Poly- und Oligosaccharid Ulva Sp. Fraktionen aus der enzymunterstützten Extraktion modulieren den Metabolismus der extrazellulären Matrix

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Abstrakt:Ulva sp. ist als Quelle für bioaktive Verbindungen wie Vans bekannt, aber über ihre biologische Aktivität auf die extrazelluläre Matrix menschlicher dermaler Fibroblasten (ECM) wird kaum berichtet. In dieser Arbeit wurde die Regulation von ECM zum ersten Mal sowohl auf proteomischer als auch auf transkriptomischer Ebene in dermalen Fibroblasten normaler menschlicher Haut nach 48-stündiger Inkubation mit Poly- und Oligosaccharidfraktionen von Ulva sp. erhalten nach enzymunterstützter Extraktion und Depolymerisation. Eine Steigerung der Zellproliferation (bis zu plus 68 Prozent) ohne zytotoxische Wirkung auf Fibroblasten wurde bei 50 und 1000 ug/ml von beiden Fraktionen nachgewiesen. Auf proteomischer Ebene verstärkten Polysaccharidfraktionen bei 1000 ug/ml am meisten die Synthese von Glykosaminoglykanen (GAGs, bis zu plus 57 Prozent), Gesamtkollagen, insbesondere Typ I (bis zu plus 217 Prozent) und Ⅲ sowie die Synthese und Aktivität von MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1, bis zu plus 309 Prozent). Im Gegensatz dazu hatten Oligosaccharidfraktionen keine Wirkung auf die GAG-Synthese, zeigten jedoch Ähnlichkeiten für Kollagene und MMP-1-Regulierung.puritaner vitamin cAuf Transkriptomebene bestätigten die Abnahme der COL1A1- und COL1A2-Expression und die Zunahme der COL3A1- und MMP-1-Expression die Modulation des ECM-Metabolismus durch beide Fraktionen. Unsere Forschung betont, dass das Poly- und Oligosaccharid Ulva sp. Fraktionen weisen interessante biologische Aktivitäten auf und unterstützen ihre potenzielle Verwendung im Bereich der Hauterneuerung für dermokosmetische Anti-Aging-Anwendungen.

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Schlüsselwörter:Kollagen; extrazelluläre Matrix; menschlicher dermaler Fibroblast; Matrix-Metalloproteinase; Seetang; Ulva sp.

1. Einleitung

Großflächige grüne Gezeiten, verursacht durch Uloa sp. sind in der Bretagne (Frankreich) aufgrund von Meereseutrophierung immer wieder aufgetreten. Strandungen von Grünalgen haben tiefgreifende nachteilige ökologische Auswirkungen, einschließlich der Veränderung der Ökosystemstruktur, der Verringerung der einheimischen Biodiversität und wirtschaftlicher Verluste [1,2]. Abgesehen von der Verwendung als Bodenverbesserung, Tierfutter oder einfachem Abbau durch Fäulnis oder Verbrennung bei Strandungsereignissen ist sehr wenig über die Verwertung von Uloa sp. bekannt. in der menschlichen Gesundheit [1]. Ulloa sp. ist eine wichtige Quelle für Verbindungen wie Ulvans. Evans, wasserlösliche sulfatierte Zellwandpolysaccharide, die hauptsächlich aus Rhamnose, Uronsäuren und Xylose bestehen, können bis zu 36 Prozent des Trockengewichts von Ulloa ausmachen [3]. Die beiden wichtigsten sich wiederholenden Disaccharideinheiten von Ulvan sind Aldobiuronsäuren (Ulvanobiuronsäuren), Typ A: -D-Glucuronsäure (1,4)-verknüpft mit -L-Rhamnose 3-sulfat und Typ B: -L- Iduronsäure (1,4)-verknüpft mit -L-Rhamnose 3-sulfat. Kleinere Disaccharidaldosen, die als Ulvanobiosen (Typ U) bezeichnet werden, können auch in Ulvan gefunden werden[3.4]. Die Ulvan-Extraktion in Bezug auf quantitative Ausbeute und Qualität kann je nach Extraktions- und Fraktionierungsverfahren, die auf die Biomasse angewendet werden, erheblich variieren. Ulvans werden üblicherweise in wässriger Lösung bei hohen Temperaturen (80-90 Grad) extrahiert, was als Mazerationsprozess bezeichnet wird. Evans kann jedoch durch eine neuartige grüne Technologie namens Enzyme-Assisted Extraction (EAE)[5] gewonnen werden. EAE ermöglicht die Extraktion von interessierenden Verbindungen ohne denaturierende Bedingungen wie Lösungsmittel oder hohe Extraktionstemperaturen und weist verschiedene Vorteile auf, wie z hohe katalytische Effizienz, hohe Spezifität, milde Reaktionsbedingungen und die Bewahrung der biologischen Aktivitäten der Verbindungen. EAE verbessert auch die Ausbeute und reduziert die Kosten und den Energieverbrauch im Vergleich zu einem klassischen Mazerationsprozess [6-9]. Nach wässriger Extraktion aus Mazeration oder einem neuartigen Verfahren wie EAE wird die Ulvan-Anreicherung oft durch ein ethanolisches Fällungsverfahren durchgeführt [3]. Ulvans haben in vitro und in vivo mehrere biologische Aktivitäten wie Immunmodulation, Antioxidans, Antikrebs, Antikoagulans, Antihyperlipidämie oder antivirale Wirkung gezeigt [3,5,10-14].sistancheDas strukturelle Merkmal von Evans (Sulfatierungsgrad, Sulfatierungsmuster, Monosaccharidzusammensetzung, glykosidische Bindungen, Verzweigungsgrad sowie Molekulargewicht) beeinflusst seine biologische Aktivität [3]

Die Hautalterung ist ein komplexer Prozess mit zwei komplementären Prozessen: intrinsisch (genetisch, Zellstoffwechsel usw.) und extrinsisch (UV-Exposition, Umweltverschmutzung, Tabakrauchen usw.)[15-17]

Cistanche kann Anti-Aging

Die Verwendung von bioaktiven Stoffen aus Meeresalgen als Quellen für Produkte mit hohem Mehrwert für die Dermokosmetikindustrie ist neu aufgetaucht. Unter diesen bioaktiven Verbindungen haben Ulvans ein hohes Potenzial. Tatsächlich ist die Nachfrage der Verbraucher nach Naturprodukten in den letzten Jahren gestiegen, was Meeresprodukte und insbesondere Algen zu einer interessanten Quelle für natürliche Inhaltsstoffe macht, die auf die Schönheit und Gesundheit der Haut abzielen [18-22]. Die Haut, das Ziel kosmetischer Produkte, besteht aus drei unterschiedlichen, überlappenden Hauptschichten: Epidermis, Dermis und Hypodermis.was ist cistancheDie Dermis unterstützt die Epidermis und beherbergt wichtige Hautzellen, die als Fibroblasten bekannt sind. Fibroblasten, die Hauptzellen der papillären Dermis, die sich direkt unter der Epidermis befinden, synthetisieren und organisieren im Wesentlichen die extrazelluläre Matrix (ECM). Die ECM besteht aus verschiedenen Makromolekülen, darunter Kollagene (70 Prozent des Trockengewichts), hauptsächlich Typ I und III, Elastin (2-4 Prozent), Glykoproteine ​​(Fibronectin, Laminin usw.), Glykosaminoglykane (GAGs), entweder sulfatiert (Heparan Sulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat, Chondroitinsulfat) und nicht sulfatierte (Hyaluronsäure), Proteoglykane und abbauende Komponenten wie MMPs (Matrix-Metalloproteinasen)[23,24]. Typ-I-Kollagen macht bis zu 80 Prozent des gesamten Kollagens aus [25] und ist einer der Hauptbestandteile der ECM der Hautdermis; es ist an der Elastizität, Flexibilität und Spannung der Haut beteiligt. Typ-I-Kollagen ist ein heterotrimeres Triple-Helix-Protein, das aus zwei cl-Ketten und einer c2-Kette besteht, die jeweils von COL1Al- und COL1A2-Genen kodiert werden [26]. Fibrilläre Kollagene vom Typ I und II machen über 90 Prozent des Gesamtkollagens aus und sind in der Haut eng assoziiert [27,28]. Typ-II-Kollagen kommt in junger Haut häufiger vor als in gealterter Haut und ist besonders an der Wundheilung beteiligt [29,30]. Um ein molekulares Netzwerk für den ECM-Zusammenbau aufzubauen, werden GAGs mit Proteinen assoziiert und bilden Proteoglykane (z. B. Decorin oder Versican), die mit Typ-I-Kollagen interagieren. sind in latenter oder aktiver Form mit ihrem Gewebeinhibitor von Metalloproteinasen, bekannt als TIMPs, verbunden, die ihre Aktivität regulieren [32]. MMP-1(Kollagenase-1) ist das Hauptenzym, das für den Abbau von Typ-I-Kollagen verantwortlich ist, und TIMP-1 ist sein entsprechender Inhibitor [334]. Fibroblasten sind Schlüsselregulatoren der ECM-Homöostase. Ein Gleichgewicht und eine Kopplung der Synthese zwischen ECM-Komponenten der Haut, die am Anabolismus beteiligt sind, wie z. B. Typ-I- und II-Kollagen, GAGs oder TIMPs, und am Katabolismus wie MMPs, ermöglichen die Erneuerung und den kontinuierlichen Umbau dieser ECM[25]. Bei Hautalterung , ist die Hauptfolge ein Ungleichgewicht der ECM-Regulierung mit der Verringerung der Fibroblastenproliferation, der Modulation der ECM-Komponentenspiegel mit einer erheblichen Verringerung der Typ-I-Kollagensynthese, der GAG-Sekretion und der TIMP-1-Synthese und der Zunahme von MMP-1-Level [24,35].

Bisher haben nur wenige Studien die Wirkung von Ulva sp. Fraktionen zum Metabolismus von Fibroblasten-Hautzellen sowohl auf proteomischer als auch auf transkriptomischer Ebene[36-39], und bis heute wurde keine vollständige Studie auf proteomischer und transkriptomischer Ebene an Ulua-Poly- und Oligosaccharidfraktionen durchgeführt, die aus dem EAE-Prozess stammen.Anti-Aging-CistancheVor diesem Hintergrund untersucht diese Studie in vitro die Wirkungen von Poly- und Oligosaccharidfraktionen aus Ulva sp. abgeleitet von neuartiger grüner Technologie EAE auf den Metabolismus menschlicher dermaler Fibroblasten. Ihre Auswirkungen auf die Proliferation und Lebensfähigkeit von Fibroblasten sowie auf ECM-Anabolismus und -Katabolismus auf proteomischer und transkriptomischer Ebene wurden untersucht, um ihr Potenzial in der Hautpflege (z. B. Anti-Aging) hervorzuheben.

2. Ergebnisse

2.1. Poly- und Oligosaccharidfraktionen von Ulva sp.

von EAE weisen eine unterschiedliche biochemische Zusammensetzung und Molekulargewichtsverteilung auf

Die Mechanismen der Produktion von Poly- und Oligosaccharidfraktionen sind im Abschnitt Material und Methoden aufgeführt: „4.2 Produktion und Charakterisierung von Poly- und Oligosaccharidfraktionen“. Gewichtsverteilung der Poly- und Oligosaccharidfraktionen von Ulloa sp. abgeleitet von EAE wurden durchgeführt [36]. Die Daten sind in Tabelle 1 kombiniert.

Kurz gesagt, Polysaccharidfraktionen von Roh-Ulvans (UE) und dialysierten Ulvans (DS-UE) bestehen aus Ulvans mit hohem Molekulargewicht (Roh-Vans) mit 23,5-37,4 Prozent Kohlenhydraten,18,5-37. 0 Prozent Uronsäuren, 29,9-49,1 Prozent Sulfatgruppen und 10,5-12,8 Prozent Proteine. Die Zusammensetzung der Kohlenhydrate bestand hauptsächlich aus Rhamnose (50 Prozent) und Glucuronsäure (11 Prozent). Die DS-UE-Fraktion ist deutlich reicher an Ulvans als die UE-Fraktion. Oligosaccharidfraktionen, depolymerisierte Vans aus HzO2 (DEP-HD PP-UE) und depolymerisierte Vans aus Amberlite-Harz (DEP-AD PP-UE), bestehen aus Vans mit niedrigem Molekulargewicht mit 24,4-30,4 % Kohlenhydraten ( Rhamnose 44,9-55,4 Prozent und Glucuronsäure 7,5-11,0 Prozent), 21,6-30,8 Prozent Uronsäuren und 12,8-16,8 Prozent Proteine.

Der Depolymerisationsprozess führte jedoch zu einem teilweisen Verlust von Sulfaten (nicht nachgewiesen in DEP-ADPP – und nur 6,6 Prozent in DEP-HD PP-UE). Die Verteilung des Molekulargewichts (Mw) der Oligosaccharidfraktionen zeigte ein durchschnittlich niedriges Mw von 8 kDa für DEP-HD PP-UE und niedriger für DEP-AD PP-U mit 1,5 kDa.

2.2. Poly- und Oligosaccharidfraktionen von Ulva sp. Stoffwechselaktivität stimulieren, aber die Lebensfähigkeit von Fibroblasten nicht beeinträchtigen

Die metabolische Aktivität normaler menschlicher dermaler Fibroblasten (NHDF), die 48 h Poly- und Oligosaccharid-Ulloa-Fraktionen (50 und 100 ug/ml für 48 h) ausgesetzt wurden, wurde mit WST -1 bewertet (Abbildung 1). In diesen Experimenten (n=9) ​​erhöhten Ullva-Fraktionen von EAE die Proliferation von Fibroblasten um bis zu plus 68 Prozent im Vergleich zur Kontrolle.cistanche benefíciosSignifikante Steigerungen der Stoffwechselaktivität (S<0.001)were observed="" for="" both="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 50="" and="" 1000="" ug/ml.="" oligosaccharide="" fractions="" exhibited="" a="" higher="" and="" more="" significant="" rise="" of="" metabolic="" activity="" at="" 100="" ug/ml="" (p=""><0.001) than="" at="" 50="" ug/ml(no="" significance="" for="" dep-hd="" pp-ue="" and="" lower="" significance,=""><0.05, for="" dep-ad="">

Um festzustellen, ob diese Wirkungen mit keiner Zelltoxizität einhergingen, wurde die Lebensfähigkeit von mit Ulou-Extrakt behandelten Zellen durch Messung der Freisetzung von LDH (Lactatdehydrogenase) unter Verwendung des CytoTox96-Grad-Assays nach 48 h Inkubation (n=3) bewertet (Abbildung 2). Der Zytotoxizitätsassay zeigte, dass alle Fraktionen im Vergleich zur Kontrolle keine signifikante Zytotoxizität aufwiesen.

2.3. Poly- und Oligosaccharidfraktionen von Ulva sp. Stimulieren Sie den Stoffwechsel der extrazellulären Matrix in Fibroblasten

Die Wirkung von Poly- und Oligosaccharid-Ulloa-Fraktionen auf die Synthese von sulfatierten und nicht sulfatierten Glykosaminoglykanen (GAGs) in Fibroblasten wurde mit Alcianblau-Färbung nach 48 h Inkubation (n=4) bewertet (Abbildung 3). Signifikante Synthesesteigerungen wurden nur für UE und DS-UE bei 100 ug/ml beobachtet, wenn man beide sulfatiert (S<0.01,+39% and="" +51%,respectively)="" and="" non-sulfated="" gags=""><0.05,+44% and="" +57%="">

Es ist interessant festzustellen, dass DS-UE, die reichste Ulvans-Fraktion, die GAGs-Synthese am meisten verstärkte. Bei 50 ug/ml erhöhten UE und DS-UE die Synthese nicht-sulfatierter GAGs, jedoch nicht signifikant (plus 14,2 Prozent bzw. plus 22,7 Prozent). Die Oligosaccharidfraktionen DEP-AD PP-UE bei 1000 ug/ml verminderten leicht die Synthese von nicht sulfatierten GAGs, aber nicht signifikant (-3 Prozent), und DEP-HD PP-UE erhöhten leicht, aber nicht signifikant die GAG-Synthese bei 100 ug/ml. ml (plus 4,1 Prozent für sulfatierte und plus 10,9 Prozent für nicht sulfatierte).

Die Gesamtkollagensynthese (Abbildung 4) wurde mit dem Red Sirius-Assay bewertet, nachdem Fibroblasten 48 Stunden lang Poly- und Oligosaccharid-Ulloa-Fraktionen (n=7 bei 100 ug/ml und n=6 bei 50 ug/ml) ausgesetzt waren. .

Alle Fraktionen zeigten eine konzentrationsabhängige Steigerung der Kollagensynthese. Ein marginaler und nicht signifikanter Rückgang der Kollagensynthese wurde für alle Fraktionen bei 50 ug/ml im Vergleich zur Kontrolle festgestellt<><0.01),and dep-hd=""><>

Die Wirkung der von Poly- und Oligosacchariden abgeleiteten EAE-Fraktion auf die Kollagensynthese vom Typ I (n=6) und die MMP-1-Synthese (n=4) wurde mit ELISA-Assays bewertet (Abbildung 5).

Alle Fraktionen verstärkten die Typ-I-Kollagensynthese und die MP-1-Synthese, jedoch nicht immer signifikant. Die Steigerung der Typ-I-Kollagensynthese war konzentrationsabhängig. Es wurde festgestellt, dass die Polysaccharidfraktionen, UE und DS-UE bei 1000 ug/ml signifikant （S<05）increase type="" i="" collagen="" synthesis="" (+122%,="" and="" +217%="" respectively)="" and="" mmp-1="" synthesis="" (+309%="" and="" +169%="">

Die Wirkungen von Poly- und Oligosaccharid-Ulloa-Fraktionen bei 100 ug/ml nach 48-stündiger Fibroblasten-Exposition auf die Synthese von Typ-I(n=5)- und Typ-Ⅲ(n=4)-Kollagenen, auf die Produktion von MMP-1(n=6) und TIMP-1(n=5) ​​wurden durch Western-Blot (WB)-Analyse mit Normalisierungsmethode unter Verwendung der Gesamtspurproteinmethode ( Abbildung 6).

In den Abbildungen 6a, e und WB wurde jeweils eine Zunahme der Synthese von reifem Typ-I-Kollagen (≈130 kDa) und reifem Typ-III-Kollagen (≈190 kDa) für alle Fraktionen hervorgehoben. Die Proteinquantifizierung in Fig. 6c von Typ-I-Kollagen und Fig. 6g von Typ-III-Kollagen zeigte eine NS-Steigerung (nicht statistisch signifikant) ihrer Synthese in Gegenwart von sowohl Poly- als auch Oligosacchariden Ulloa sp. Brüche. In der Zwischenzeit ermöglichte uns WB in Abbildung 6b,d, einen signifikanten （S<05）increase of="" mmp-1="" production="" （≈50kda）for="" polysaccharide="" fractions="" and="" not="" significant="" for="" oligosaccharide="" ulloa="" eae-derived="" fractions="" dep-ad="" pp.="" ue="" and="" dep-hd="" pp-ue.="" wb="" quantification="" of="" timp-1="" production="" （≈20kda）,="" available="" in="" figure="" 6f,h,="" showed="" only="" a="" significant="" increase="" in="" presence="" of="" the="" dep-hd="" pp-ue="" fraction=""><0.05), while="" other="" fractions="" had="" no="" significant="">

Die MMP-1-Kollagenase-Aktivität wurde durch Zymographie-Assay in Gegenwart von Poly- und Oligosaccharid-Ulloa-Fraktionen bei 100 ug/ml (Abbildung 7a) bestimmt, quantifiziert und mit der Kontrolle verglichen (Abbildung 7b), nach 48-stündiger Fibroblasten-Exposition (n =4).

Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl das Poly- als auch das Oligosaccharid Ulva sp. Fraktionen erhöhten die MMP-1-Aktivität von Fibroblasten nicht signifikant.

2.4. Poly- und Oligosaccharidfraktionen von Ulva sp. Differenzielle Modulation der ECM-Genexpression von Fibroblasten

Die Wirkung von Poly- und Oligosaccharid-Ulloa-EAE-abgeleiteten Fraktionen wurde auf die mRNA-Steady-State-Spiegel mehrerer extrazellulärer Matrixkomponenten (COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP-1 und TIMP-1) untersucht (n =4)(Abbildung 8).

Wir haben festgestellt, dass alle Fraktionen bei 1000 ug/mL signifikant abgenommen haben (S<0.01 and=""><05)col1a1 mrna="" steady-state="" levels="" (figure="" 8a).="" in="" contrast,="" we="" noted="" that="" all="" fractions="" increased="" mmp-1="" mrna="" level="" expression="" significantly="" (p="" <="" 0.05)="" for="" ue="" at="" both="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml="" only="" (figure="" 8c).="" timp-1="" mrna="" steady-state="" level="" was="" not="" significantly="" changed,="" but="" dep-hd="" pp-ue="" and="" dep-ad="" pp-ue="" reduced="" it="" not="" significantly="" at="" 50="" ug/ml="" (figure="" 8e).="" the="" col1a2="" mrna="" steady-state="" level="" (figure="" 8b)="" is="" enhanced="" (ns)="" for="" both="" ue="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml.="" however,="" it="" is="" lower="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" ds-ue="" (ns),="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue="" (only="" significant="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" the=""><0.05). polysaccharide="" fractions,="" ue="" and="" ds-ue,="" raised="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" significantly=""><0.05) at="" 1000="" ug/ml="" and="" at="" 50="" ug/ml="" for="" ue="" (ns="" for="" ds-ue)(figure="" 8d).="" oligosaccharide="" fractions,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" at="" 1000="" ug/ml="" raised="" not="" significantly="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" and="" reduced="" it="" at="" 50="" μg/ml（significant="" only="" for="" dep-ad=""><>

Tabelle 2 zeigt die kombinierten Ergebnisse zum Steady-State-Niveau der Gen-mRNA nach Fibroblasten-Exposition gegenüber Fraktionen mit 1000 ug/ml.

Tabelle 2 zeigt, dass die UE signifikant zurückging (S<0.01)col1al and="" increased="" signifi-cantly=""><0.05) mmp-1="" and="" col3a1,="" and="" not="" significantly="" col1a2mrna="" steady-state="" levels.="" for="" ds-ue,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" similar="" mrna="" steady-state="" levels="" with="" a="" decrease="" in="" col1a1=""><0.01), in="" col1a2(only="" significant=""><0.05 for="" dep-ad="" pp-ue),="" increase="" in="" col3a1="" (only="" significant=""><0.05 for="" ds-ue),="" increase="" in="" mmp-1(ns),="" and="" no="" significant="" change="" in="" timp-1="" mrna="" expression="" were="">

Dieser Artikel Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs