete Extinktion der getesteten Probenlösung ist [24]. a-Amylase-Hemmtest

A100 mg jeder Fraktion wurden in einigen Millimetern 10-prozentigem DMSO gelöst und dann weiter bis zu 100 ml in 0,02 M Na HPOq/ gelöst. NaH-PO4, 0,006 M NaCl, pH 6,9, um schließlich Stammlösungen mit Konzentrationen von 1000 ug/ml zu ergeben. Aus diesen wurden die folgenden Verdünnungen von 10, 50, 70, 100 und 500 ug/ml unter Verwendung von 10 % DMSO als Verdünnungsmittel hergestellt. Ein 0,2-ml-Volumen von 2 Einheiten/ml Schweine-Pankreas-Amylase wurde mit 0,2 ml gemischt

Pflanzenfraktion und wurde für 10min bei 30 Grad inkubiert. Nach der Inkubation wurden 0,2 ml einer frisch hergestellten 1-prozentigen Stärkelösung in Wasser zugegeben, und die Röhrchen wurden dann für mindestens drei weitere Minuten inkubiert. An diesem Punkt wurde die Reaktion durch die Zugabe von 0,2 ml 3,5--Dinitrosalicylsäure (DNSA)-Farbreagens gestoppt und mit 5 ml destilliertem Wasser verdünnt, bevor sie 10 Minuten lang in Wasser auf 90 Grad erhitzt wurde Bad. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und die Extinktion bei 540 nm gemessen. Die Blindkontrolle wurde unter Verwendung der gleichen oben beschriebenen Mengen hergestellt, wobei jedoch die Pflanzenfraktion durch 0,2 ml Puffer ersetzt wurde. Acarbose wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren als Standardreferenz verwendet. a-Amylase-Hemmaktivität wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet:

wobei Ag: die Extinktion der Blindprobe und Ar die Extinktion der Testprobe ist [25].

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Jaradat et al. BMC Komplementärmedizin und Therapien (2021) 21:107