Abstrakt:

Jüngste Studien haben gezeigt, dass Plumbagin entzündungshemmende, antiallergische, antibakterielle und krebsbekämpfende Wirkungen hat; Es wurde jedoch noch nicht gezeigt, ob Plumbagin die durch das Alpha-Melanozyten-stimulierende Hormon (-MSH) induzierte Melaninsynthese unterdrückt, um eine Hyperpigmentierung zu verhindern. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass Plumbagin die -MSH-stimulierte Melaninsynthese in B16F10-Maus-Melanomzellen signifikant unterdrückt. Um den Hemmmechanismus von Plumbagin auf die Melaninsynthese zu verstehen, führten wir zelluläre oder zellfreie Tyrosinase-Aktivitätstests durch und analysierten die mit der Melanogenese verbundene Genexpression. Wir haben gezeigt, dass Plumbagin die Tyrosinaseaktivität direkt unterdrückt, unabhängig von der mit der Melanogenese verbundenen Transkriptionsmaschinerie, zu der der Mikrophthalmie-assoziierte Transkriptionsfaktor (MITF), die Tyrosinase (TYR) und das Tyrosinase-verwandte Protein 1 (TYRP1) gehören. Wir untersuchten auch, ob Plumbagin für normale menschliche Keratinozyten (HaCaT) und Linsenepithelzellen (B3) toxisch ist, die durch die Verwendung von Hautpflegekosmetika geschädigt werden können. Überraschenderweise hemmten niedrigere Plumbagin-Konzentrationen (0,5–1 µM) wirksam die Melaninsynthese und die Tyrosinaseaktivität, verursachten jedoch keine Toxizität in Keratinozyten, Linsenepithelzellen und B16F10-Mäuse-Melanomzellen, was darauf hindeutet, dass Plumbagin für die dermale Anwendung sicher ist. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die hemmende Wirkung von Plumbagin auf die Pigmentierung es zu einem akzeptablen und sicheren Bestandteil für die Verwendung in kosmetischen Hautpflegeformulierungen zur Hautaufhellung machen könnte.

Relevanten Studien zufolge ist Cistanche ein weit verbreitetes Kraut, das als „das Wunderkraut, das das Leben verlängert“ bekannt ist. Sein Hauptbestandteil ist Cistanosid, das verschiedene Wirkungen hat, wie z. B. antioxidative, entzündungshemmende und die Immunfunktion fördernde Wirkung. Der Mechanismus zwischen Cistanche und Hautaufhellung liegt in der antioxidativen Wirkung von Cistanche-Glykosiden. Melanin in der menschlichen Haut entsteht durch die durch Tyrosinase katalysierte Oxidation von Tyrosin. Die Oxidationsreaktion erfordert die Beteiligung von Sauerstoff, sodass die sauerstofffreien Radikale im Körper zu einem wichtigen Faktor werden, der die Melaninproduktion beeinflusst. Cistanche enthält Cistanosid, ein Antioxidans, das die Bildung freier Radikale im Körper reduzieren und so die Melaninproduktion hemmen kann.

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Schlüsselwörter:Klempner; Melanogenese; Pigmentierung; Tyrosinase

1. Einleitung

Melanin besteht aus einer Gruppe von Pigmenten, die in epidermalen Melanozyten synthetisiert werden und eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Schäden durch ultraviolette (UV) Strahlung der Haut spielen [1]. Eine abnormale Melanogenese, entweder erhöhte oder verringerte Melaninproduktion, ist eng mit mehreren Hautkrankheiten verbunden, darunter Melanomen und Pigmentstörungen wie Chloasma und Sommersprossen [2,3]. Die Biosynthese von Melanin wird durch mehrere Reize initiiert, darunter UV-Bestrahlung, entzündliche Zytokine und hormonelle Signale. Insbesondere kann das von UV-exponierten Keratinozyten freigesetzte -Melanozyten-stimulierende Hormon (-MSH) die Melaninbiosynthese in epidermalen Melanozyten stimulieren, indem es die cAMP-PKA-CREB-Achse (zyklisches Adenosinmonophosphat-Proteinkinase A-cAMP-Response-Element-Bindungsprotein) aktiviert [3]. . Die aktivierte cAMP-PKA-CREB-Achse führt zu einem Anstieg der mRNA, die für den Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktor (MITF) kodiert. MITF erhöht die Genexpression von Tyrosinase (TYR), Tyrosinase-verwandtem Protein 2 (TYRP1) und Tyrosinase-verwandtem Protein 2 (TYRP2) bei -MSH-Stimulation in Melanozyten [3,4]. Darüber hinaus sind viele Signalwege, die das Zellwachstum steuern, einschließlich Mitogen-aktivierter Proteinkinasen (MAPKs), extrazellulärer Reaktionskinase (ERK) und AKT, für die Melanogenese von wesentlicher Bedeutung, indem sie die MITF-Stabilität und -Aktivität regulieren [5].

Das Enzym Tyrosinase, eine multifunktionale kupferhaltige Oxidase, spielt eine wesentliche Rolle in der Melaninbiosynthese, indem es die Reaktionen katalysiert, bei denen L-Tyrosin zu L-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) hydroxyliert und L-DOPA zu o-Chinon (Dopaquinon) oxidiert wird ) [5,6]. Daher hemmen einige Tyrosinasehemmer auch die Melaninbiosynthese, darunter Resveratrol, Arbutin und Honokiol, die alle in kosmetischen Anwendungen zur Hautaufhellung eingesetzt werden [7].

Plumbagin ist ein einfaches Hydroxylnaphthochinon, das erstmals aus den Wurzeln der Pflanzengattung Plumbago gewonnen wurde und nachweislich bemerkenswerte medizinische Eigenschaften besitzt [8]. Es wurde über entzündungshemmende, krebshemmende, antiallergische und antibakterielle Wirkungen von Plumbagin berichtet [8,9]. Tatsächlich wurde berichtet, dass Plumbagin die Aktivierung von Neutrophilen, die Angiogenese und die Kollagenase-Expression hemmt, indem es die Topoisomerase II unterdrückt, was auf die Verwendung von Plumbagin als potenzielles Medikament bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis schließen lässt [10]. Darüber hinaus haben mehrere Berichte gezeigt, dass Plumbagin eine krebshemmende Wirkung bei mehreren Krebsarten aufweist, darunter Brustkrebs [11], Prostatakrebs [12], Eierstockkrebs [13], Lungenkrebs [14], Hautkrebs [15] und Leberkrebs [16]. Obwohl immer deutlicher wird, dass Plumbagin als therapeutische Intervention bei der Behandlung verschiedener menschlicher Krankheiten nützlich sein kann, wurde nie über die hemmende Wirkung von Plumbagin auf die Melanogenese im Zusammenhang mit Hyperpigmentierung berichtet.

2. Ergebnisse

2.1. Chemische Struktur und zytotoxische Wirkung von Plumbagin in B16F10-Maus-Melanomzellen

Bevor wir die antimelanogene Wirkung von Plumbagin untersuchten, untersuchten wir zunächst seine Toxizität in Melanin-produzierenden B16F10-Mäuse-Melanomzellen. Die chemische Struktur von Plumbagin ist in Abbildung 1A dargestellt. Die Ergebnisse unseres Zytotoxizitätstests, bei dem Plumbagin-Konzentrationen von weniger als 5 µM keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen in B16F10-Zellen hatten, sind in Abbildung 1B dargestellt.

2.2. Plumbagin unterdrückt die -MSH-induzierte Melaninsynthese in B16F10-Mausmelanomzellen

Als nächstes untersuchten wir die hemmende Wirkung von Plumbagin auf die durch das Melanozyten-stimulierende Hormon (-MSH) induzierte Melaninsynthese in B16F10-Zellen. Wir haben gezeigt, dass Plumbagin die -MSH-induzierte Melaninakkumulation in einem Kulturmedium aus B16F10-Zellen stark unterdrückt (Abbildung 2A). Um die hemmende Wirkung von Plumbagin auf die -MSH-induzierte Melaninsynthese zu bestätigen, haben wir den extrazellulären oder intrazellulären Melaningehalt in Abwesenheit oder Anwesenheit von Plumbagin in -MSH-stimulierten B16F10-Zellen bestimmt. Die Abbildungen 2B und C zeigen, dass Plumbagin den extrazellulären und intrazellulären Melaningehalt deutlich senkt.

2.3. Plumbagin reguliert nicht die -MSH-induzierte Melanogenese-Genexpression und Signaltransduktionskaskaden

Da der Mikrophthalmie-assoziierte Transkriptionsfaktor (MITF) ein wesentlicher Transkriptionsfaktor ist, der die Melanogenese-assoziierte Genexpression über die -MSH-PKA-CREB-Achse reguliert, untersuchten wir, ob Plumbagin die MITF-vermittelte Genexpression im Zusammenhang mit Melanogenese regulieren kann. Zunächst bestimmten wir einen Zeitpunkt der maximalen Melanogenese-Genexpression für MITF, Tyrosinase (TYR) und Tyrosinase-verwandtes Protein 1 (TYRP1) unter -MSH-Stimulation. MITF ist nach 2-stündiger -MSH-Behandlung stark hochreguliert (Abbildung 3A). TYR und TYRP1 waren nach 48 Stunden Behandlung mit -MSH dramatisch hochreguliert (Abbildung 3A). Die MITF- und Tyrosinase-Proteinspiegel stiegen als Reaktion auf die -MSH-Behandlung und wurden durch die Plumbagin-Behandlung nicht unterdrückt (Abbildung 3B). Konsequenterweise hemmte Plumbagin die MITF-, TYR- und TYRP1-mRNA-Spiegel nach -MSH-Stimulation nicht, was darauf hindeutet, dass Plumbagin die Transkriptionsmaschinerie im Zusammenhang mit der Melanogenese-Genexpression in B16F10-Zellen nicht reguliert (Abbildung 3C). Da für die Melanogenese eine Phosphorylierung und Aktivierung von AKT, ERK1/2 und CREB (wichtige Signaltransduktionskaskaden, die die Melanogenese regulieren) erforderlich sind [3], haben wir weiter untersucht, ob Plumbagin diese mit der Melanogenese verbundenen Signaltransduktionswege reguliert. Unsere in Abbildung 3D beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass Plumbagin die AKT-, ERK1/2- oder CREB-Signalübertragung nach der -MSH-Behandlung nicht verändert.

2.4. Plumbagin hemmt die Tyrosinase-Aktivität

Da klar ist, dass direkte oder indirekte Tyrosinase-hemmende Naturstoffe für die Entwicklung hautaufhellender Kosmetika nützlich sein könnten, untersuchten wir als nächstes die hemmende Wirkung von Plumbagin auf die Tyrosinase-Enzymaktivität. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass Plumbagin die -MSH-induzierte zelluläre Tyrosinase-Enzymaktivität in B16F10-Zellen signifikant unterdrückt (Abbildung 4A). Um zu verstehen, ob Plumbagin die Tyrosinase-Aktivität direkt oder indirekt hemmt, wurde die zellfreie Tyrosinase-Aktivität gemessen. Plumbagin hemmt auch stark die L-DOPA-Oxidationsaktivität der aus Pilzen stammenden Tyrosinase, was darauf hindeutet, dass Plumbagin die Melanogenese unterdrückt, indem es die Tyrosinaseaktivität direkt hemmt (Abbildung 4B). Darüber hinaus wurde bei Proben, die mit Vitamin C und Plumbagin in Konzentrationen von 0.1 behandelt wurden, ein deutlicher Anstieg der Radikalfängeraktivitäten mithilfe eines 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)-Assays beobachtet bis 5 mg/ml. Folglich zeigten 5 mg/ml Plumbagin eine ähnliche Wirkung auf die Radikalfängeraktivität wie 0,1 mg/ml Vitamin C (Abbildung 4C).

2.5. Plumbagin ist in normalen Keratinozyten und Linsenepithelzellen nicht toxisch

Da Kosmetika wie Hautcremes zur äußerlichen Anwendung bestimmt sind und Zytotoxizität Hautprobleme verursachen kann, haben wir weiter untersucht, ob Plumbagin für normale Keratinozyten (HaCaT) und Linsenepithelzellen (B3) toxisch ist und ob es für die Entwicklung einer Hautaufhellung nützlich sein könnte Kosmetika. Folglich fanden wir heraus, dass niedrigere Plumbagin-Konzentrationen (1–5 µM) keine Toxizität in HaCaT- und B3-Zellen verursachen, aber bei der Hemmung der Melaninsynthese wirksam sind (Abbildung 5A). Darüber hinaus induzierte Plumbagin kein mit DNA-Schäden verbundenes H2AX und reduzierte die zelluläre Apoptose-bedingte Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP) und Caspase-3-Proteine ​​in HaCaT- und B3-Zellen (Abbildung 5B), was darauf hindeutet, dass Plumbagin dies tun könnte für die Verwendung in Hautaufhellungsprodukten akzeptabel sein, ohne dass sie eine Hauttoxizität aufweisen

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