Sagen Sie die Rolle von LncRNA bei der Nierenalterung basierend auf der RNA-Sequenzierung voraus Ⅱ

Korrelation von lncRNA Gm43360 und seinen potenziellen Ziel-mRNAs

LncRNA Gm43360 wurde für die Studie ausgewählt, weil es zwei lncRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerke verband. Das Expressionsniveau von Adra1a war positiv korreliert (rho=0.8650, p=0.026) mit dem von Gm43360, Csnk1a1 (Caseinkinase 1A1) war negativ korreliert (rho{{12 }}.8084, p=0.0084) (Abb. 5a). Um die Korrelation von lncRNA Gm43360 und seinen potenziellen Ziel-mRNAs Adra1a und Csnk1a1 weiter zu verifizieren, wurde in dieser Studie ein Überexpressionsplasmid von lncRNA Gm43360 entworfen. Die Expression von Csnk1a1 nahm wie erwartet ab und die Adra1a-Expression nahm ebenfalls ab, jedoch nicht signifikant. Als nächstes haben wir lncRNA Gm43360 durch siRNA ausgeschaltet, um festzustellen, ob die Expression seiner Ziel-mRNAs beeinträchtigt war. Wie erwartet war Csnk1a1 in lncRNA-Gm43360-Knockdown-Zellen im Vergleich zur siRNA-Negativkontrollgruppe erhöht (Abb. 5b). Zehntens haben wir die Rolle der lncRNA Gm43360 im Zellzyklus entdeckt. Die Ergebnisse des Zellzählkits -8 (CCK-8) zeigten, dass lncRNA Gm43360 die Lebensfähigkeit der Zellen förderte (Abb. 5c). Die Ergebnisse zeigten, dass lncRNA Gm43360 den Prozentsatz der S-Phasen-Zellen erhöhte und den Prozentsatz der G1-Phasen-Zellen im Vergleich zur Negativkontrolle verringerte (Abb. 5d). Die Proteine ​​p53 und p21 waren an der Regulierung des Zellzyklus beteiligt und waren somit die Zeichen der Zellalterung. Die Expressionsniveaus von p53 und p21 waren in der Überexpressionsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verringert. Die Expressionsniveaus von p53 und p21 waren in der siRNA-Gruppe im Vergleich zur siRNA-Kontrollgruppe signifikant erhöht (Abb. 5e). Die Überexpression von lncRNA Gm43360 verringerte die Anzahl der SA- -gal-positiven Zellen, und -gal-positive Zellen nahmen in der Gruppe der transfizierten Gm43360 zu (Abb. 5f). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass lncRNA Gm43360 die Seneszenz von renalen tubulären Epithelzellen hemmtHemmung der Expression von Csnk1a1.

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Diskussion

In dieser Studie haben wir die mRNA-Expressionsdaten von Nieren junger und alter Mäuse ausgewertet und Bioinformationsanalysen durchgeführt, die die Funktionen der fehlerhaft exprimierten mRNAs offenlegten. Wir beobachteten 347 hochregulierte mRNAs und 355 herunterregulierte mRNAs sowie 130 hochregulierte lncRNAs und 91 herunterregulierte lncRNAsalte Mäusenieren im Vergleich zu jungen Mäusenieren. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese mRNAs an altersbedingten Signalwegen beteiligt sind, wie zoxidative Phosphorylierung, der AMPK-Signalweg, der Wnt-Signalweg, der Rap1-Signalweg und altersbedingte Erkrankungen, die die Funktionen unterschiedlich exprimierter mRNAs bei der Pathogenese der Nierenalterung zeigten.

Die lange nichtkodierende RNA NEAT1 ist ein Schutzfaktor beim Fortschreiten der Nierenfibrose in renalen tubulären Epithelzellen [21]. Zufälligerweise wurde in unseren Sequenzierungsergebnissen lncRNA NEAT1 in den Nieren älterer Mäuse in geringerem Maße exprimiert als bei jungen Mäusen, was mit früheren Erkenntnissen übereinstimmt. LincRNA-Gm4419 beschleunigt die Entzündung und Fibrose durch NF-kB/NLRP3-Inflammasom-vermittelte Mechanismen bei diabetischer Nephropathie [22]. In unseren Sequenzierungsergebnissen stellten wir außerdem fest, dass die Expression von Gm4419 in den Nieren älterer Mäuse höher war als bei jungen Mäusen, es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied. LncRNA Gm43360 befindet sich auf Chromosom 5 (Chr5:122494022–122.494.908, 2887 bp). Laut UCSC Genome Browser befindet sich Gm43360 im Intron des proteinkodierenden Gens Atp2a2. Über eine Beteiligung der lncRNA Gm43360 an Erkrankungen liegen bislang jedoch keine Berichte vor. In dieser Studie förderte der Abbau von lncRNA Gm43360 die Seneszenz der renalen tubulären Epithelzellen. Darüber hinaus haben wir in den Sequenzierungsergebnissen viele unterschiedlich exprimierte lncRNAs identifiziert und untersucht.

LncRNAs wurden basierend auf den lncRNA-Regulationsmechanismen in cis-Regulation oder Trans-Regulation eingeteilt. Cis-wirkende lncRNAs könnten die Expression benachbarter Gene beeinflussen, indem sie von cis-wirkenden Elementen wie Promotoren, Enhancern und regulatorischen Sequenzen abhängig sind, bei denen es sich um Abstände zwischen lncRNAs und mRNAs von weniger als 100 kb handelt. Transaktive lncRNAs beziehen sich auf lncRNAs, die die Transfektionsstelle verlassen und an entfernten Orten wirken (d. h. der Abstand zwischen lncRNAs und mRNAs beträgt mehr als 100 kb) [23]. Die lncRNA MAAT erhöht die Expression des Nachbargens Mbnl1 durch ein cis-regulatorisches Modul [24]. Die lncRNA Pnky spielt eine Rolle als transaktiver Regulator bei der kortikalen Entwicklung [25]. In dieser Studie gab es eine transregulatorische Beziehung zwischen lncRNA Gm43360 und Csnk1a1. Csnk1a1 ist ein Tumorsuppressorgen [26], das ein Protein kodiert, das am Zellzyklus und am Zellteilungsprozess beteiligt ist [27]. Eine Herunterregulierung von Csnk1a1 wird induziertSeneszenz-assoziierte EntzündungReaktion mit Wachstumsstopp bei kolorektalen Tumoren [26]. Csnk1a1 wurde herunterreguliert, als Gm43360 hochreguliert wurde; Daher ist es wahrscheinlich, dass lncRNA Gm43360 daran beteiligt istNierenalterungvonRegulierung des Csnk1a1-Ausdrucks.

Schlussfolgerungen

Unsere Untersuchung des lncRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerks inNierenalterungenthüllten, dass eine lncRNA, lncRNA Gm43360, eine schützende Rolle bei der Nierenalterung spielen könnte, und erweiterten unser Verständnis der daran beteiligten MechanismenNierenalterung

Materialen und Methoden

Proben: Junge (3- Monate alte) und alte (24- Monate alte) männliche C57BL/6J-Mäuse wurden vom Experimental Animal Center der Universität Xiamen gekauft und in einer Standardumgebung aufgezogen. Alle Mäuse hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Die Mäuse wurden einen Monat lang an die neue Anlage gewöhnt, bevor sie getötet wurden. Die Mäuse wurden vor der Probenentnahme durch intraperitoneale Injektion mit Urethan in einer Dosis von 750 mg/kg anästhesiert. Junge und alte Mäuse wurden am selben Tag getötet.Restliche MäuseniereFür die Sequenzierung wurde in jedem Assay Gewebe verwendet. RNA-Seq und Histopathologie wurden durchgeführtgetrennte Nierenvon derselben Maus. Nierengewebe wurde von Mäusen gesammelt. Eine Niere wurde sofort in 10 % neutral gepuffertes Formalin getaucht, um anschließend den Schnitt einzubetten. Die andere Niere wurde in mehrere Gewebe geteilt und sofort in flüssigen Stickstoff gelegt und dann bei -80 Grad gelagert. Die Studie wurde von der Ethikkommission des First Affiliated Hospital der Xi'an Jiaotong University (Shaanxi, China) (Nr. 2018-G-164) unterstützt. Alle Methoden wurden gemäß den tierethischen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Histopathologie der Niere

Nierengewebeproben von jungen und alten Mäusen wurden über Nacht in 10 % Paraformaldehydlösung fixiert. Zehn der Schnitte wurden dehydriert, in Paraffin eingebettet und mit einer Dicke von 4-µm geschnitten. PAS und Massons trichromatische Färbung wurden unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt. Die Bilder wurden mit der Kamera aufgenommen und der färbungspositive Bereich wurde gemessen. Der Bereich für die histopathologischen Kamerabilder wurde mit Image-Pro Plus 6.0 berechnet.

SA‑‑Gal-Färbung

Die SA{{0}}gal-Aktivität wurde mit einem SA- -gal-Färbekit (Cell Signaling Technology #9860) gemäß dem Protokoll des Herstellers analysiert. Der Bereich der positiven Färbung wurde gemessen und SA- -gal-positive Zellen wurden mit Image-Pro Plus 6.0 berechnet.

Aufbau und Sequenzierung einer RNA-Extraktionsbibliothek

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 wurden zum Aufbau einer Sequenzierungsbibliothek verwendet. Nach der Extraktion der Gesamt-RNA wurde die mRNA von der Gesamt-RNA (5 ug) unter Verwendung von Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, USA) mit zwei Reinigungsrunden gereinigt. Nach der Reinigung wurde die mRNA unter Verwendung zweiwertiger Kationen bei hohen Temperaturen (Magnesium RNA Fragmentation Module (NEB, Kat. e6150, USA) unter 94 Grad 5-7 min) in kurze Fragmente gespalten. Dann wurden die gespaltenen RNA-Fragmente revers transkribiert, um die cDNA durch SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Kat. 1,896,649, USA) zu erhalten, die anschließend zur Synthese von U-markierten zweitsträngigen DNAs mit E. coli-DNA-Polymerase I verwendet wurde ( NEB, Kat. m0209, USA), RNase H (NEB, Kat. m0297, USA) und dUTP-Lösung (Termo Fisher, Kat. R0133, USA). Anschließend wurde den glatten Enden jedes Strangs eine A-Base hinzugefügt, um sie für die Ligation an die indizierten Adapter vorzubereiten. Jeder Adapter enthielt einen T-Basen-Überhang zum Ligieren des Adapters mit der A-tailierten fragmentierten DNA. Dual-Index-Adapter wurden an die Fragmente ligiert und die Größenauswahl erfolgte mit AMPureXP-Kügelchen. Nach der Behandlung der U-markierten zweitsträngigen DNAs mit dem hitzelabilen UDG-Enzym (NEB, Kat. m0280, USA) wurden die ligierten Produkte mit PCR unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: anfängliche Denaturierung bei 95 Grad für 3 Minuten; 8 Denaturierungszyklen bei 98 Grad für 15 Sekunden, Annealing bei 60 Grad für 15 Sekunden und Extension bei 72 Grad für 30 Sekunden; und dann abschließende Verlängerung bei 72 Grad für 5 Minuten. Die durchschnittliche Insertlänge für die endgültigen cDNA-Bibliotheken betrug 300 ± 50 bp. Schließlich führten wir die 2×150 bp Paired-End-Sequenzierung (PE150) auf einem Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, China) gemäß dem Protokoll des Herstellers durch [28].

Bioinformatische Analyse, Reihenfolge und Filterung von Clean Reads

Eine cDNA-Bibliothek, die durch Technologie aus der gepoolten RNA von erstellt wurdeNierenprobenvon Mäusen wurde sequenziert und mit der Illumina NovaseqTM 6000-Sequenzplattform durchgeführt. Mithilfe des Paired-End-RNA-Seq-Ansatzes von Illumina sequenzierten wir das Transkriptom und generierten insgesamt Millionen 2×150 bp Paired-End-Reads. Zu den von den Sequenzierungsmaschinen erhaltenen Lesevorgängen gehören Rohlesevorgänge, die Adapter oder Basen geringer Qualität enthalten, die sich auf die folgende Zusammenstellung und Analyse auswirken. Um qualitativ hochwertige saubere Lesevorgänge zu erhalten, wurden die Lesevorgänge daher von Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9) weiter gefiltert. Die Parameter waren wie folgt:

1) Entfernen von Lesevorgängen, die Adapter enthalten;

2) Entfernen von Lesevorgängen, die polyA und poly enthalten;

3) Entfernen von Lesevorgängen, die mehr als 5 % unbekannte Nukleotide (N) enthalten;

4) Entfernen von Lesevorgängen geringer Qualität, die mehr als 20 % Basen geringer Qualität (Q-Wert kleiner oder gleich 20) enthalten.

Die Qualität von zehn Sequenzen wurde mit FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9) überprüft. einschließlich des Q20-, Q30- und GC-Inhalts der sauberen Daten. Danach wurden insgesamt G bp an bereinigten Paired-End-Reads erzeugt. Die Rohsequenzdaten wurden an die NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)-Datensätze mit der Zugangsnummer GSE154223 übermittelt.

Das Referenzgenom/die Referenzanmerkung war Mus_musculus.GRCm38. Die Quelle und Version der für die Analysen verwendeten Genannotation war Ensembl_v88.

Zusammenstellung der Transkripte

Zunächst wurde Cutadapt [29] verwendet, um die Lesevorgänge zu entfernen, die Adapterverunreinigungen, Basen von geringer Qualität und unbestimmte Basen enthielten. Die Qualität der zehn Sequenzen wurde mithilfe von FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/) überprüft. Wir verwendeten Bowtie2 [31] und Hisat2 [32], um Lesevorgänge dem Genom der Maus zuzuordnen. Die zugeordneten Lesevorgänge jeder Probe wurden mit StringTie [33] zusammengestellt. Zehn, alle Transkripte vonNierenprobenwurden zusammengeführt, um mithilfe von Perl-Skripten ein umfassendes Transkriptom zu rekonstruieren. Nachdem das endgültige Transkriptom generiert wurde, wurden StringTie (33) und EdgeR (34) verwendet, um die Expressionsniveaus aller Transkripte abzuschätzen.

LncRNA-Identifizierung

Zunächst wurden Transkripte, die mit bekannten mRNAs überlappten, und Transkripte, die kürzer als 200 bp waren, verworfen. Dann verwendeten wir CPC [35] und CNCI [36], um Transkripte mit Kodierungspotenzial vorherzusagen. Alle Transkripte mit CPC-Score<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Analyse differenziell exprimierter Analysegene (DGEs).

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 wurden als unterschiedlich exprimierte Gene betrachtet.

Zielgenvorhersage und Funktionsanalyse von lncRNAs

Um die Funktion von lncRNAs zu untersuchen, haben wir die cis-Zielgene von lncRNAs vorhergesagt. LncRNAs könnten eine cis-Rolle bei der Einwirkung auf benachbarte Zielgene spielen. In dieser Studie wurden kodierende Gene in 100,000 Upstream- und Downstream-Bereichen per Perl-Skript ausgewählt. Anschließend zeigten wir eine Funktionsanalyse der Zielgene für lncRNAs mithilfe der Skripte BLAST2GO [39]. Der vollständige Befehlslink zur öffentlichen Domain war Jie-Li/README.md unter main · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Kategorien der Genontologie (GO) und Analyse der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

Die bioinformatische Analyse für die RNA-Sequenzierung wurde mit OmicStudio-Tools (http://www.omicsudio. cn/tool) durchgeführt. Die funktionelle Anreicherungsanalyse der Gene Ontology (GO) und die Anreicherungsanalyse der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [37–39] wurden verwendet, um die biologischen Funktionen der vorhergesagten Zielgene zu analysieren. Die GO-Analyse klärt die wichtigsten biologischen Prozesse anhand von drei Aspekten: Zellzusammensetzung, molekulare Funktionen und biologische Prozesse (http://www.geneontology.org/). Bei der Analyse werden zunächst alle differentiell exprimierten Gene und Hintergrundgene in die GO-Datenbank aufgenommen. Jedes Element wird kartiert, die Anzahl der Gene in jedem Element wird berechnet und die hypergeometrische Verteilung wird verwendet, um Hypothesentests durchzuführen, um den P-Wert des Anreicherungsergebnisses zu erhalten. Je niedriger der P-Wert ist, desto aussagekräftiger ist das Anreicherungsergebnis. KEGG ist eine Datenbankressource, die die unterschiedlich exprimierten mRNAs genetisch biologisch analysiert, um wichtige Pfade im Zusammenhang mit Zielgenen zu untersuchen (https://www.genome.jp/kegg/). Die Ergebnisse werden durch p-Werte ausgedrückt; Je niedriger der p-Wert, desto aussagekräftiger ist das Anreicherungsergebnis.

qRT–PCR

Als endogene Kontrolle wurde GAPDH verwendet. Anschließend wurden die relativen Expressionsniveaus unbekannter Gene berechnet. Alle Primer wurden speziell für dieses Experiment entworfen und synthetisiert. Primer für GAPDH wurden kommerzialisiert. Die Spezifität der Adra1a- und Csnk1a1-Primer wurde durch den einzelnen Peak der Schmelzkurve identifiziert.

Bauen Sie ein mRNA-lncRNA-Koexpressionsnetzwerk auf

Die Transregulierung basierte auf Forschung, und dann wurde die Trans-Energie berechnet. Je kleiner die trans-Energie war, desto höher war die Bindungsmöglichkeit. Anschließend wurde auch der Korrelationskoeffizient von mRNA-lncRNA berechnet. Das mRNA-lncRNA-Netzwerk wurde durch die Wahl eines Spearman-Korrelationskoeffizienten von mehr als 0,9 konstruiert. Das mRNA-lncRNA-Koexpressionsnetzwerk wurde mit der Cytoscape-Software (v3.7.1) erstellt.

Zellkultur

Proximale tubuläre Epithelzellen der Mausniere (MRPT-EpiCs) wurden in tierischem Epithelzellmedium (EpiCM-a, Kat.-Nr. 4131), das 2 % fötales Rinderserum (FBS, Kat.-Nr. 0010) und Epithelzellwachstumsergänzung (Tier) enthielt, kultiviert (EpiCGS-a, Kat. Nr. 4182) ohne Antibiotika in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad und 5 % CO2. Das Kulturmedium wurde alle 2–3 Tage gewechselt. Die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden subkultiviert, als das Wachstum 90 % erreichte. Die durch Trypsin verdaute Zellsuspension wurde in Platten mit 6-Vertiefungen mit 2*104 -5*104 Zellen in jeder Vertiefung ausgesät. Die zur Transfektion verwendeten Zellen stammten alle aus der Generation 2 bis 5.

Plasmidkonstruktion und Zelltransfektion

Das Überexpressionsplasmid lncRNA Gm43360 wurde von GeneChem (Shanghai, China) konstruiert. Das Plasmidrückgrat war GV658 und der CMV-Promotor steuerte die lncRNA-Expression. Die klonierte Nukleotidsequenz ist im Zusatzmaterial enthalten. Für den Knockdown von lncRNA Gm43360 MÜSSEN drei lncRNA ENS00000197656-siRNAs anvisieren (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'-CCCUGUCACUCA UGAAGUUTT-3'; und lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT-3') wurden bei GenePharma (Shanghai, China) entworfen und synthetisiert. Gemäß dem Protokoll des Herstellers wurden die Zellen mit 2500 ng Plasmid oder 100 pmol siRNA mit 6 µl Lipofectamine™ 2000 Transfektionsreagenz (Invitrogen, USA) pro Vertiefung transfiziert. RNA- und Proteinexpressionsniveaus wurden 48 Stunden nach der Transfektion nachgewiesen und jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt. Quantitative Echtzeit-PCR wurde verwendet, um die Effizienz der Überexpression und des Knockdowns von lncRNA Gm43360 zu validieren.

Western-Blot-Analyse

Kultivierte Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen, 120 µl RIPA-Puffer (Heart, China) wurden zugegeben und Proteaseinhibitor und PMSF (Heart, China) wurden 30 Minuten lang auf Eis zugegeben. Nach dem Sammeln der Zellen in verschiedenen Mikrozentrifugenröhrchen wurde die Proteinkonzentration quantifiziert. Zu jeder Probe wurde Ladepuffer hinzugefügt und dann 7 Minuten lang gekocht. Dreißig Mikrogramm der Probe wurden durch 12 % SDS-PAGE (Beyotime, China) aufgetrennt und auf PVDF-Membranen (Thermo Fisher, USA) elektrotransferiert. Anschließend wurden die Membranen mit 5 %iger Milch blockiert. Die Membranen wurden mit spezifischen Primärantikörpern inkubiert: Anti-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), Anti-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP) und Anti-GAPDH (1:3000, Profintech). , 60004-1-Ig) über Nacht bei 4 Grad. Nach dem Waschen mit TBST wurden die Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem sekundären Antikörper inkubiert. Proteinbanden wurden mit einem Chemilumineszenz-Kit (Millipore, USA) beobachtet. Die Expression von GAPDH wurde zur Normalisierung der Proteinspiegel verwendet.

Zellproliferationstest

Die Kapazität der Zellproliferation wurde mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-Assay bestimmt. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden 90 µl neues Medium und 10 µl CCK-8-Lösung in jede Vertiefung gegeben (Beyotime, C0042). Die Zellen wurden 1–4 Stunden lang bei 37 Grad in 5 % CO2 inkubiert und bei 450 nm mit einem universellen Mikroplatten-Lesegerät (Bio-Tek, USA) gemessen.

Durchflusszytometrische Analyse

Die Zellen wurden am Tag vor der Transfektion in 6-Well-Platten ausplattiert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und 5 Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen mindestens 4 Stunden lang bei 4 Grad in 70 % Ethanol fixiert. Nach der Zentrifugation wurde RNase A und Propidiumiodid (PI)-Färbelösung zu den Zellen gegeben und die Zellen wurden dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Te-gefärbte Zellen wurden mit einem ACEA NovoCyte (Biosciences, USA) analysiert.

statistische Analyse

Die Messdaten der Normalverteilung werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Der Unterschied zwischen den beiden verschiedenen Gruppen wurde mithilfe zweiseitiger, ungepaarter Student-t-Tests bestimmt und ein p-Wert < 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Berechnungen wurden mit GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., USA) durchgeführt.

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