Podozytenverletzung durch Wechselwirkung zwischen Tlr8 und seinem endogenen Liganden MiR-21 in einer obstruierten und seiner kollateralen Niere

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cistanche erektile Dysfunktion im Zusammenhang mit der Niere

Während chronische Nierenerkrankungen bei Erwachsenen weit verbreitet sind, wurde über obstruktive Nephropathie (ON) sowohl bei jungen als auch bei alten Patienten berichtet. Bei ON wurden tubulointerstitielle Läsionen (TILs) umfassend untersucht, aber glomeruläre Läsionen (GLs) wurden weitgehend vernachlässigt. Hier zeigen wir einen neuartigen Mechanismus, der der GL-Entwicklung bei ON bei jungen und alten Mäusen zugrunde liegt. TILs entwickeln sich aufgrund der Infiltration von Entzündungszellen in das Tubulointerstitium früher als GLs, aber GLs entwickeln sich nach der Aktivierung des Toll-like-Rezeptors 8 (Tlr8), obwohl keine Entzündungszellen den Glomerulus infiltrieren. TLR8- und Interleukin-1-beta (IL1b)-Proteine ​​kolokalisieren mit reduzierenden Podozytenfunktionsmarkern (PFMs), was auf die Aktivierung der TLR8-Signalübertragung in verletzten Podozyten hinweist. Darüber hinaus waren die glomerulären und Serumspiegel von miR-21, einem endogenen Liganden für Tlr8, im ON-Mausmodell höher als in der Scheinkontrolle. Die glomeruläre Expression von Tlr8 korreliert positiv mit miR-21 und den nachgeschalteten Zytokinen Il1b und Il6 und negativ mit PFMs (Nphs1 und Synpo). Wir zeigen auch die Kolokalisation von TLR8- und IL1b-Proteinen mit reduzierenden PFMs sowohl in obstruktiven als auch inSicherheitNierenvon jungen und alten Mäusen. Darüber hinaus zeigten In-vitro-Studienergebnisse eine höhere Expression von Tlr8 und seinen nachgeschalteten Zytokinen in den Glomeruli von obstruiertenNierennach der Behandlung mit miR- 21-Mimic als bei der Kontrolle. Zusammenfassend kann die Überexpression von Tlr8 als plausibler Mechanismus dienen, der der GL-Entwicklung bei ON durch Podozytenverletzung zugrunde liegt.

Schlüsselwörter: chronische Nierenerkrankung,obstruktive Nephropathie, Podozyten, TLR8, verstopfte und kollaterale Niere

EINLEITUNG

Chronische Nierenerkrankung (CKD), ein großes Problem der öffentlichen Gesundheit, ist bei 8 bis 13 Prozent der Allgemeinbevölkerung weit verbreitet (1). Aufgrund der alternden Gesellschaft ist sie bei älteren Menschen häufig. Die obstruktive Nephropathie (ON) ist für Kliniker von großem Interesse, da sie bei Patienten unterschiedlicher Altersgruppen berichtet wurde. ON ist im Gegensatz zu anderen CNI (2, 3) behandelbar und reversibel. Bei Kindern tritt sie bei einem von 15 00 jungen Menschen auf, und ihre Prävalenz beträgt in Industrieländern 1 bis 5 % (4, 5). Bei Erwachsenen liegt die Prävalenz von ON zwischen 5 von 1000 und 5 von 10000 Personen. Zudem beträgt die Prävalenz der chronischen unilateralen ON etwa 0,5 Prozent, die der akuten unilateralen und chronischen bilateralen ON etwa 0,1 Prozent (4–7).

ON kann zu einer akuten Nierenschädigung oder CKD führen, die eine fortschreitende Abnahme der Nierenfunktion und Veränderungen der Nierenstrukturen beinhaltet, die länger als 3 Monate andauern (8, 9). Die einseitige Ureterobstruktion (UUO) ist eine weit verbreitete Strategie zur Untersuchung der chronischen ON. ON in einer UUO-Niere ist gekennzeichnet durch Hypertrophie, Hydronephrose, Rekrutierung von Entzündungszellen im interstitiellen Bereich, tubulären Zelltod durch Hypoxie und Kollagenablagerung im Tubulointerstitium, gefolgt von der Entwicklung einer tubulointerstitiellen Fifibrose (TF) (10).

TF ist ein wichtiges Merkmal einer Nierenerkrankung im Endstadium und eine Hauptdeterminante einer fortschreitenden Nierenschädigung (11). TF wurde in ON-Modellen ausführlich untersucht, aber Daten zu glomerulären Verletzungen, insbesondere Anomalien der Blut-Harn-Schranke (BUB), sind rar (8, 9, 12). Darüber hinaus haben Studien tubulointerstitielle Läsionen (TILs) in der Kollateralniere bei einseitiger ON untersucht, aber glomeruläre Läsionen (GLs) wurden weitgehend vernachlässigt (12). Mehrere Berichte haben die Beteiligung peritubulärer Kapillaren an der Progression von TILs bei experimenteller ON offenbart (13, 14). Der Glomerulus und die glomeruläre Kapillare münden jedoch in die röhrenförmigen Segmente der Nephron- bzw. peritubulären Kapillaren. Daher vermuten wir, dass Glomerulonephritis auch das Tubulointerstitium betreffen kann. Unsere früheren Studien haben den Beitrag einer Verletzung glomerulärer intrinsischer Zellen, hauptsächlich Podozyten, zu GL und der anschließenden TIL-Entwicklung in einem Mausmodell für Autoimmunerkrankungen aufgrund der Überexpression verschiedener Toll-like-Rezeptoren (TLRs) hervorgehoben (15–18).

Glomeruläres Kapillarendothel und Podozyten sind wichtige Torwächter, die BUBs umfassen. Zwischen diesen beiden Epithelien sind Podozyten aufgrund ihrer einzigartigen Lokalisierung in den Glomeruli ständig Gefahrensignalen ausgesetzt, einschließlich TLR-Liganden wie Gefahren-assoziierte molekulare Muster (DAMPs) oder Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs). Daher wird angenommen, dass die Wechselwirkung zwischen TLRs in Podozyten und ihren endogenen Liganden zur Podozytenverletzung unter nicht infektiösen Bedingungen beiträgt. In der vorliegenden Studie konzentrierten wir uns auf die GL-Entwicklung sowohl in den obstruierten als auch in den Kollateralnieren von jungen und alten Mäusen, da ON sowohl bei jungen als auch bei älteren Menschen häufig vorkommt. Wir stellten klar, dass GL bei ON aufgrund einer Podozytenverletzung durch die Überexpression von Tlr8 in Podozyten sowohl aus obstruierten als auch aus Kollateralnieren von jungen und alten Mäusen entwickelt wurde.

MATERIALEN UND METHODEN

Ethische Erklärung und experimentelle Tierhaltung Alle Experimente mit Labortieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Hokkaido genehmigt (Genehmigungs-Nr. 16- 0124). Die Autoren folgten dem genehmigten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Universität Hokkaido, Fakultät für Veterinärmedizin (genehmigt von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International). Sechs Wochen alte C57BL/6N-Mäuse wurden von Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Japan) erworben und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in einer 1:1-Hell-Dunkel-Umgebung gehalten. Den Versuchstieren wurde Futter und Trinkwasser ad libitum zur Verfügung gestellt.

Experimentelles Design Wir verwendeten sowohl junge (9 Wochen) als auch alte (12 Monate) Mäuse. Mäuse aus jeder Altersgruppe (n=4) wurden entweder einer Scheinoperation (Kontrollgruppe) oder einer UUO (2, 7, 11 und 21 Tage) unterzogen, um eine ON-Modellniere zu etablieren, wie in unserer vorherigen Studie beschrieben (13).

Probenvorbereitung Mäuse wurden mit einer Mischung von Anästhetika, wie zuvor beschrieben (16), tief anästhesiert und durch zervikale Dislokation eingeschläfert. Blutproben wurden durch die Femoralarterie für die Serummarkeranalyse gesammelt. Sowohl UUO- als auch Kollateralnieren wurden gesammelt und in dünne Scheiben geschnitten. Nierenschnitte wurden mit 10 % Neutralpuffer-Formalin (NBF), 4 % Paraformaldehyd (PFA) und 2,5 % Glutaraldehyd (GTA) für histopathologische, immunhistochemische bzw. elektronenmikroskopische Untersuchungen fixiert.

Immunhistochemie und Immunfluoreszenz NBF-fixierte Paraffinblöcke wurden auf 2 mm Dicke geschnitten und mit Perjodsäure-Schiff-Hämatoxylin (PAS-H) gefärbt, um die Nierenhistopathologie zu untersuchen. Der Immunnachweis zellulärer Marker wurde wie zuvor berichtet (16) für B-Zellen (B220), T-Zellen (CD3), Kapillarendothel (CD31), IL1b, Makrophagen (Iba1), Podozyten (Podocin und Synaptopodin) und TLR8 durchgeführt. Die Färbebedingungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Histoplanimetrie PAS-H und immungefärbte Nierenschnitte wurden unter Verwendung von Nano Zoomer 2.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Japan) in virtuelle Objektträger umgewandelt. Positive Zellen wurden aus zufällig ausgewählten 20 Glomeruli oder 20 Herden aus dem Tubulointerstitium bei 400-facher Vergrößerung unter Verwendung der NDP.view2-Software (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) gezählt. Bilder von 20 Glomeruli aus PAS-H-gefärbten Schnitten wurden auch bei 400-facher Vergrößerung von jeder Maus unter Verwendung eines All-in-One-Fluoreszenzmikroskops BZ-X710 (Keyence, Osaka, Japan) aufgenommen. Die Fläche und Größe des glomerulären Mesangiums wurde anhand aufgenommener Bilder unter Verwendung eines BZ-X-Analysators (Keyence) gemessen.

Isolierung von Glomeruli zur RNA-Extraktion und Kultur Glomeruli aus scheinoperierten und UUO-Nieren wurden wie zuvor beschrieben isoliert (16). Kurz gesagt, Mäuse wurden tief anästhesiert und durch den linken Ventrikel mit 40 ml Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS), die Dynabeads (8 × 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) enthielt, perfundiert. Die Niere wurde entfernt

und in kleine Stücke gehackt. Die Zellen wurden dann mit Kollagenase A (1 mg/ml; Roche, Basel, Schweiz) und Desoxyribonuclease I (100 U/ml; Life Technologies) in HBSS bei 37 Grad für 30 min verdaut. Die Suspension, die verdautes Gewebe enthielt, wurde unter Verwendung eines abgeflachten Stößels vorsichtig durch ein 100--mm-Zellsieb (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) gepresst. Die resultierende Zellsuspension wurde bei 200 × g für 5 min zentrifugiert und das Zellpellet wurde in 2 ml HBSS resuspendiert. Glomeruli, die Dynabeads enthielten, wurden unter Verwendung eines Magnetpartikelkonzentrators (Life Technologies) gesammelt und für die RNA-Isolierung verwendet.

Reverse Transkription und Echtzeit-PCRGesamt-RNA wurde aus Glomeruli unter Verwendung eines RNeasy-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. cDNA wurde aus Gesamt-RNA durch reverse Transkription unter Verwendung des Reverse-Transkriptase-Enzyms ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japan) und zufälliger dT-Primer (Promega) synthetisiert. Die cDNA wurde in Echtzeit-PCR mit Brilliant III SYBR Green QPCR-Mastermix und Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA) verwendet. Die glomeruläre Genexpression wurde auf die Expression von Actb normalisiert. Die verwendeten Primerpaare sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Reverse Transkription und TaqMan-basierte Echtzeit-PCRGesamt-RNA, einschließlich microRNA (miRNA) in den isolierten Glomeruli, wurde unter Verwendung eines miRNeasy-Kits (Qiagen) isoliert. MiRNA-spezifische Stem-Loop-RT-Primer, reverse Transkriptase, Reverse-Transkriptionspuffer, dNTPs und RNase-Inhibitor wurden verwendet, um die Gesamt-RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) revers zu transkribieren. Real-time PCR wurde mit der resultierenden cDNA unter Verwendung von miR-21--spezifischen TaqMan-Primern und spezifischen Sonden (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) und Mx3000P (Agilent Technologies) durchgeführt.

In-vitro-Behandlung von isolierten Glomeruli mit MimicsGlomeruli wurden aus scheinoperierten und UUO isoliertNierennach 11 Tagen Behinderung. Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640)-Medium (Fujifilm Wako, Japan), das 300 Glomeruli enthielt, wurde in jede Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte (TPP, Trasadingen, Schweiz) verteilt und behandelt mit PBS, Negativkontrolle und miR-21-Mimetikum (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Südkorea) mit 1 pmol/µl für 4 h bei 37 Grad in 5 % CO2. Die Expression von Tlr8 und seinen nachgeschalteten Zytokinen wurde wie im vorherigen Abschnitt beschrieben gemessen.

RasterelektronenmikroskopieFür Routine-Rasterelektronenmikroskopie (REM), kleinNiere Scheibenwurden mit 2,5 % GTA für 4 h fixiert und mit 1 % Osmiumtetroxid für 1 h nachfixiert, gefolgt von einer Behandlung mit 1 % Gerbsäure für 1 h. Die Proben wurden dann mit 1 % Osmiumtetroxid für 1 h fixiert und mit 0,5 % und 1 % Gerbsäure für 10 min bzw. 1 h behandelt.NiereScheibenwurden mit aufsteigenden Alkoholgraden dehydriert, in 3-Methylbutylacetat überführt und schließlich mit einem HCP-2-Critical-Point-Trockner (Hitachi, Tokyo, Japan) getrocknet. Die Proben wurden einem Ionenzerstäuben unterzogen und dann unter einem S-4100-Rasterelektronenmikroskop bei einer beschleunigten Spannung von 12 kV untersucht.

Statistische AnalyseDie Werte werden als Mittelwert ± Standardfehler (se) ausgedrückt. Die Ergebnisse wurden mit einem nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test (P < 0.05)="" statistisch="" analysiert.="" der="" kruskal-wallis-test="" wurde="" verwendet,="" um="" drei="" oder="" mehr="" populationen="" zu="" vergleichen,="" und="" mehrere="" vergleiche="" wurden="" unter="" verwendung="" der="" scheffe-methode="" durchgeführt,="" sobald="" signifikante="" unterschiede="" beobachtet="" wurden="" (p="">< 0,05).="" die="" korrelation="" zwischen="" den="" beiden="" parametern="" wurde="" mit="" dem="" rangkorrelationskoeffiziententest="" nach="" spearman="" analysiert="" (p=""><>

ERGEBNISSE

TILs und GLs in den verstopften Nieren junger MäuseWir untersuchten zunächst TILs und GLs in scheinoperierten und UUO-Nieren von jungen Mäusen, die für unterschiedliche Zeiträume einer Obstruktion ausgesetzt waren. Während die scheinoperierten Nieren ein normales Tubulointerstitium zeigten (Abbildung 1A), zeigten die verstopften Nieren nach 2 Tagen UUO TILs und waren durch die Dilatation der Tubuli gekennzeichnet; Einige Tubuli enthielten auch Harnabgüsse. Solche Läsionen nahmen mit dem Fortschreiten der Obstruktion zu (Abbildung 1A). GLs, hauptsächlich Glomerulosklerose, wurden im späten Stadium 21 Tage nach der UUO beobachtet und waren durch die Ablagerung von Periodsäure-Schiff (PAS)-positiven Materialien gekennzeichnet. Die glomeruläre Struktur war sowohl bei Schein- als auch frühen UUO-Nieren (2, 7 und 11 Tage) normal (Abbildung 1B). Die Anzahl der glomerulären Zellen nahm tendenziell bis zum Tag -11 nach der Obstruktion zu und neigte dazu, am Tag -21 in den UUO-Nieren abzunehmen (Abbildung 1C). Die glomeruläre mesangiale Akkumulation nahm tendenziell ab 7 Tagen nach der Obstruktion zu (Abbildung 1D).

fehlte im Zentrum der Glomeruli der UUO-Nieren 21 Tage nach der Obstruktion (Fig. 1F). Die Polymerase-Kettenreaktion zeigte eine signifikante Abnahme der PFMs (Nphs1 und Synpo) in UUO-Nieren 21 Tage nach der Obstruktion (Abbildung 1G). Darüber hinaus zeigte die SEM-Analyse normale Podozyten-Fußfortsätze (PFPs) in scheinoperierten Nieren; 21 Tage nach der Obstruktion wurden jedoch PFP-Auslöschung und mikrovilliartige Strukturen in UUO-Nieren gemeldet (Abbildung 1H). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse das Auftreten einer Podozytenverletzung in der verstopften Niere 21 Tage nach der Verstopfung nahe.

Infiltrierende Immunzellen fehlen in der verstopften Niere Wir haben zuvor gezeigt, dass eine Podozytenschädigung mit infiltrierenden Immunzellen im Glomerulus korreliert (13, 16, 18). Daher untersuchten wir die Infifiltration von B- und T-Zellen sowie Makrophagen in TILs und GLs von scheinoperierten und UUO-Nieren (Abbildung 2). Zahlreiche infiltrierende B-, T-Zellen und Makrophagen wurden in den TILs von UUO-Nieren an allen Tagen nach der Obstruktion beobachtet, aber sie waren in den Glomeruli sowohl von Schein- als auch von UUO-Nieren fast nicht oder nur in wenigen vorhanden (Abbildungen 2A–E). Die Zahl der B-, T-Zellen und Makrophagen war im Glomerulus sehr gering (Daten nicht gezeigt), aber signifikant höher im Glomerulus

Tubulointerstitium von 2--, 7--, 11-- und 21--Tagesnieren im Vergleich zu dem der Scheinniere (Abbildung 2F). Daher können infiltrierende Immunzellen zur Entwicklung von TILs in der obstruierten Niere beitragen. Es können jedoch auch andere Faktoren mit der GL-Entwicklung zusammenhängen.

Expression verschiedener Mitglieder der TLR-Familie und nachgeschalteter Zytokine in scheinoperierten und verstopften Nieren junger Mäuse Frühere Studien haben eine höhere Expression verschiedener TLRs in Podozyten erkrankter Nieren gezeigt (15, 16, 19, 20). Interessanterweise zeigten unsere Daten eine signifikant höhere Expression von Tlr8 und Tlr9 in den aus der UUO 21--Tagesgruppe isolierten Glomeruli als in den Glomeruli der Scheingruppe (Abbildung 3A). Darüber hinaus untersuchten wir die Expression nachgeschalteter Zytokine der TLR-Familienmitglieder in den Glomeruli von Schein- und UUO-21--Tagesgruppen und fanden eine signifikante Hochregulation in der Expression der Gene, die sowohl Interleukin 1 beta (Il1b) als auch Interleukin 6 kodieren (Il6) in der UUO-Gruppe im Vergleich zu der in der Scheingruppe (Abbildung 3B).

TLR8 gemeinsam mit PFM lokalisiert Da die Expression von Tlr8 und Tlr9 in den aus der verstopften Niere isolierten Glomeruli hoch war, untersuchten wir ihre Lokalisierung durch Immunfluoreszenzfärbung. Das TLR8-Protein wurde in scheinoperierten Nieren nicht nachgewiesen (Abbildung 4A), war jedoch mit dem PFM-Synaptopodin in der UUO-Niere kolokalisiert (Abbildung 4B). Darüber hinaus gelang es uns nicht, die TLR9-Proteinexpression in der Niere von scheinoperierten oder UUO-Mäusen nachzuweisen (Daten nicht gezeigt).

IL1b-Produktion aus Podozyten in der verstopften Niere junger Mäuse Wie in Abbildung 3B gezeigt, war die Expression von glomerulärem Il1b (einem nachgeschalteten Zytokin der TLR-Familie) in der UUO-Niere nach 21 Tagen signifikant höher als in der Scheiniere. Daher untersuchten wir die Quelle von IL1b in den Glomeruli von UUO-Nieren durch Immunfluoreszenzfärbung. Die IL1b-Proteinexpression wurde in den Glomeruli von Scheinnieren nicht nachgewiesen, wurde aber in den Glomeruli von UUO-Nieren beobachtet ( 4C , D). Darüber hinaus kolokalisierte IL1b mit PFM-Podocin (Abbildung 4D).

im UONierebei 21 Tagen als die in der ScheinNiere.Daher untersuchten wir die Quelle von IL1b in den Glomeruli von UUO-Nieren durch Immunfluoreszenzfärbung. Die IL1b-Proteinexpression wurde in den Glomeruli der Scheinprobe nicht nachgewiesenNierenwurde aber in den Glomeruli von UUO beobachtetNieren(Abbildungen 4C, D). Darüber hinaus kolokalisierte IL1b mit PFM-Podocin (Abbildung 4D).

Erhöhter Spiegel des mutmaßlichen endogenen Tlr8-Liganden in ON-Modellmäusen Eine frühere Studie zeigte, dass miR-21 als Ligand für TLR8 dient (21). Daher verglichen wir sowohl die glomerulären als auch die Serumspiegel von miR-21 zwischen den Schein- und UUO-21--Tagesgruppen. Interessanterweise zeigte die UUO-21--Tagesgruppe signifikant höhere Werte von glomerulärem miR-21 als in der Schein-Gruppe (P < 0,05),="" jedoch="" eine="" zunehmende="" tendenz="" von="" serum-mir{="" {10}}="" wurde="" in="" der="" ersteren="" gruppe="" beobachtet="" als="" in="" der="" letzteren="" (p="0.06)" (abbildung="">

Korrelation der Tlr8-Expression mit seinem Liganden miR-21 und PFMs im ObstructedNiereWie in Tabelle 3 gezeigt, beobachteten wir eine signifikante positive Korrelation zwischen der glomerulären Expression von Tlr8-mRNA und ihrem endogenen Liganden (miR-21) sowie den nachgeschalteten Zytokinen Il1b und Il6. Andererseits zeigte sich eine negative Korrelation zwischen Tlr8-mRNA und den PFMs Nphs1 und Synpo.

In-vitro-Stimulation von Glomeruli mit miR{0}}-Mimic aktiviert die Expression von Tlr8 und seinen nachgeschalteten Zytokinen Die Expression von Tlr8 war tendenziell erhöht (P=0.06), aber seine nachgeschalteten Zytokine (Ifng und Il1b) waren signifikant (P < 0,05 und 0,01) in den Glomeruli der folgenden Scheinmäuse erhöht

Behandlung mit miR-21-Mimetikum im Vergleich zu den Glomeruli von Mäusen, die mit PBS behandelt wurden, und Negativkontroll-Mimetikum (Fig. 5A). Es wurde jedoch keine signifikante Korrelation zwischen der Expression von Tlr8 und seinen stromabwärts liegenden Zytokinen in den Glomeruli von Scheinmäusen nach der Behandlung mit Nachahmern beobachtet (Tabelle 4). Die Expression von Tlr8 und seinen nachgeschalteten Zytokinen war in den Glomeruli von UUO signifikant höherNieren, nach der Behandlung mit miR-21-Mimetikum als die in den Glomeruli von UUONierenbehandelt mit PBS und Negativkontrollimitat (Abbildung 5B). Eine signifikante Korrelation wurde zwischen der Expression von Tlr8 und seinen nachgeschalteten Zytokinen in den Glomeruli von UUO-Nieren nach der Behandlung mit Mimetika festgestellt, was auf die höhere Aktivierung des Tlr8--vermittelten Nuklearfaktor-kappa-B (NF-kB)-Signalwegs hinweist Sekretion proinflammatorischer Zytokine in der verstopften Niere (Tabelle 4).

TLR8-Lokalisierung und Podozytenverletzung in den Seitennieren junger MäuseDie scheinoperierten Nieren zeigten einen normalen Glomerulus, wohingegen die Kollateralnieren eine glomeruläre Hypertrophie, eine erhöhte glomeruläre Zellzahl und eine Dilatation der glomerulären Kapillaren aufwiesen ( 6A ). Die Glomeruli von scheinoperierten Nieren waren positiv für die Synaptopodin-Expression und es fehlte die TLR8-Expression (Abbildung 6B). Andererseits verloren die kollateralen Nieren die Synaptopodin-Expression im Zentrum der Glomeruli, zeigten jedoch eine TLR8-Expression entlang der glomerulären Rate ( 6C ). Darüber hinaus wurde das TLR8-Protein zusammen mit Synaptopodin lokalisiert (Abbildung 6C). Scheinoperierte Nieren zeigten eine normale Expression von Podocin, aber keine Expression von IL1b in den Glomeruli ( 6D ). Die Glomeruli innerhalb der kollateralen Niere verloren jedoch die Podocin-Expression im Zentrum, hatten aber eine IL1b-Expression entlang der glomerulären Rate ( 6E ). Darüber hinaus wurde das IL1b-Protein mit Podocin kolokalisiert (Abbildung 6E). Die SEM-Analyse zeigte normale PFPs in scheinoperierten Mäusenieren, aber PFP-Auslöschung und mikrovillusähnliche Strukturen waren in den Kollateralnieren sichtbar (Abbildung 6F).

TLR8-Lokalisierung und Podozytenverletzung in den verstopften und kollateralen Nieren alter MäuseScheinoperierte Nieren zeigten eine normale Expression von Synaptopodin, zeigten jedoch keine Färbung für das TLR8-Protein innerhalb ihrer Glomeruli ( 7A ). Interessanterweise zeigten sowohl Kollateral- als auch UUO-Nieren einen Verlust der Synaptopodin-Expression im Zentrum der Glomeruli, behielten aber die TLR8-Expression entlang der glomerulären Netzhaut bei (Abbildungen 7B, C). Das TLR8-Protein wurde mit Synaptopodin in den Kollateral- und UUO-Nieren kolokalisiert (Abbildungen 7B, C). Scheinoperierte Nieren zeigten in ähnlicher Weise eine normale Podocin-Expression, hatten aber keine IL1b-Expression in ihren Glomeruli ( 7D ). Andererseits verloren sowohl die Kollateral- als auch die UUO-Nieren die Podocin-Expression im Zentrum der Glomeruli, zeigten jedoch eine IL1b-Expression entlang der glomerulären Netzhaut ( 7E , F). Es wurde festgestellt, dass eine positive Färbung mit Podocin in den Glomeruli der Kollateral- und UUO-Nieren kolokalisiert war ( 7E , F). Die SEM-Untersuchung ergab normale PFPs in scheinoperierten Mausnieren, PFP-Auslöschung und Mikrovillus-ähnliche Strukturen sowohl in den Kollateral- als auch in den UUO-Nieren alter Mäuse (Abbildung 7G).

DISKUSSIONAN

Prävalenz ist sowohl bei Säuglingen als auch bei älteren Menschen üblich (4–7). Daher haben wir junge und alte Mäuse UUO ausgesetzt, um den ON-Zustand von Individuen verschiedener Altersgruppen nachzuahmen, und TILs und GLs untersucht. Bei der obstruierten Niere war das Fortschreiten der TILs in einem früheren Stadium der Obstruktion (2 Tage) offensichtlich; jedoch wurde das Fortschreiten von GLs zusammen mit Podozytenverletzungen in einem späteren Stadium beobachtet. Die Kollateralniere zeigte gleichzeitig GLs und Podozytenschädigung. Diese Beobachtung weist darauf hin, dass eine Podozytenverletzung sowohl in der verstopften als auch in der kollateralen Niere auftritt, obwohl die anfängliche Schädigung variieren kann. Unsere früheren Studien haben die Korrelation zwischen Podozytenverletzung und Infiltration von Immunzellen in den Glomerulus hervorgehoben (13, 16, 18). In der vorliegenden Studie wurde jedoch keine Infiltration von Immunzellen in die Glomeruli von Scheinnieren oder verstopften Nieren beobachtet. Daher betrachteten wir die Beteiligung anderer Faktoren an der Podozytenverletzung in der verstopften Niere. Wir stellten die Hypothese auf, dass Gefahrensignale (DAMPs oder PAMPs), die entweder aus dem Kreislauf stammen oder aus beschädigtem Tubulusepithel stammen, aufgrund ihrer einzigartigen Lage im Glomerulus zur Podozytenverletzung bei ON beitragen können. Wichtig ist, dass gezeigt wurde, dass die Wechselwirkung zwischen DAMPs und TLRs eine wichtige Rolle bei der Pathogenese nichtinfektiöser Krankheiten spielt (15). Verschiedene Mitglieder der TLR-Familie werden auf der Zellplasmamembran oder intrazellulären Vesikeln (22) exprimiert und sind als angeborene Immunsensoren charakterisiert, die DAMPs oder PAMPs effizient erkennen. Nach Aktivierung durch entsprechende DAMPs oder PAMPs verstärkten TLRs die Expression nachgeschalteter Zytokine über den NF-kB-Weg und induzierten das Abwehrsystem des Wirts (22). Darüber hinaus leiten DAMPs das Vorhandensein einer Gewebeverletzung an Immunzellen oder lokale intrinsische Zellen weiter und verschlimmern folglich die Gewebeschädigung (23–26). Wichtig ist, dass alle TLRs den NF-kB-Weg aktivieren, der die Expression einer Reihe von entzündlichen Zytokin-Genen steuert (27). Darüber hinaus signalisiert die Aktivierung von TLRs ihren nachgeschalteten Signalwegen, NF-kB zu aktivieren, das für Entzündungen verantwortlich und mit der Pathogenese geschädigter Gewebe verbunden ist (28). Shichita et al. offenbarten die pathologischen Wechselwirkungen zwischen endogenen Liganden und TLR2 oder TLR4, die zu ischämischen Hirnverletzungen beitragen (25). Frühere Studien haben auch die Fähigkeit der Mitglieder der TLR-Familie gezeigt, TILs in der Niere (TLR2, 4, 5, 7 und 11) und GLs (TLR1–6, 8 und 9) zu induzieren (17, 29–33 ). In der vorliegenden Studie fanden wir eine Podozytenverletzung in verstopften und kollateralen Nieren und klärten dies auf

Rollen verschiedener Mitglieder der TLR-Familie, die zur Podozytenverletzung beitragen können (15, 16, 19, 20). Wie wir vermuteten, war die glomeruläre Expression von Tlr8 und Tlr9 in den aus der UUO-Niere isolierten Glomeruli höher als in denen von scheinoperierten Mäusen. Darüber hinaus war die glomeruläre Expression entzündlicher Zytokine, die mit dem NF-kB-Weg zusammenhängen, einschließlich Il1b und Il6, in der UUO-Niere 21 Tage nach der Obstruktion höher. Daher schlussfolgerten wir, dass der TLR-vermittelte NF-kB-Weg eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von GL in der obstruktiven Niere spielt. Im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der TLR-Familie werden TLR8 und TLR9 in den Endosomen von Zellen nachgewiesen. TLR8 erkennt einzelsträngige RNAs und kurze doppelsträngige RNAs aus Mikroorganismen und aktiviert die Produktion mehrerer NF-kB-vermittelter Zytokine (22). Andererseits erkennt TLR9 doppelsträngige DNAs und aktiviert den NF-kB-Weg, um nachgeschaltete Zytokine zu produzieren (16, 34). In dieser Studie erkannten wir nur die Kolokalisation des TLR8-Proteins zusammen mit dem PFM-Synaptopodin in den Glomeruli. Unsere früheren Studien haben auch gezeigt, dass sowohl TLR8 als auch TLR9 mit PFMs kolokalisieren und die NF-kB-vermittelte entzündliche Zytokinproduktion aktivieren, um eine Podozytenverletzung zu induzieren (15, 16). Darüber hinaus haben andere Studien die pathologische Korrelation zwischen TLR-vermittelten Signalwegen und Podozytenverletzung in vitro gezeigt (34, 35). Banas et al. zeigten die Interaktion von TLR4 in Podozyten mit dem Immunsystem während der GL-Entwicklung (35). Somit können Podozyten über TLR-vermittelte Wege zur Immunüberwachung beitragen. In dieser Studie zeigten wir sowohl die TLR8-Genexpression und Proteinlokalisierung in den Podozyten der verstopften Niere als auch die höhere Expression der nachgeschalteten Zytokine im Glomerulus. Daher schlussfolgern wir, dass TLR8--vermittelte Wege zur GL-Entwicklung durch Podozytenverletzung in der verstopften Niere beitragen.

Eine frühere Studie zeigte, dass miR-21, ein endogener Ligand von TLR8, TLR8 in zellulären Endosomen erreichen und daran binden kann, wobei es die TLR8--vermittelte Aktivierung des NFkB-Signalwegs und die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen induzieren kann (21). In der vorliegenden Studie fanden wir signifikant höhere Spiegel von glomerulärem miR-21 sowie erhöhte Spiegel von Serum-miR-21 in der UUO-Niere als in Scheinkontrollen und zeigten seine Korrelation mit der glomerulären Expression von Tlr8 . Interessanterweise zeigten die Glomeruli von UUO-Nieren, die mit miR-21-Mimetikum behandelt wurden, eine höhere Expression von Tlr8 und seinen nachgeschalteten Zytokinen im Vergleich zu denen in den Glomeruli von Scheinmäusen, die mit miR-21-Mimetikum behandelt wurden, was auf eine erhöhte Verfügbarkeit von endogenem miR hinweist -21 aus geschädigtem Gewebe in der verstopften Niere und die Aktivierung der Überexpression von Tlr8 in UUO-Nieren sind mit der einer Scheininjektion vergleichbar. Zusammen schlussfolgern wir, dass ein größeres Volumen von miR-21 in der verstopften Niere die Endosomen in Podozyten erreicht und eine Tlr8--vermittelte Aktivierung des NF-kB-Signalwegs und die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen induziert. Diese Zytokine sind wiederum an der GL-Entwicklung durch Podozytenverletzung beteiligt.

IL1b ist eines der wichtigen nachgeschalteten Zytokine des NF-kB-Signalwegs, das hauptsächlich von Podozyten im Glomerulus unter Krankheitsbedingungen produziert wird. Frühere Studien haben gezeigt, dass IL1b eine Podozytenschädigung induziert, indem es PFMs reduziert (36, 37). In der vorliegenden Studie zeigten wir eine höhere glomeruläre Expression von Il1b und seine Kolokalisation mit PFMs, die eine reduzierte Expression zeigten. Darüber hinaus korrelierte die glomeruläre Expression von Il1b mit Tlr8 und neigte dazu, mit der Expression von PFMs (Nphs1 und Synpo) zu korrelieren. Daher weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Faktoren stromabwärts von Tlr8, einschließlich Il1b und Il6, eine Podozytenschädigung in der verstopften Niere verursachen können, indem sie die PFM-Expression verringern.

Die Kollateralnieren junger Mäuse zeigten ebenfalls GLs und den Verlust von PFMs. Dieses Ergebnis wurde durch SEM bestätigt, das Podozytenverletzungen in der kollateralen Niere zeigte. Wir fanden auch höhere Spiegel von Serum-miR-21 im ON-Mausmodell. Darüber hinaus kolokalisiertes IL1b-Protein mit PFM. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Serum-miR-21 mit TLR8 in den Podozyten der Kollateralniere interagiert und die Produktion nachgeschalteter Zytokine aktiviert, was wiederum die Podozytenfunktion und die Podozytenschädigung reduziert. Podozytenschädigung wurde auch in den verstopften und kollateralen Nieren alter Mäuse über einen Mechanismus beobachtet, der dem ähnlich war, der bei jungen Mäusen beobachtet wurde.

Zusammenfassend (Abbildung 8) ist die glomeruläre miR-21-Expression nach einseitiger Harnleiterobstruktion erhöht, wobei sie mit TLR8 in Podozyten interagiert und die Produktion nachgeschalteter Zytokine (Il1b und Il6) induziert, was auf eine Aktivierung des NF-kB-Signalwegs hindeutet. Höhere Zytokinspiegel reduzieren PFMs, was zu Podozytenverletzungen und der anschließenden Entwicklung von GLs führt. Erhöhte Spiegel von Serum-miR-21 aktivieren TLR8 in den Podozyten der Kollateralniere und induzieren GLs durch Podozytenverletzung. Daher zeigt diese Studie deutlich die GL-Entwicklung in verstopften und kollateralen Nieren durch Podozytenverletzung nach Tlr8-Überexpression.