Präparative Isolierung und Reinigung von vier Verbindungen aus Cistanches Deserticola YC Ma durch Hochgeschwindigkeits-Gegenstromchromatographie

1. Einleitung

Cistanches deserticolaYC Ma, eine Art vonCistanchendas gehört zumOrobanchaceaeFamilie, ist eine bekannte traditionelle chinesische Medizin zur Behandlung von Nierenversagen, weiblicher Unfruchtbarkeit, krankhafter Leukorrhoe, Neurapraxie und seniler Verstopfung [1]. Es handelt sich um eine parasitäre Pflanze, die im Nordwesten Chinas weit verbreitet ist. Bisher wurden mehrere Verbindungen, darunterPhenylethanoidglykoside (PhGs), Iridoide und Lignane wurden aus dieser Art isoliert [2]. Es wurde berichtet, dass einige der PhGs antioxidative, hepatoprotektive und neuroprotektive Aktivitäten besitzen [3–6]. Allerdings ist die Isolierung und Reinigung von PhGs schwierig und zeitaufwändig. Darüber hinaus verbrauchen die klassischen Methoden der Mehrfachchromatographie nicht nur große Mengen organischer Lösungsmittel, sondern führen auch zu einer geringeren Probenausbeute. Die Hochgeschwindigkeits-Gegenstromchromatographie (HSCCC), eine trägerlose Flüssig-Flüssig-Verteilungschromatographietechnik, bietet im Vergleich zu einigen herkömmlichen Methoden eine hervorragende Probenrückgewinnung und wird häufig zur Trennung und Reinigung verschiedener Naturstoffe eingesetzt [7–9] . Obwohl mehrere PhGs gereinigt wurdenCistanchenGattung und andere von HSCCC [10–14], kein Artikel hat über die Reinigung von Acteosid, Isoacteosid, Syringalid A 3'- berichtet -L-Rhamnopyranosid und 2'-Acetylacteosid in einem zweiphasigen System.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VERBESSERUNG DER SEXUELLEN FUNKTION PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

In diesem Artikel berichten wir über eine einfache Methode zur Trennung und Reinigung von vier PhGs aus C. deserticola. Schließlich wurden in einer einstufigen Trennung 30,9 mg Acteosid, 13,0 mg Isoacteosid, 12,5 mg Syringalid A 3'- -L-Rhamnopyranosid und 7,2 mg 2'-Acetylacteosid erhalten aus 297 mg Fraktion mit Reinheiten von 99 %, 95 %, 99 % bzw. 98 %. Ihre Strukturen wurden anhand von 1 H- und 13C-NMR-Spektraldaten und HR-MS-Spektren charakterisiert. Die Strukturen der vier in dieser Untersuchung identifizierten PhGs sind in Abbildung 1 dargestellt.

2. Ergebnisse und Diskussion

2.1. HPLC-Analyse des Rohextrakts

Die mit Bestandteilen angereicherte Fraktion des n-Butanol-Extrakts aus C. deserticola wurde mittels HPLC-UV analysiert. Die verwendete Säule war eine Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, Innendurchmesser 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, Stadt, Landesabkürzung, USA), die mobile Phase war Methanol-Wasser (30:70, Vol./Vol.). Die Flussrate betrug 1 ml/min. Die Detektorwellenlänge wurde auf 254 nm eingestellt. Das HPLC-Chromatogramm ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Peaks 1 bis 4 entsprechen Acteosid (1), Isoacteosid (2), Syringalid A 3'- -L-Rhamnopyranosid (3) bzw. 2'-Acetylacteosid (4). .

2.2. Auswahl des zweiphasigen Lösungsmittelsystems

Eine erfolgreiche Trennung durch HSCCC hängt weitgehend von der Auswahl eines geeigneten zweiphasigen Lösungsmittelsystems ab. Das zweiphasige Lösungsmittelsystem wurde entsprechend den Verteilungskoeffizientenwerten (K) jeder Zielkomponente ausgewählt und ein optimaler K-Bereich sollte zwischen {{ 2}}.5 bis 2.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VERBESSERUNG DER IMMUNITÄT PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Im Experiment sind die K-Werte für Zielkomponenten mehrerer zweiphasiger Lösungsmittelsysteme in Tabelle 1 aufgeführt (obwohl die Ergebnisse für Peak 4 etwas höher waren, erwiesen sie sich als akzeptabel). Unter diesen ergab Ethylacetat-n-Butanol-Ethanol-Wasser (40:6:6:50, v/v/v/v) geeignete Verteilungskoeffizienten für die Zielverbindungen. Schließlich wurde das Lösungsmittelsystem bestehend aus Ethylacetat-n-Butanol-Ethanol-Wasser (40:6:6:50, v/v/v/v) verwendet, um vier Verbindungen von C. deserticola zu isolieren und zu reinigen, wie in gezeigt Abbildung 3. Wie in Abbildung 2 gezeigt, ergab die HPLC-Analyse jeder HSCCC-Fraktion, dass vier reine PhGs (Acteosid, 99 %; Isoacteosid, 95 %; Syringalid A 3′- -L-Rhamnopyranosid 99 % und 2′- Aus der Rohfraktion konnte Acetylacteosid 98 % gewonnen werden.

3. Experimentell

3.1. Apparatur Das HSCCC

Bei der in der vorliegenden Studie verwendeten Ausrüstung handelte es sich um ein TBE{{0}}B-Hochgeschwindigkeits-Gegenstromchromatographiesystem (Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, China) mit drei in Reihe geschalteten präparativen Mehrschicht-Coil-Trennsäulen (Durchmesser: Röhrchen=2,6 mm, Gesamtvolumen=300 ml) und eine 2{{10}} ml-Probenschleife. Der Umlaufradius oder der Abstand zwischen der Halterachse und der Mittelachse der Zentrifuge (R) betrug 5 cm, und der Wert variierte von 0,5 am inneren Anschluss bis 0,8 am äußeren Anschluss (=r/R, wobei r ist der Abstand von der Spule zum Halterschaft). Zur Temperaturregelung im Experiment wurde ein HX 105-Konstanttemperatur-Umwälzgerät (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Peking, China) verwendet. Das HSCCC-System war mit einer Mitteldruck-Konstantflusspumpe Modell TBP-5002, einem bei 254 nm arbeitenden UV-Detektor Modell TBP-2000 und einer Workstation Modell V4.0 (Jinda Bio-chemistry Instrument) ausgestattet Unternehmen, Shanghai, China).

Bei der verwendeten Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Ausrüstung handelte es sich um ein Agilent 1200-System, das aus einer G1312A-Binärpumpe, einem G1329A-Autosampler, einem G1314A-Detektor mit variabler Wellenlänge (VWD), einem G1316A-Thermostat-Säulenkompartiment, einem G1379B-Entgaser und einer Agilent LC-Workstation besteht . Zur Detektion der Reinheiten wurde ein alltech 3300 ELSD eingesetzt. Agilent 6520 Q-TOF und Bruker AVANCE III 500-NMR-Spektrometer wurden zur strukturellen Identifizierung der Verbindungen verwendet. 1 H- und 13C-NMR-Spektren (bei 500 bzw. 125 MHz) wurden bei Raumtemperatur (22 Grad /295,1 K) gemessen.

3.2. Reagenzien und Materialien

Ethylacetat, n-Butanol und Ethanol hatten Analysequalität und Methanol hatte HPLC-Qualität. Alle Lösungsmittel wurden von Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, China) gekauft. Für alle Lösungen und Verdünnungen wurde Milli-Q-Wasser (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA) verwendet. Das Rhizom von C. deserticola wurde im Juni 2009 in der Provinz Innere Mongolei, Volksrepublik China, gesammelt. Die Pflanze wurde von Prof. Lijuan Zhang identifiziert und ein Belegexemplar (Nr. 20091001) wurde in unserem Labor hinterlegt.

3.3. Vorbereitung der Rohprobe

Pulverisierte luftgetrocknete fleischige Stängel von C. deserticola (1 kg) wurden zweimal mit wässrigem Ethanol (8 l, 60 % v/v) jeweils 2 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur von 60 Grad eingedampft, bis das Ethanol vollständig verdampft war. Der Rückstand wurde in Wasser suspendiert und nacheinander dreimal mit Chloroform, Ethylacetat und n-Butanol extrahiert, was nach Eindampfen zur Trockene unter vermindertem Druck 5,16 g n-Butanol-Extrakt ergab. Der n-Butansäureextrakt wurde dann auf einer Kieselgelsäule (200–300 Mesh) unter Verwendung einer progressiven Gradientenelution (CHCl3–MeOH, 10:1→1:1) aufgetrennt, um acht Fraktionen zu ergeben. Fraktion 6 (297 mg) wurde zur weiteren HSCCC-Isolierung und -Trennung verwendet.

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3.4. Auswahl der Zweiphasen-Lösungsmittelsysteme

Die zweiphasigen Lösungsmittelsysteme wurden entsprechend dem Verteilungskoeffizienten (K) der Zielkomponenten in der Fraktion von C. deserticola ausgewählt. Die K-Werte wurden durch LC-Analyse wie folgt bestimmt: Eine geeignete Menge Rohextraktpulver (Fraktion 6) wurde in der unteren Phase des Lösungsmittelsystems gelöst und durch HPLC analysiert. Die Flächen der Gipfel wurden als A1 aufgezeichnet. Dann wurde der Lösung das gleiche Volumen der oberen Phase zugesetzt und gründlich gemischt, um ein Verteilungsgleichgewicht zu erreichen. Die untere Phase wurde dann erneut per HPLC analysiert. Die letztgenannten Spitzenbereiche wurden als A2 erfasst. Die K-Werte wurden nach folgender Gleichung berechnet: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Vorbereitung eines Zweiphasen-Lösungsmittelsystems und einer Probenlösung

In der vorliegenden Studie wurde das zweiphasige Lösungsmittelsystem bestehend aus Ethylacetat-n-Butanol-Ethanol-Wasser (40:6:6:50, v/v/v/v) für die HSCCC-Trennung verwendet. Jedes Lösungsmittel wurde in einen Scheidetrichter gegeben und gründlich bei Raumtemperatur äquilibriert. Die Oberphase und die Unterphase wurden kurz vor der Verwendung durch 30-minütige Ultraschallbehandlung getrennt und entgast. Die Probenlösung wurde durch Auflösen von 297 mg Fraktion 6 in 15 ml der unteren Phase aus Ethylacetat-n-Butanol-Ethanol-Wasser (40:6:6:50, Vol./Vol./Vol.) hergestellt.

3.6. HSCCC-Trennungsverfahren

HSCCC wurde wie folgt durchgeführt. Die mehrschichtige Wendelsäule wurde zunächst mit der oberen organischen stationären Phase gefüllt. Die untere wässrige mobile Phase wurde dann mit einer Flussrate von 1,5 ml/min in das Kopfende der Säule gepumpt und gleichzeitig wurde die HSCCC-Apparatur mit einer Drehzahl von 900 U/min betrieben. Nachdem das hydrodynamische Gleichgewicht hergestellt war, was durch eine klare mobile Phase angezeigt wurde, die am Schwanzauslass eluierte (etwa zwei Stunden später), wurde eine 15 ml Probenlösung mit 297 mg des Rohextrakts (Fraktion 6) durch das Injektionsventil injiziert. Der Ausfluss der Säule wurde kontinuierlich bei 254 nm überwacht. Vier Peakfraktionen wurden gemäß Chromatogramm gesammelt und dann unter vermindertem Druck eingedampft. Die Temperatur der Apparatur wurde auf 25 Grad eingestellt.

3.7. HPLC-Analyse und Identifizierung von HSCCC-Peakfraktionen

Die Peakfraktionen von HSCCC wurden mittels HPLC-ELSD analysiert. Die verwendete Säule war eine Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, Innendurchmesser 5 μm) und die mobile Phase war Methanol-Wasser (30:70, v/v). Die Flussrate betrug 1 ml/min. ELSD wurde unter den folgenden Bedingungen betrieben: Temperatur 45 Grad, Gas 1,6 l/min. Die Strukturidentifizierung der vier HSCCC-Peakfraktionen erfolgte mittels HR-ESI-MS, 1 H- und 13C-NMR-Spektroskopie.

3.8. Die Strukturidentifikation

Fraktion I: HR-ESI-MS beobachtet bei m/z 623,2001 (M−H)−, berechnet für C29H35O15, 623,1981. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 von Rhamnose), 2,79 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 von Glucose), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34 }} von Rhamnose), 6,27 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,1 (6H, aromatisches H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,6 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf{{89 }}), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 114,8 (Caf- ), 148,1 (Caf- ), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc-4 ), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha-6). Verglichen mit den Angaben in der Literatur [17] entsprach Fraktion I Acteosid.

Fraktion II: HR-ESI-MS beobachtet bei m/z 623,1987 (M−H)−, berechnet für C29H35O15, 623,1981. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,25 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 von Rhamnose), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H{29}} von Glucose), 5,17 (1H, d, J { {33}} Hz, H-1 von Rhamnose), 6,28 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, aromatisches H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,7 (C- ), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89 }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf- ), 115,0 (Caf- ), 147,3 (Caf- ), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). Die 1 H-NMR- und 13C-NMR-Spektraldaten stimmten mit denen von Isoacteosid überein, wie in der Literatur berichtet [18].

Fraktion III: HR-ESI-MS beobachtet bei m/z 6{{108}}7,2032 (M−H)−, berechnet für C29H35O14, 607,2032. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 von Rhamnose), 2,84 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H{29}} von Glucose), 5,19 (1H, d, J=1,5 Hz, H{ {35}} von Rhamnose), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6,6–7,1 (7H, aromatisches H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4 ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C- ), 36,4 (C- ), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88 }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 115,4 (Caf- ), 148,0 (Caf- ), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). Laut Literatur [18] entsprach Fraktion III Syringalid A 3'- -L-Rhamnopyranosid.

Fraktion IV: HR-ESI-MS beobachtet bei m/z 665,21{{20}} (M−H)−, berechnet für C31H37O16, 665,2087. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 von Rhamnose), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H{33}} von Glucose), 4,90 (1H, d, J=1 Hz, H-1 von Rhamnose), 6,29 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d , J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6.5–7.0 (6H, aromatisches H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4(C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C- ), 36,4 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93 }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf- ), 114,7 (Caf- ), 148,2 (Caf- ), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). Die 1 H-NMR- und 13C-NMR-Spektraldaten stimmten mit denen von 2'-Acetylacteosid überein [17].

4. Schlussfolgerung

Es wurde eine HSCCC-Methode zur präparativen Trennung und Reinigung von Acteosid, Isoacteosid, Syringalid A, 3'- -L-Rhamnopyranosid und 2'-Acetylacteosid aus Cistanches deserticola YC Ma etabliert. Die vorliegende Studie zeigt, dass HSCCC eine sehr leistungsstarke Technik zur präparativen Trennung und Reinigung bioaktiver Komponenten aus Pflanzenmaterialien ist. Außerdem können die Verbindungen in ausreichend großem Maßstab mit hoher Reinheit isoliert werden und können dann als Referenzsubstanzen für Chromatographie- oder Bioaktivitätsstudien verwendet werden. Die Methode ist eine praktikable, wirtschaftliche und effiziente Technik zur schnellen präparativen Isolierung komplizierter Naturstoffe.

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