Prädiktive Bedeutung der Expression von Kidney Myeloid-Related Protein 8 bei Patienten mit Adipositas- oder Typ-2-Diabetes-assoziierten Nierenerkrankungen
Mar 16, 2022
Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com
Takashige Kuwabara1, Kiyoshi Mori1,2*, Masato Kasahara1,3, Hideki Yokoi1, Hirotaka Imamaki1,AkiraIshii1, Kenichi Koga1, Akira Sugawara4, Shinji Yasuno3, Kenji Ueshima3, Takashi Morikawa5,Yoshio Konishi5, Masahito Imanishi5, Akira Nishiyama6, Kazuwa Nakao1,2, Masashi Mukoyama1
1Department of Medicine and Clinical Science, Graduate School of Medicine der Universität Kyoto, Kyoto, Japan,
2Medical Innovation Center, GraduateSchool of Medicine der Universität Kyoto, Kyoto, Japan,
3Department of EBM Research, Institute for Advancement of Clinical and Translational Science, Kyoto University Hospital, Kyoto, Japan,
4Abteilung für Nephrologie, Osaka Red Cross Hospital, Osaka, Japan,
5 Abteilung für Nephrologie und Bluthochdruck, Allgemeines Krankenhaus der Stadt Osaka, Osaka, Japan,
6 Abteilung für Pharmakologie, Medizinische Fakultät der Universität Kagawa, Kagawa, Japan
Abstrakt
Hintergrund und Zielsetzung: Wir haben berichtet, dass der Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) und einer seiner endogenen Liganden, myeloid-related protein 8 (MRP8 oder S100A8), eine wichtige Rolle bei der Progression der diabetischen Nephropathie bei Mäusen spielen. Das Ziel dieser Studie war es, die Bedeutung von zu bewertenNiereMRP8-Expression bei Patienten mitFettleibigkeit- oder Typ-2-Diabetes-assoziiertNierenerkrankungen. Methoden: Bei Diabetikern, Fettleibigen oder Kontrollpersonen wurden die MRP8-mRNA- und Proteinexpressionsniveaus in Nierenbiopsieproben durch Echtzeit-RT-PCR und Immunhistochemie (n=28 bzw. 65) und ihre Assoziationen mit dem Ausgangswert bestimmt und prognostische Parameter wurden analysiert. Die Wirkungen von MRP8 auf die entzündungsfördernde Genexpression wurden unter Verwendung von Makrophagen untersucht. Ergebnisse:NiereDie MRP8-Gen- und -Proteinexpressionsniveaus waren in fettleibigen oder diabetischen Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht. Bei allen Probanden korrelierten laut univariater linearer Regressionsanalyse die glomeruläre MRP8--positive Zellzahl und der tubulointerstitielle MRP8--positive Bereich zu Studienbeginn jeweils nicht nur mit verschiedenen bekannten Risikofaktoren für diabetische Nephropathie (wie z B. systolischer Blutdruck, Proteinurie und Serumkreatinin), aber auch mit dem Ausmaß der Glomerulosklerose und der tubulointerstitiellen Fibrose. Unabhängige Faktoren, die die Proteinspiegel im Urin ein Jahr später vorhersagten, wurden durch multivariate Analyse untersucht, und sie umfassten die glomeruläre MRP8--positive Zellzahl (b=0.59, P, 0.001), Proteinurie (b=0 0,37, P=0 0,002) und systolischer Blutdruck (b=0 0,21, P=0 0,04) zu Studienbeginn, nach Anpassung für bekanntes Risiko Faktoren. MRP8-Proteinexpression wurde in CD68--positiven Makrophagen und atrophischen Tubuli beobachtet. In kultivierten Maus-Makrophagen lösten MRP8-Protein-induzierte proinflammatorische Zytokinexpressionen auch eine Autoinduktion von MRP8 in TLR4--abhängiger Weise aus.
Schlussfolgerungen: Die glomeruläre MRP8-Expression scheint mit dem Fortschreiten der Proteinurie bei adipösen oder Typ-2-Diabetikern assoziiert zu sein, möglicherweise durch Induktion entzündlicher Veränderungen in Makrophagen durch TLR4-Signalgebung.
Wirkungen von Cistanche: Behandlung von Nierenerkrankungen
Einführung
Chronische Entzündungen spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Diabetes bzwFettleibigkeitund seine kardiovaskulären Komplikationen [1]. Die Beteiligung der angeborenen Immunrezeptoren und der endogenen Liganden am Prozess der chronischen Entzündung wurde in Verbindung gebracht. Myeloid-related protein 8 (MRP8, auch bekannt als S100A8 oder Calgranulin A) wurde ursprünglich als zytoplasmatisches Calcium-bindendes Protein in Neutrophilen und Monozyten identifiziert [2] und ist inzwischen weithin als potenter endogener Ligand für den Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4 ) bei verschiedenen Krankheiten, einschließlich septischem Schock, Gefäß- und Autoimmunerkrankungen [3,4,5]. Wir haben kürzlich vorgeschlagen, dass die MRP8/TLR4-Signalgebung eine wichtige Rolle bei der Hyperlipidämie-induzierten Progression der diabetischen Nephropathie spielt [6]. Glomeruläre Makrophagen und Sammelrohrzellen sind Hauptquellen von MRP8 in Mausmodellen für diabetische Nephropathie[6] bzw. Nierenfibrose [7]. Die Plasmaspiegel von MRP8, das normalerweise einen heterodimeren Komplex mit einem Bindungspartner MRP14 im Blutkreislauf bildet, sind bei adipösen Personen erhöht [8,9]. Es gab jedoch keine Berichte, die die renale Expression von MRP8 bei Patienten mit Adipositas oder Adipositas untersuchtenTyp2Diabetesund seine Assoziation mit der Nierenprognose.
Das Ziel dieser Studie war es, die mRNA- und Proteinexpressionsniveaus von MRP8 in der zu bestimmenNierevon japanischen Patienten mit diabetischer Nephropathie (DN),Fettleibigkeit-bezogene Glomerulopathie (ORG), nephrotisches Syndrom mit minimaler Veränderung (MCNS) oder geringfügige glomeruläre Anomalie (MGA), die alle durch Nierenbiopsie diagnostiziert wurden, und um zu bewerten, ob die renale MRP8-Expression die renalen Ergebnisse vorhersagen kann.
Cistanche kann die Nierenfunktion verbessern
Materialen und Methoden
Ethik-Erklärung
Die Humanstudie wurde gemäß den in der Deklaration von Helsinki zum Ausdruck gebrachten Grundsätzen durchgeführt und von den Ethikkommissionen für Humanforschung der Graduate School of Medicine der Universität Kyoto bzw. des Allgemeinen Krankenhauses der Stadt Osaka genehmigt. Alle Teilnehmer gaben ein schriftliches Einverständnis. Das Tierstudienprotokoll wurde vom Animal ResearchCommittee der Graduate School of Medicine der Universität Kyoto genehmigt (Genehmigungsnummer: Med Kyo 13318). Alle Tieroperationen wurden unter Natriumpentobarbital-Anästhesie durchgeführt, und es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden zu minimieren.
Studienfächer
Proteinurische Patienten mitFettleibigkeitoder Typ-2-Diabetes, die sich einer Nierenbiopsie unterzogen, wurden in diese Studie aufgenommen. Patienten mit Infektionskrankheiten, Krebs, Lebererkrankungen oder Kollagenerkrankungen wurden ausgeschlossen. Proteinurie wurde definiert als Protein im Urin von mehr als 0,5 g/g Kreatinin oder Albumin im Urin von mehr als 300 mg/g Kreatinin bei mindestens zwei aufeinanderfolgenden Messungen.Fettleibigkeitwurde definiert als ein Body-Mass-Index (BMI) größer als 25,0 (kg/m2). Typ-2-Diabetes wurde gemäß den Kriterien der Weltgesundheitsorganisation diagnostiziert. Biochemische Messungen bei der Aufnahme zur Nierenbiopsie wurden als Grundlinienmerkmale für die Querschnittsanalyse verwendet. Die geschätzte glomeruläre Filtrationsrate (eGFR) wurde unter Verwendung einer vereinfachten Vorhersagegleichung berechnet, die von der Japanese Society of Nephrology vorgeschlagen wurde: eGFR (ml/min/1,73 m2)=1946 [Alter (Jahre)]20.287 6 [Serumkreatinin (mg perdl)]21.094 60.739 (für Frauen), was eine validierte lokale Modifikation von MDRD ist [ 10]. Die Serumkonzentrationen von Kreatinin wurden unter Verwendung eines enzymatischen Verfahrens gemessen.
Für die Immunhistochemie wurden 65 japanische Patienten analysiert, bei denen zwischen 2000 und 2011 eine Nierenbiopsie an der Abteilung für Medizin und klinische Wissenschaft des Universitätskrankenhauses Kyoto durchgeführt wurde. Durch Biopsie gesicherte Diagnosen aller Patienten in diesem Zeitraum sind in Tabelle S1 in Datei S1 aufgeführt. Die in dieser Arbeit untersuchten Probanden umfassten DN (n=19), ORG (n=10) und nicht adipöse, nicht diabetische Kontrollpersonen, bei denen MGA (n=19) oder diagnostiziert wurde MCNS (n=17). Einige Fälle in diesen Kategorien wurden ausgeschlossen, da die verfügbaren Restproben weniger als 10 Glomeruli enthielten. Die Definition von DN bestand aus (1) mehr als 5 Jahren Dauer nach Beginn des Diabetes, (2) Vorhandensein von Mikro- oder Makroalbuminurie, (3) kompatiblen histopathologischen Veränderungen mit DN, wie Verdickung der glomerulären Basalmembran, mesangiale Ausdehnung, knotig Sklerose (Kimmelstiel-Wilson-Knötchen) und/oder arterioläre Hyalinose und (4) Ausschluss anderer Ursachen für Nierenerkrankungen [11]. ORG wurde morphologisch als fokale segmentale Glomerulosklerose und/oder Glomerulomegalie bei Patienten mit beiden definiertFettleibigkeitund Proteinurie, deren Definitionen oben beschrieben wurden [12,13].
Für die mRNA-Expressionsanalyse wurden Proben von geringer Qualität ausgeschlossen, in denen die 18S-ribosomalen RNA (rRNA)-Spiegel unter der Nachweisempfindlichkeitsgrenze durch Echtzeit-RT-PCR lagen. Die aufgenommenen Probanden bestanden aus 22 Patienten mit Typ-2-Diabetes, die sich zwischen 2000 und 2010 einer Nierenbiopsie im Osaka City General Hospital unterzogen hatten, und 6 nicht-diabetischen Kontrollpersonen, die eine durch Biopsie nachgewiesene MGA hatten.
Die Tabellen 1 und 2 fassen die klinischen Ausgangscharakteristika der Patienten zusammen, die durch immunhistochemische bzw. Genexpressionsanalyse untersucht wurden. Für die Lichtmikroskopie wurden die Gewebeproben nach Standardverfahren verarbeitet. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin-Eosin, Perjodsäure-Schiff, Perjodsäure-Methenaminsilber oder Masson-Trichrom gefärbt (Abb. S1). Die Verhältnisse der Anzahl von Glomeruli mit globaler Sklerose zu den Gesamtglomeruli und den relativen Bereichen der tubulointerstitiellen Fibrose wurden unabhängig voneinander von zwei Pathologen bewertet, die die Diagnose und die klinischen Daten nicht kannten.
Wirkungen von Cistanche: Behandlung von Nierenerkrankungen
Definition der Nierenergebnisse
Die folgenden zwei prognostischen Indikatoren wurden durch lineare Regressions- bzw. logistische Regressionsanalysen untersucht: (1) das Ausmaß der Proteinurie, gemessen ein Jahr nach der Biopsie, und (2) renales Ereignis, definiert als jährlicher Anstieg des Serumkreatinins um 0,50 Prozent ab Baseline oder Beginn der chronischen Dialyse.
Immunhistochemie
Die Immunhistochemie von MRP8 und CD68 wurde unter Verwendung von durchgeführtNiereSchnitte (Dicke 4 mm), fixiert mit 4 Prozent gepuffertem Paraformaldehyd. Nach der Antigengewinnung durch Citratpuffer wurden Nierenschnitte mit 10 Prozent Ziegenserum inkubiert, gefolgt von Maus-Anti-Human-MRP8 (1:100; BMA Biomedicals, Augst, Schweiz)[14] oder Maus-Anti-Human-CD68-Antikörpern (1:50 ; DAKO, Ely, UK). Primäre Antikörper wurden mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem sekundärem Antikörper und 3,3--Diaminobenzidintetrahydrochlorid (Dako USA, Carpinteria, CA) sichtbar gemacht. Kerne wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. MRP8--positive Zellen wurden in mehr als 10 Glomeruli gezählt, und MRP8--positiver Bereich im Tubulointerstitium wurde quantitativ gemessen, um einen Durchschnitt für jede Person zu erhalten, wobei MetaMorph 7.5-Software (Molecular Devices, Downingtown, PA, USA) verwendet wurde ). Die Kolokalisierung von CD68-- und MRP8--positiven Zellen wurde mit Serienschnitten bewertet. Es gab weder ein MRP8- noch ein CD68-Signal in Negativkontrollen, die ohne ersten Antikörper gefärbt wurden (Abb. S2). Durch die Vorinkubation des Anti-MRP8-Antikörpers mit einem 20-molaren Überschuss an rekombinantem menschlichem MRP8-Protein (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) bei 4 uC über Nacht wurde die Färbung deutlich reduziert, wenn nicht sogar vollständig, was die Spezifität des Antikörpers weiter unterstützt (Abb. S3). .
Cistanche zur Behandlung der Niere
Auswertung der mRNA-Expression
GefrorenNiereDie Schnitte wurden in Glomeruli- und Nonglomerulus-Gewebe durch Laser-Capture-Mikrodissektion (LM200; Olympus, Tokio, Japan) wie zuvor beschrieben getrennt [15]. Die Gesamt-RNA wurde mit dem RNeasy-Mini-Kit (Qiagen, Tokio, Japan) extrahiert. Die mRNA-Expressionsniveaus wurden durch TaqMan-Echtzeit-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) bestimmt [16,17]. Die Expressionsniveaus aller Gene wurden durch 18S-rRNA-Niveaus (interne Kontrolle) normalisiert. Siehe Tabelle S2 in Datei S1 für Primer- und Sondensequenzen. Eukaryotische 18S-rRNA wurde mit vorentwickelten TaqMan-Assay-Reagenzien (Applied Biosystems) nachgewiesen.
Tabelle 1. Klinische Ausgangscharakteristika von Patienten bei einer Nierenbiopsie, die durch Immunhistochemie auf MRP8-Proteinexpression analysiert wurden.
MGA: geringfügige glomeruläre Anomalie, MCNS: nephrotisches Syndrom mit minimaler Veränderung, ORG:Fettleibigkeit-assoziierte Glomerulopathie, DN: diabetische Nephropathie, BMI: Body-Mass-Index, BUN: Blut-Harnstoff-Stickstoff, CRP: C-reaktives Protein. Daten sind Mittel 6 SD. *Gesamtunterschiede zwischen MGA-, MCNS-, ORG- und DN-Gruppen wurden von ANOVA.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t001 verglichen
MRP8-Behandlung von Makrophagen
Aus Knochenmark stammende Makrophagen wurden aus Wildtyp- oder TLR4-Knockout (KO)-Mäusen [18] mit genetischem C57BL/6J-Hintergrund (Oriental BioService, Kyoto, Japan) wie zuvor beschrieben erzeugt [6]. Kurz gesagt, nach der Lyse von roten Blutkörperchen wurden Knochenmarkszellen in einem Medium resuspendiert, das 20 % fötales Kälberserum und 50 ng/ml rekombinanten humanen Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) enthielt, und kultiviert bei 37uC in 5-prozentiger CO2-Atmosphäre. Am Tag 7 wurden Makrophagen mit rekombinantem Maus-MRP8 (Abnova, Taipei, Taiwan) oder Vehikel für 4 Stunden inkubiert. Polymyxin B (25 mg/ml, NacalaiTesque, Kyoto, Japan) wurde jeder Vertiefung zugesetzt, um die Kontamination mit Endotoxin wie zuvor beschrieben zu minimieren [3,19]. Noendotoxin wurde bei jeder getesteten MRP8-Konzentration nach der Inkubation mit 25 mg/ml Polymyxin B mit dem ToxinSensorChromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript, Piscataway, NJ, USA) nachgewiesen. Die Gesamt-RNA aus den Zellen wurde mit dem RNeasy MiniKit extrahiert, und die mRNA-Expressionsniveaus von Interleukin-1 beta (IL-1b), Tumornekrosefaktor-alpha (TNFa) und MRP8 wurden mit TaqMan in Echtzeit bestimmt RT-PCR. Die Expressionsniveaus aller Gene wurden durch Nagetier-GAPDH-Niveaus (interne Kontrolle, vorentwickelte TaqMan-Assay-Reagenzien) normalisiert. Primer- und Sondensequenzen für Echtzeit-PCR sind in Tabelle S2 in Datei S1 aufgeführt.
statistische Analyse
Die Daten werden ausgedrückt als Mittelwert 6 SD oder Mittelwert 695 Prozent Konfidenzintervall (KI), falls zutreffend. Für den Vergleich zwischen vier Gruppen wurde eine Einweg- oder Zweiweg-ANOVA mit Post-Hoc-Analyse von Bonferroni verwendet, und kategoriale Variablen wurden unter Verwendung des x2-Tests verglichen. Der ungepaarte t-Test des Schülers wurde gegebenenfalls zum Vergleich zwischen zwei Gruppen angewendet. Spearman-Korrelationskoeffizienten wurden geschätzt, um Assoziationen zwischen zwei Variablen zu bestimmen. Um die Wirkungen von Baseline-Kovariaten zu untersuchen, die das Ausmaß der glomerulären oder tubulointerstitiellen MRP8-Expression oder die Proteinspiegel im Urin ein Jahr nach der Biopsie bestimmen, wurden univariate und multivariate lineare Regressionsanalysen durchgeführt. Die logistische Regressionsanalyse wurde verwendet, um erklärende Variablen zu analysieren, die das Auftreten von Nierenereignissen vorhersagen. Alle Daten wurden mit der Software StatView 5.0 (SAS InstituteInc., Cary, NC, USA) analysiert. P-Werte, 0.05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.
Wirkungen von Cistanche: Behandlung von Nierenerkrankungen
Ergebnisse
Wir verglichen die MRP8-Proteinexpressionsniveaus imNiereunter DN-, ORG- und nicht-fettleibigen, nicht-diabetischen Kontrollgruppen (MGA und CNS). Die immunhistochemische Analyse ergab, dass sowohl die glomeruläre MRP8--positive Zellzahl (Abb. 1A) als auch der tubulointerstitielle MRP8--positive Bereich (Abb. 1B) in DN signifikant größer waren als in anderen Gruppen, einschließlich MGA, MCNS, und ORG (S<0.01). org="" subjects="" also="" showed="" a="" tendency="" of="" elevated="" mrp8expression="" compared="" to="" mga="" and="" mcns="" (fig.="" 1a,="" 1b).="" furthermore,="" glomerular="" mrp8="" mrna="" expression="" levels="" in="" dn="" subjects="" were="" significantly="" higher="" compared="" to="" non-dm="" control="" subjects="" (p,0.01,="" fig.="" 1c).="" in="" non-glomerulus="" tissues,="" mrp8mrna="" expression="" levels="" were="" much="" lower="" than="" those="" in="" glomeruli,="" both="" in="" non-dm="" and="" dm="" groups.="" abundant="" mrp8="" protein="" expression="" in="" the="" tubulointerstitium="" of="" dn="" cases="" was="" not="" clearly="" reflected="" into="" increased="" mrna="" expression,="" which="" may="" be="" partly="" caused="" by="" deposition="" of="" blood-derived="" proteins="" in="" the="" tubulointerstitium="" as="" discussed="" in="" the="" next="" section.="" as="" shown="" in="" representative="" photos="" (fig.="" 1d–g,="" see="" fig.="" s4="" in="" detail),="" renal="" biopsy="" samples="" from="" mga="" and="" mcns="" subjects="" showed="" few="" mrp8-positive="" cells="" in="" glomeruli="" (fig.="" 1d,="" 1e="" and="" fig.="" s4).="" in="" org="" subjects,="" somemrp8-positive="" cells="" appeared="" in="" glomeruli="" and="" tubulointerstitium(fig.="" 1f="" and="" fig.="" s4).="" in="" dn="" subjects,="" a="" marked="" increase="" of="" mrp8-expressing="" cells="" in="" glomeruli="" and="" significant="" expansion="" of="" mrp8-positive="" areas="" in="" the="" tubulointerstitium="" were="" observed="" in="" a="" focal="" manner="" (fig.="" 1g="" and="" fig.="" s4).="" of="" note,="" mrp8-positive="" cells="" were="" absent="" in="" nodular="" sclerosing="" lesions="" of="" diabetic="" glomeruli="" (fig.="" s4:dn="" case="" 2,="" 3)="" as="" described="" previously="" for="" sclerotic="" lesions="" in="" anca-associated="" glomerulonephritis="" [20].="" paired="" immunohistochemistry="" for="" cd68="" and="" mrp8="" in="" serial="" sections="" suggested="" thatmrp8="" signals="" were,="" at="" least="" in="" part,="" observed="" in="" macrophages="" expressing="" cd68="" (fig.="" 2),="" as="" we="" reported="" in="" a="" mouse="" model="" of="" diabetic="" nephropathy="" [6].="" besides,="" focally="" injured="" atrophic="" tubular="" epithelial="" cells="" also="" strongly="" expressed="" mrp8,="" which="" were="" surrounded="" by="" mrp8(+)-,="" cd68(+)-positive="" macrophages="" (fig.="" 2,="" fig="" s4:="" dn="" case="" 3-5).="" in="" the="" cases="" with="" nephrotic="" range="" proteinuria,="" mrp8="" staining="" was="" also="" observed="" along="" brush="" borders="" of="" proximal="" tubules="" both="" in="" mcns="" and="" dn="" cases="" (fig.="" s4).="" since="" the="" sample="" number="" of="" mrna="" expression="" was="" too="" small="" for="" multivariate="" analysis,="" the="" following="" analyses="" were="" performed="" using="" data="" from="" patients="" studied="" by="">
Tabelle 2. Klinische Ausgangswerte von Patienten bei Nierenbiopsie, die mittels Echtzeit-RT-PCR auf MRP8-mRNA-Expression analysiert wurden.
Die Assoziationen zwischenNiereMRP8-Signale und klinische Ausgangsparameter zum Zeitpunkt der Nierenbiopsie wurden querschnittlich analysiert (Tabelle 3). Durch univariate Analyse korrelierte die glomeruläre und/oder tubulointerstitielle MRP8-Proteinexpression signifikant mit Alter, systolischem und diastolischem Blutdruck, Urinprotein, Serumspiegeln von Kreatinin, BUN- und HDL-Cholesterin, eGFR und dem Ausmaß der globalen Glomerulosklerose und tubulointerstitiellen Fibrose. Diese Parameter wurden durch multivariate Analyse nach Ausschluss von diastolischem Blutdruck, eGFR und BUN aufgrund von Kollinearität weiter untersucht. Der Prozentsatz der tubulointerstitiellen Fibrose wurde unabhängig mit glomerulären MRP8-Signalen (b=0,62, angepasst P=0,02) und tubulointerstitiellen MRP8-Signalen (b=0,85, angepasst P ,0,001). Darüber hinaus wurden tubulointerstitielle MRP8-Signale auch unabhängig mit Baseline-Proteinurie korreliert (b=0.20, angepasstes P=0.01). Scattered-Plot-Analysen zwischen MRP8-Signalen in Glomeruli oder Tubulointerstitium und klinischen Parametern zeigten, dass MCNSgroup hatte ein von anderen Gruppen unterschiedliches Verteilungsmuster, insbesondere in Bezug auf die Protein- und Serum-LDL-Cholesterinspiegel im Urin (Abb. S5A–D, S6A–D). Der Ausschluss der MCNS-Gruppe verbesserte die Korrelation zwischen MRP8-Signalen und Protein- oder Serum-LDL-Cholesterinspiegeln im Urin (Abb. S5E–F, S6E–F). Daher führten wir eine Subanalyse ohne MCNS-Patienten durch und stellten fest, dass Protein im Urin ein unabhängiger Faktor war, der mit glomerulären MRP8-Signalen durch multivariate Analyse korrelierte (Tabelle 4; b=0.36, adjustierter P=0.03 ).
Als nächstes führten wir lineare Regressions- oder logistische Regressionsanalysen durch, um erklärende Faktoren zu identifizieren, die die Nierenergebnisse vorhersagen, nämlich das Ausmaß der Proteinurie ein Jahr später und das Nierenereignis innerhalb eines Jahres. Da eine gute Assoziation zwischen glomerulären und tubulointerstitiellen MRP8-Signalen bestand (Abb. S7; R=0.67,P,0.001), wurden diese Parameter alternativ in weitere Analysen aufgenommen . Wir bewerteten den Zusammenhang zwischen Baseline-Parametern und Protein im Urin 1 Jahr nach der Nierenbiopsie durch multiple Regressionsanalyse. Wie in Tabelle 5 gezeigt, war das glomeruläre MRP8-Signal (b=0,59, angepasstes P, 0,001) ein prädiktiver Faktor für das Ausmaß der Proteinurie ein Jahr später sowie für den systolischen Ausgangsblutdruck (b {{13} }.21, angepasster P=0.04) und Baseline-Proteinurie (b=0.37, angepasster P=0.002) waren. Diese Parameter waren unabhängig von anderen bekannten Risikofaktoren für diabetische Nephropathie, einschließlich Nierenfunktionsstörung (Serumkreatinin) und Ausmaß der globalen Sklerose und tubulointerstitiellen Fibrose [11,21–24]. Andererseits war das tubulointerstitielle MRP8-Signal (b=0.34, angepasstes P=0.09) kein unabhängiger prädiktiver Faktor für die Proteinspiegel im Urin ein Jahr später. Nierenereignisse traten bei 7 Patienten (6 bei DN und 1 bei ORG-Fällen) innerhalb eines Jahres nach der Nierenbiopsie auf. Bei der univariaten Analyse waren nicht nur das Ausmaß der Glomerulosklerose und tubulointerstitiellen Fibrose und der glomerulären und tubulointerstitiellen MRP8-Signale, sondern auch der Blutdruck, die Nierenfunktionsstörung und die Proteinspiegel im Urin zu Studienbeginn signifikante prädiktive Faktoren für das Auftreten renaler Ereignisse. Bei der multivariaten Analyse wurden ihre Kovariaten jedoch gegenseitig aufgehoben (Tabelle S3 in Datei S1), wahrscheinlich aufgrund hoher Korrelationen zwischen diesen Parametern.
Schließlich untersuchten wir die Wirksamkeit von MRP8 als endogener Ligand für TLR4 unter Verwendung von kultivierten Makrophagen. In aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen von Wildtyp-Mäusen induzierte das MRP8-Protein eine Hochregulierung von proinflammatorischen Zytokin-Genen wie IL-1b und TNFa und löste auch eine Autoinduktion von MRP8 dosisabhängig zwischen 1{{ 15}}–1000 ng/ml. Diese Wirkungen von MRP8 wurden in Makrophagen, die von TLR4-KO-Mäusen (P, 0,01) erhalten wurden, ungefähr um zwei Drittel unterdrückt ( 3 ).
Abbildung 1. Immunhistochemische und mRNA-Analysen für MRP8 inNiereBiopsieproben. Quantifizierung der glomerulären MRP{{0}}-positiven Zellzahl (A) und des tubulointerstitiellen MRP8--positiven Bereichs (B). mRNA-Expression von MRP8 in glomerulären und nicht-glomerulären Fraktionen (C). Offene Balken: nicht adipöse, nicht diabetische Kontrollen, die MGA oder MCNS sind, geschlossene Balken: ORG oder DN (A–C). Repräsentative Bilder von MGA-, MCNS-, ORG- und DN-Gruppen (D–G). MGA: geringfügige glomeruläre Anomalie, MCNS: nephrotisches Syndrom mit minimaler Veränderung, ORG: Adipositas-assoziierte Glomerulopathie, DN: diabetische Nephropathie. *P,0.01.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g001
Diskussion
Die vorliegende Studie hat gezeigt, dass MRP8 in den Glomeruli und im Tubulointerstitium von Patienten mit DNas im Vergleich zu ORG und nicht adipösen, nicht diabetischen Kontrollen (MGA und MCNS) reichlich exprimiert wird. Darüber hinaus waren die MRP8-Expressionsniveaus bei ORG-Subjekten tendenziell höher als bei MGA- oder MCNS-Subjekten. In einer univariaten linearen Regressionsanalyse durchgeführten Querschnittsuntersuchung aller Probanden korrelierten sowohl die glomeruläre MRP8--positive Zellzahl als auch der tubulointerstitielle MRP8--positive Bereich nicht nur mit verschiedenen bekannten Risikofaktoren für diabetische Nephropathie (wie systolischer Blutdruck, Proteinurie und Serumkreatinin), aber auch mit dem Ausmaß von Glomerulosklerose und tubulointerstitieller Fibrose. Durch multivariate Analyse korrelierte der tubulointerstitielle MRP8--positive Bereich signifikant mit Proteinurie und tubulointerstitieller Fibrose. Die glomeruläre MRP8--positive Zellzahl korrelierte signifikant mit tubulointerstitieller Fibrose in der Primäranalyse und mit Proteinurie in einer Subanalyse ohne MCNS-Gruppe. Die Immunhistochemie zeigte, dass MRP8 zumindest teilweise von CD68(plus)-exprimierenden Makrophagen und atrophischen Tubuli exprimiert wurde. Diese Ergebnisse lassen die Möglichkeit aufkommen, dassNiereMRP8-Signale in Glomeruli oder Tubulointerstitium können als neue Marker für diabetische Nephropathie dienen.
Abbildung 2. Lokalisierung der CD68- und MRP8-Proteinexpression in Serienschnitten von Fällen mit diabetischer Nephropathie. Expression von CD68 (A, B) und MRP8-Expression (C, D) in gepaarten Nierenproben (A und C oder B und D). Pfeile zeigen die Kolokalisation von CD68- und MRP8-Signalen an.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g002
In der prognostischen Studie ergab eine multivariate Analyse, dass die Proteinspiegel im Urin ein Jahr nach der Nierenbiopsie unabhängig mit der glomerulären MRP8--positiven Zellzahl, dem Protein im Urin und dem systolischen Blutdruck zu Studienbeginn assoziiert waren. Bemerkenswerterweise zeigte die glomeruläre MRP8-Expression die stärkste Korrelation mit Urinprotein ein Jahr später (b= 0.87), sogar stärker als das Ausgangs-Urinprotein (b= 0.78), laut univariater Analyse. Dies liegt zum Teil daran, dass die glomeruläre MRP8-Expression bei „gutartigen“ Formen der Proteinurie, wie sie bei MCNS-Patienten beobachtet werden, nicht stark erhöht ist, deren Proteinurie bei der Diagnose durch Nierenbiopsie extrem hoch ist, aber normalerweise innerhalb eines Jahres nach Beginn der immunsuppressiven Therapie abgeklungen ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die glomeruläre MRP8-Expression eine einzigartige prädiktive Natur als Krankheitsmarker besitzen kann, die nicht durch Proteinurie zu Studienbeginn oder routinemäßige pathologische Analyse zur Bewertung der globalen Glomerulosklerose und tubulointerstitiellen Fibrose ersetzt werden kann. Darüber hinaus spekulieren wir, dass die glomeruläre MRP8-Expression kein einfacher Marker oder Zuschauer ist, sondern ein aktiver Akteur bei glomerulärer Verletzung, wie unten diskutiert.
Das Bestimmtheitsmaß (R2), das mit erklärenden Parametern berechnet wurde, die in die multiple Regressionsanalyse aufgenommen wurden, war 0.52* bzw. 0.74#. y, Jahre; BP, Blutdruck; gCr, g Kreatinin; T-chol, Gesamtcholesterin; HDL-Chol, HDL-Cholesterin; LDL-chol, LDL-Cholesterin; GS, Glomerulosklerose; TI, tubulointerstitial.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t003
Tabelle 4. Subanalyse der Beziehung zwischen klinischen Ausgangsparametern und MRP8-Signalen nach Ausschluss der MCNS-Gruppe.
Tabelle 5. Multiple Regressionsanalyse zur Identifizierung von Faktoren, die die Proteinspiegel im Urin 1 Jahr nach der Nierenbiopsie vorhersagen
Abbildung 3. Wirkungen von MRP8 auf aus Knochenmark stammende Makrophagen. Vom Knochenmark stammende Makrophagen (BMDM) wurden mit rekombinantem Maus-MRP8 für 4 Stunden stimuliert. Fehlerbalken zeigen ein 95-Prozent-KI an, und statistische Analysen wurden mit logarithmisch transformierten Werten durchgeführt. Die Zweiweg-ANOVA zeigte signifikante Wirkungen von Genotypen, MRP8-Konzentrationen und deren Wechselwirkungen für die Expression aller 3 Gene (P,0.001 für alle Vergleiche). n=4. WT, Wildtyp; K.o., KO; IL-1b, Interleukin 1 beta; TNFa, Tumornekrosefaktor-alpha. *P,0.01 unter verschiedenen Konzentrationen, #P,0.01 unter Genotypen.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g003
In einem weiteren Versuch einer Längsschnittstudie konnte die logistische Regressionsanalyse keine unabhängigen Prädiktoren für das Auftreten eines renalen Ereignisses innerhalb eines Jahres finden. Wir spekulieren, dass dies teilweise darauf zurückzuführen ist, dass die tubulointerstitielle MRP8-Expression und die tubulointerstitielle Fibrose zwei potente Prädiktoren für renale Ereignisse in der univariaten Analyse waren, ihre Bedeutungen sich jedoch in der multivariaten Analyse gegenseitig aufhoben. Diese beiden Parameter zeigten eine starke Korrelation (R=0.68, P, 0.001) (Abb. S8), was darauf hindeutet, dass diese beiden Parameter der Vorhersage von Nierenereignissen entsprechen könnten. Tatsächlich zeigte die interstitielle MRP8-Expression ein ziemlich ähnliches Muster wie die interstitielle Fibrose, die durch Masson-Trichrom-Färbung bewertet wurde. Die Menge an interstitiellem MRP8 hängt weitgehend von den positiven Signalen in atrophischen Tubuli ab und nicht von denen in Makrophagen, deren Merkmal sich von dem von glomerulärem MRP8 in einer punktförmigen Verteilung unterscheidet. Darüber hinaus könnten eine kleine Stichprobengröße, ein kurzer Beobachtungszeitraum und wenige Probanden, die Nierenereignisse entwickelten, die Erkennungsleistung verringert haben. Da die MRP8-Expression in tubulären Epithelzellen eine ursächliche Rolle beim Fortschreiten der tubulointerstitiellen Entzündung in einem Mausmodell der Nierenfibrose spielt[7], sind weitere Analysen erforderlich, um die Rolle des tubulointerstitiellen MRP8 bei DN zu klären.
In Übereinstimmung mit unserer früheren Studie [6] wurde MRP8-mRNA hauptsächlich in der glomerulären Fraktion von humanen DN-Probanden im Vergleich zu Kontrollpersonen mit MGA hochreguliert. Andererseits wurde die MRP8-Proteinexpression nicht nur im Glomerulus, sondern auch im Tubulointerstitium beobachtet. In diesem Zusammenhang sollte beachtet werden, dass es zwei unterschiedliche Muster der MRP8-Färbung im Tubulointerstitium von DN gab. Einer war eine intensive und fokale Färbung in stark atrophischen Tubuli. Die andere war eine leichte Färbung, die entlang des Bürstensaums der proximalen Tubuli verteilt war, was auch bei ORG und MCNS gefunden wurde. Die letztgenannten Signale stellen wahrscheinlich MRP8-Protein dar, das aus dem Blut stammt und durch proximale Tubuli reabsorbiert wird, was nicht von einer erhöhten MRP8-mRNA-Expression begleitet sein sollte. In Bezug auf andere Proteine als MRP8 haben wir und andere kürzlich über ähnliche Phänomene des Nachweises von immunreaktiven Proteinen in den proximalen Tubuli berichtet, die durch Reabsorption, aber nicht durch renale Synthese verursacht werden [25,26]. Da andererseits eine geringe MRP8-Färbung im Antikörperabsorptionstest zurückblieb, insbesondere in glomerulären exsudativen Läsionen und stark vernarbten, fibrotischen Läsionen um atrophische Tubuli, kann das Vorhandensein unspezifischer Signale nicht vollständig negiert werden (Abb. S3).
Glomeruläre MRP8-Signale zeigten bei DN-Patienten hauptsächlich punktuelle Muster (Abb. 1, Abb. S4). Da sowohl CD68 als auch MRP8 durch monoklonale Maus-Antikörper nachgewiesen wurden, wurde die Lokalisierung dieser Moleküle durch serielle Schnitte und nicht durch doppelte Immunfärbung bewertet. Die Färbemuster von MRP8 waren kompatibel mit denen bei anderen entzündlichen Nierenerkrankungen, einschließlich IgAnephritis [27], membranoproliferativer Glomerulonephritis [14] und ANCA-assoziierter Glomerulonephritis [20], bei denen Makrophagen als Hauptquelle von MRP8 vorgeschlagen wurden, wie wir in berichteten ein Nagetiermodell [6]. Darüber hinaus könnten Neutrophile als eine weitere Quelle von MRP8 betrachtet werden, die vaskuläre Komplikationen beeinflusst [28]. Derzeit untersuchen wir den molekularen Mechanismus, warum MRP8 vorwiegend in Zellen myeloider Abstammung hochreguliert wird, die Glomeruli infiltrieren. Eine In-vitro-Studie ergab, dass MRP8 die entzündliche Zytokinexpression induzierte und auch die Expression von MRP8 selbst in Makrophagen in TLR4--abhängiger Weise potenzierte. Darüber hinaus fehlten MRP8--positive Zellen in knotigen sklerosierenden Läsionen, was darauf hindeutet, dass glomeruläres MRP8 eine anhaltende glomeruläre Schädigung widerspiegeln könnte [20]. Wichtig ist, dass eine groß angelegte Humanstudie berichtete, dass die MRP8-Genexpression in mononukleären Blutzellen von Typ-1-Diabetikern bei Patienten mit diabetischen Komplikationen, einschließlich Nephropathie, signifikant erhöht ist [29].
Da die Hemmung des Renin-Angiotensin-Systems (RAS) eine wichtige Determinante der renalen Ergebnisse ist, untersuchten wir die Auswirkungen einer RAS-Blockade aufNiereMRP8-Ausdruck. Wir fanden keinen signifikanten Unterschied in der Nieren-MRP8-mRNA-Expression zwischen DN-Patienten, die mit oder ohne RAS-Blockade behandelt wurden (Abb. S9), wahrscheinlich weil Fälle, die mit RAS-Blockade behandelt wurden, zu schwererem Bluthochdruck und Proteinurie neigten als Fälle ohne RAS-Blockade
Bei fettleibigen Menschen und Mäusen kann ein erhöhter MRP8/14-Komplex im Plasma ein gewisses Maß an Spiegelung widerspiegelnFettleibigkeitund stammen sowohl von Adipozyten als auch von Leukozyten [8,9]. Unsere ORG-Fälle wiesen eine leichte Färbung von MRP8 in den proximalen Tubuli auf, was auf erhöhte Plasmaspiegel von MRP8 hindeutet. Im Gegensatz dazu gab es keine signifikante Korrelation zwischen der tubulointerstitiellen MRP8-Expression und dem Body-Mass-Index (Abb. S6G). Daher lokale MRP8-Expression in derNierekann eher als Marker für eine Nierenschädigung dienen als fürFettleibigkeit[8,9].
Cistanche zur Verbesserung der Nierenfunktionsstörung
Unsere Studie hat mehrere Einschränkungen. Die Probenzahl jeder untersuchten Gruppe war gering. Nicht identische Probanden wurden in die mRNA- und immunhistochemischen Analysen aufgenommen. Da wir nur Patienten analysiert haben, die sich einer Nierenbiopsie unterzogen haben, spiegelt die Zusammensetzung der hier untersuchten Patienten möglicherweise nicht die allgemeine Typ-2-Diabetiker oder allgemein chronische Patienten widerNiereKrankheitsthemen. Obwohl das Alter in unseren Daten nicht als unabhängiger Faktor im Zusammenhang mit MRP8-Signalen beibehalten wurde (Tabelle 3), ist bekannt, dass Alterung mit chronischer Entzündung einhergeht [30]. Die Auswirkungen des Alters können nicht vollständig vernachlässigt werden. Obwohl die meisten MRP8-Signale im Antikörper-Absorptionstest verloren gingen, blieben einige positive Signale zurück, die möglicherweise durch die unspezifische Bindung des ersten Antikörpers verursacht wurden. Wie oben diskutiert, hilft uns die Untersuchung der renalen MRP8-Expression durch Nierenbiopsie, die Pathophysiologie und Prognose chronischer Nierenerkrankungen zu verstehen, insbesondere im Zusammenhang mitFettleibigkeitund Diabetes, hat aber einen Nachteil für den routinemäßigen und wiederholten Einsatz in Ambulanzen
Zusammenfassend legt die vorliegende Studie nahe, dass die Expression von MRP8 in derNierespiegelt den aktuellen pathologischen Status wider und prognostiziert auch Nierenergebnisse bei Patienten mitFettleibigkeitoderTyp 2 Diabetes. Weitere Untersuchungen zur Untersuchung der MRP8-Spiegel im Urin bei adipösen oder diabetischen Patienten in großem Maßstab können gerechtfertigt sein
zusätzliche Informationen
Abbildung S1 Repräsentative Fotos, die Nierenbiopsieschnitte eines DN-Patienten zeigen, die mit (A) Perjodsäure-Schiff, (B) Perjodsäure-Methenaminsilber oder (C) Masson-Trichrom gefärbt wurden. Das Verhältnis der Anzahl der Glomeruli mit globaler Sklerose (Pfeile) zu der Gesamtzahl der Glomeruli und der relativen Fläche der tubulointerstitiellen Fibrose betrug bei diesem Patienten 33 Prozent bzw. 65 Prozent. (TIFF)
Abbildung S2 Immunhistochemie für MRP8- und CD68-Proteine bei DN-Patienten. Fotos in der rechten Spalte zeigen Negativkontrollexperimente ohne 1. Antikörper. (TIF)
Abbildung S3 Antikörper-Absorptionstest für MRP8-Färbung. PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung, rhMRP8: rekombinantes humanes MRP8. (TIF)
Abbildung S4 Repräsentative Fotos der MRP8-Expression in MGA-, MCNS-, ORG- und DN-Gruppen. (TIF)
Abbildung S5 Korrelation zwischen glomerulärer MRP8--positiver Zellzahl und klinischen Parametern. Die logarithmisch transformierten Werte von MRP8-Signalen wurden verwendet. Die Korrelationen wurden mit allen 4 Gruppen (A–D, G) oder 3 Gruppen ohne die MCNS-Gruppe (E, F) analysiert. Offene Kreise: geringfügige glomeruläre Anomalien (MGA), geschlossene Kreise: nephrotisches Syndrom mit minimaler Veränderung (MCNS), offene Dreiecke:Fettleibigkeit-assoziierte Glomerulopathie (ORG), geschlossene Dreiecke: diabetische Nephropathie (DN).(TIF)
Abbildung S6 Korrelation zwischen dem tubulointerstitiellen MRP8--positiven Bereich und klinischen Parametern. Die logarithmisch transformierten Werte von MRP8-Signalen wurden verwendet. Diese Korrelationen wurden mit allen 4 Gruppen (A–D, G) oder 3 Gruppen mit Ausnahme der MCNS-Gruppe (E, F) analysiert. (TIF)
Abbildung S7 Korrelation zwischen glomerulärer und tubulointerstitieller MRP8-Expression. Es wurden die logarithmisch transformierten Werte von MRP8-Signalen verwendet. (TIF)
Abbildung S8 Korrelation zwischen tubulointerstitieller MRP8--positiver Fläche und tubulointerstitieller Fibrose. Es wurden die logarithmisch transformierten Werte von MRP8-Signalen verwendet. (TIF)
Abbildung S9 Renale mRNA-Expression von MRP8 bei DN-Patienten mit oder ohne Renin-Angiotensin-Blockade. NS: nicht signifikant. n=15 (Ja), 6 (Nein). Unter 22 DN-Fällen waren bei einem Patienten keine Informationen zur Medikation verfügbar. (TIF)
Datei S1 Stütztabellen.
Tabelle S1, Pathologische Diagnosen aller Fälle, die sich zwischen 2000 und 2011 einer Nierenbiopsie am Department of Medicine and Clinical Science, Kyoto University Hospital unterzogen haben. Tabelle S2, Primer- und Sondensequenzen für TaqMan-Echtzeit-RT-PCR. Tabelle S3, Logistische Regressionsanalyse für das Auftreten eines Nierenereignisses innerhalb eines Jahres. (DOC) Danksagungen Wir danken S. Tanaka für statistische Beratung, Y. Ogawa, N. Igarashi und C. Kimura für technische Unterstützung sowie A. Yamamoto und SOgino für Sekretariatsunterstützung. Autorenbeiträge Konzipierte und gestaltete die Experimente: TK KM MK HY MI AN KNMM. Führte die Experimente durch: TK HI AI KK TM YK MI AN. Analysierte die Daten: TK KM MK HY AS SY KU KN MM. Beigesteuerte Reagenzien/Materialien/Analysewerkzeuge: TK KM. Schrieb die Arbeit: TK KMMM.
Wirkungen von Cistanche: Behandlung von Nierenerkrankungen
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Herausgeber: Utpal Sen, University of Louisville, Vereinigte Staaten von Amerika
Erhalten am 11. September 2013; Akzeptiert am 14. Januar 2014; Veröffentlicht am 18. Februar 2014
Urheberrecht: 2014 Kuwabara et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License verbreitet wird, die die uneingeschränkte Nutzung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und die Quelle werden genannt.
Finanzierung: Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Grant-in-Aid for Diabetic Nephropathy and Nephrosclerosis Research des japanischen Ministeriums für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt (an KM), Forschungsstipendien des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technology (an TK, KM und MM), von der Japan Foundation for Applied Enzymology (an TK) und von der Smoking Research Foundation (an MM). Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.
Interessenkonflikte: Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
* E-Mail: keyem@kuhp.kyoto-u.ac.jp
