Durch Cutibacterium Acnes Fermentation produzierte Propionsäure verbessert die Melaninsynthese

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hsin-Jou Kao1, Yan-HanWang2, Sunita Keshari3, John JacksonYang3, Shinta Simbolon1, Chun-Chuan Chen1 & Chun-Ming Huang1*

Ultraviolette Bestrahlung induziert eine Anhäufung von Melanin, die durch die Verwendung von chemischen Bleichmitteln reduziert werden kann. Die damit verbundenen Sicherheitsbedenken solcher Produkte haben jedoch die Suche nach natürlichen und unbedenklichen Alternativen veranlasst. Diese Studie zielte darauf ab, eine natürliche Säureformulierung zu identifizieren, um die Hautpigmentierung zu reduzieren. Der Metabolit Propionsäure (CH3CH2COOH, PA) war die häufigste Fettsäure im Filtrat aus der Pluronic F68 (PF68)-Fermentation von Cutibacterium acnes (C. acnes) und reduzierte die DOPA-positiven Melanozyten durch signifikante Hemmung der zellulären Tyrosinase-Aktivität durch Bindung an die freier Fettsäurerezeptor 2 (FFAR2). Darüber hinaus veränderte die Behandlung mit 4 mM PA die Melanozytenproliferation nicht, was darauf hindeutet, dass es sich um eine wirksame Lösung für Hyperpigmentierung handelt, die keine Zellschäden verursacht. Die verringerte Aktivität von DOPA-positiven Melanozyten und Tyrosinase wurde auch in Ohrhautgewebe von Mäusen beobachtet, denen eine Mischung aus C. acnes und PF68 injiziert wurde, was unterstützt, dass die Hemmung der Melanogenese wahrscheinlich durch Fermentationsmetaboliten aus der C. acnes-Fermentation unter Verwendung von PF68 als vermittelt wird Kohlenstoffquelle. Darüber hinaus beeinflusste PA das Wachstum seines Elternbakteriums C. acnes nicht und ist daher ein potenter Fermentationsmetabolit, der das Gleichgewicht des Hautmikrobioms nicht stört.

Die Haut fungiert als Schnittstelle zwischen dem menschlichen Körper und der äußeren Umgebung und bietet Schutz vor Krankheitserregern, physischen und UV-Schäden1. Wenn die menschliche Haut übermäßig ultravioletter Strahlung (UVR) ausgesetzt wird, beeinflusst dies die Funktion und das Überleben vieler Zelltypen und führt zu Hautentzündungen, die zu Krebs führen können2,3. UV-induzierte DNA-Schäden aktivieren zelluläre Reparatursignale, um Melanin in Melanozyten zu produzieren, was zu Hautpigmentierung führt4,5. Die gesunde menschliche Hautoberfläche wird von einem vielfältigen Milieu von Mikroorganismen besiedelt, von denen viele als Kommensale oder opportunistische Pathogene harmlos sind6,7. Probiotika sind gängige Beispiele für Bakteriotherapie mit dem Potenzial für Lichtschutz, indem sie die Zeichen der Hautalterung verlangsamen und die Auswirkungen von UV-induzierten Hautentzündungen abschwächen3,8,9. Beispielsweise verhindern probiotische Milchsäurebakterien UV-induzierte Entzündungen, allergische Reaktionen und Immunsuppression in der Haut10. Darüber hinaus macht die Fähigkeit von Cutibacterium acnes (C. acnes), einem vorherrschenden Bakterium im Hautmikrobiom, als Reaktion auf UV-Strahlung Porphyrin zu produzieren, es aufgrund seiner Rolle beim Schutz und der Verhinderung von Ungleichgewichten zu einem wichtigen Biomarker2,11,12, daher ist es das auch von praktischem Interesse13. Studien haben gezeigt, dass Fermentfiltrat (GFF) das Melanin in menschlichen Melanomzellen reduziert und dadurch die Hautpigmentierung reduziert14. Freie Fettsäuren (FFA) haben bemerkenswerte regulatorische Wirkungen auf die Melanogenese und unterdrückten die Tyrosinaseaktivität in kultivierten B16F10-Mäuse-Melanomzellen15. Die meisten Behandlungsoptionen für Hyperpigmentierung blockieren die Umwandlung von Tyrosin in Melanin und wirken als Tyrosinase-Inhibitor, ein wichtiges regulatorisches Enzym, das für die Melanin-Biosynthese erforderlich ist16. In jüngster Zeit hat die umfangreiche Verwendung von Hautaufhellern wie Phenol- und Quecksilberverbindungen in kosmetischen Formulierungen zu ernsthaften Sicherheitsbedenken geführt17. Darüber hinaus ist FFAR2 (auch bekannt als GPR43) in einer Vielzahl von Geweben wie Knochenmark, Milz und normaler Haut vorhanden18 und ist ein vielversprechender Angriffspunkt für Medikamente bei Fettleibigkeit, Kolitis und einigen Entzündungsreaktionen19. FFAR2 ist ein Rezeptor für kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) mit Kettenlängen von weniger als sechs Kohlenstoffatomen wie Acetat, Butyrat und Propionat, der stärkste Agonist für FFAR220,21. Zuvor haben wir gezeigt, dass der In-vivo-Knockdown von FFAR2 in der Haut von Mäusen die Vermittlung von UV-Reizung durch Buttersäure blockiert3.

C. acnes is abundant on the human skin surface accounting for>60 Prozent der Bakterien2. Darüber hinaus wirken Propionsäure (PA), ein Fermentationsmetabolit von C. acnes, und seine veresterten Derivate als potenzielles antimikrobielles Mittel gegen Staphylococcus aureu11,22 und Poly(ethylenoxid)-Beschichtungen sind eine vielversprechende Methode zur Vermeidung von Infektionen23. Hautkommensale probiotische Bakterien können das Wachstum von USA300 durch Fermentation von Poly(ethylenglycol)dimethacrylat als selektivem Fermentationsinitiator hemmen24. PF68, ein Polymer auf PEG-Basis, ist ein stabiler Gelträger für antimikrobielle Wirkstoffe, erhöht die Oberflächenlöslichkeit des Medikaments und wird normalerweise zur Behandlung infizierter Wunden ohne erkennbare Nebenwirkungen verwendet25. In dieser Studie stellten wir fest, dass PF68 als eine von einem Polymer abgeleitete Verbindung ein potenziell sicheres und wirksames Mittel ist und dass die Anwendung von Metaboliten aus der Fermentation von PF68 durch den Hautcommensal C. acnes die UV-induzierte Hyperpigmentierung oder Melanogenese der Haut hemmen könnte.

cistanche tubolosa Vorteile: hemmt die Melanogenese der Haut.

Methoden

Ethik-Erklärung.

Diese Studie wurde streng nach einem genehmigten Protokoll des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der National Central University (NCU), Taiwan (NCU-106-016) und in Übereinstimmung mit den Arrive-Richtlinien (https://arriveguidelines .org/). Mäuse des Institute Cancer Research (ICR) (8–9 Wochen alte Weibchen; National Laboratory Animal Center, Taipeh, Taiwan) wurden unter Verwendung von CO2 in einer geschlossenen Box getötet. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt

Bakterienkultur.

C. acnes (ATCC 6919) wurde auf Reinforced Clostridium Medium (RCM, Oxford, Hampshire, England) unter anaeroben Bedingungen unter Verwendung eines Gas-Pak (BD, Sparks, MD, USA) kultiviert. Bakterien wurden bei 37 Grad bis zur logarithmischen Wachstumsphase kultiviert. Bakterienpellets wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 5,000×g geerntet, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann für weitere Experimente in PBS oder RCM suspendiert.

Bakterienfermentation.

C. acnes (105 koloniebildende Einheiten (KBE)/ml) wurde in 10 ml TSB in Gegenwart oder Abwesenheit von 2 % PF68 (BASF, NY, USA) unter anaeroben Bedingungen mit Gas-Pak inkubiert bei 37 Grad. PF68 allein in TSB wurde als Kontrolle eingeschlossen. Als Fermentationsindikator diente Te 0,002 Prozent (w/v) Phenolrot (Sigma) in TSB. Eine Farbänderung von rot-orange nach gelb zeigte das Auftreten einer bakteriellen Fermentation an, die durch optische Dichte bei 560 nm (OD560) nachgewiesen wurde.

Analyse durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS).

C. acnes (105 CFU/ml) wurde in TSB (10 ml) in Gegenwart von 2 Prozent PF68 inkubiert. Nach dem 1- Tag wurde das fermentierte Medium bei 5000 g für 10 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde zum Nachweis von SCFAs unter Verwendung des zuvor veröffentlichten Protokolls26 verwendet. Die Konzentrationen von Essigsäure (AA), PA, Buttersäure (BA) und Isobuttersäure (I-BA) in den Fermentationsmedien wurden durch eine Kalibrierungskurve quantifiziert, die aus sechs Konzentrationen ungleich Null unter Verwendung des FFA-Teststandards erstellt wurde ( Restek Corporation, Bellefonte, PA, USA), das auf 500-, 1,000-, 2,000-, 5,000- und 10,000- verdünnt wird falten.

B16F10-Melanomzellkultur.

Die B16F10-Melanomzelllinie wurde freundlicherweise von Dr. Richard Gallo, University of California San Diego, USA, und Dr. Cheng Ching-Yi, Chang Gung University of Science and Technology, Taiwan, zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) kultiviert, ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (FBS, Life Technologies) und 1 Prozent Penicillin-Streptomycin (Life Technologies) bei 37 Grad und 5 Prozent CO2. Die Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von 70–80 Prozent gezüchtet und dann mit Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Life Technologies) subkultiviert.

Reverse Transkription-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR).

RT-qPCR wurde eingesetzt, um die Tyrosinase-Genexpression in B16F10-Melanomzellen zu untersuchen, die 48 h mit 4 mM PA behandelt wurden. Die gesamte zelluläre RNA wurde unter Verwendung eines Quick-RNA MiniPrep-Kits (Zymo Research, CA, USA) extrahiert, gefolgt von einer reversen Transkription zu cDNA unter Verwendung eines iScript-cDNA-Synthese-Kits (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) und amplifiziert durch RT-qPCR in ein ABI 7300-System (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). Die vergleichende Zyklusschwelle (ΔΔCT) wurde verwendet, um die Quantifizierung der Genexpression zu bestimmen. Die Genebene der Glyceraldehyd-3--phosphatdehydrogenase (GAPDH) wurde zur Normalisierung des Tyrosinkinase-Gens verwendet. Primer für Tyrosinase und GAPDH sind 5′-TGACAAAGCCAAAACCCCCA-3′ (vorwärts); 5′-TTGTTCAAAAATACTTCCAGTGTGT-3′ (rückwärts) und 5′-TGTGTCCGTCGRGGATCTGA-3′ (vorwärts); 5'-GATGCCTGCTTCACCACCTT3' (umgekehrt).

Zelluläre Tyrosinase-Aktivität nach FFAR2-Gen-Knockdown.

B16F10-Melanomzellen wurden mit einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen/Well in 24--Well-Platten ausgesät. Weiterhin wurden die Zellen mit FFAR2-selektivem Antagonist GLPG0974 (0,1 &mgr;M, GLPG) und PA (4 mM) behandelt und bei 37 Grad in 5 % CO 2 für 24 h inkubiert. Die Zellen wurden trypsinisiert und mit RIPA-Puffer (Thermo Fisher Scientific, NJ, USA) lysiert. Die lysierten Zellen wurden bei -80 Grad eingefroren und zweimal aufgetaut, gefolgt von einer 10-minütigen Zentrifugation bei 12,000 U/min. Der Überstand wurde mit 1 ug/ml Levodopa (L-DOPA, Sigma) in einem Verhältnis von 2:1 in einer 96--Well-Platte gemischt, bei Raumtemperatur (RT) für 1 h inkubiert und die OD bei 475 nm war erkannt27.

Wofür wird Cistanche angewendet: Reduziert die Aktivität der Tyrosinase

BrdU-Kennzeichnung.

B16F10-Melanomzellen wurden auf 8-Well-Kammer-Objektträgern (Thermo Fisher Scientific) in DMEM mit 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin gezüchtet, bis 70 % Konfluenz erreicht waren. Bromodesoxyuridin (10 &mgr;M, BrdU, ACROS, New Jersey, USA) wurde zusammen mit 4 mM PA zu den Kulturmedien gegeben. Mit PBS in Kulturmedien versetztes BrdU wurde als Kontrolle eingeschlossen. Nach 24 h wurden die Zellen mit 4 % Perfluor Roxy (PFA, Sigma) fixiert und dann mit 0,2 % Triton X-100 (Sigma) für 10 min permeabilisiert. Als nächstes wurden die Zellen mit 2 N HCl bei 37 Grad für 25 min behandelt, mit HCl mit 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5) für 10 min neutralisiert und mit Blockierungspuffer vor der Inkubation des Anti-BrdU-Antikörpers (Abcam, MA, USA) blockiert. über Nacht und Esel Anti-Ziege Alexa Fluor 568 IgG (H plus L) (Life Technologies) als Zweitantikörper für 1 h bei 4 Grad. Kerne wurden mit 4,6-Diamidino2-phenylindol (DAPI, Sigma) gegengefärbt. Die Bilder wurden mit der cellSens-Software aufgenommen, die mit einem Olympus BX63-Mikroskop verbunden war.

Die Mausmodelle wurden durch Belichtung mit UV-Licht erstellt.

Mausmodelle haben maßgeblich dazu beigetragen, das Verständnis der vielen Rollen von UVR28 voranzutreiben. UVR erhöht DOPA-positive Melanozyten in der Haut, insbesondere an der Expositionsstelle29. Das Protokoll für die Behandlung der Injektion von C. acnes in die Mäuseohren wurde in unserer vorherigen Studie3 beschrieben (diese Referenz spricht nicht über die Injektion von C. acnes). In die Ohren von ICR-Mäusen wurde C. acnes (107 CFU) mit und ohne 2 % PF68 intradermal injiziert, gefolgt von einer Ultraviolett-B (UVB)-Exposition mit einer Wellenlänge von 312 nm bei einer Dosis von 200 mg/cm2 unter Verwendung einer UV-Lampe (Modell EB{ {10}}C, Spectronics Corp., Westbury, NY, USA) für 2 Minuten jeden Tag für 3 Tage. Mäuseohren, denen PBS oder PF68 injiziert wurde, gefolgt von einer UVB-Exposition, wurden als Kontrolle eingeschlossen. In einer anderen Gruppe von Versuchsmäusen wurden die Ohren mit 4 mM PA behandelt, gefolgt von einer UV-Exposition, mit PBS als Kontrolle.

siRNA‑vermitteltes Gen-Silencing von FFAR2.

Um das FFAR2-Gen abzuschalten, verwendeten wir die chemisch modifizierte siRNA, die auf den FFAR2-Rezeptor abzielt (FFAR2-siRNA), die siRNA-Negativkontrolle (NC-siRNA) und die Kontrolle ohne Injektion (C), die von GenePharma Co. (Shanghai, China). Ihre Oligonukleotidsequenzen sind siFFAR2: Sense-Strang, 5'-CCGGUGCAGUACAAGUUAUTT-3'; Antisense-Strang, 5′-AUAACUUGUACUGCACCGGTT-3′. Kontrolle: Sense-Strang, 5′-UUCCGAACGUGUCACGUTT-3′; Antisense-Strang, 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′. Diese chemisch modifizierten siRNAs wurden 3 Tage lang täglich durch intradermale Injektion in die Ohren von Mäusen unter Verwendung einer Mikronadel (2 mg/kg Mäusegewicht) abgegeben. Ab dem zweiten Tag mit 2 Prozent PA und UV-Bestrahlung für 3 Tage auftragen. Te-Vorbehandlung für die Injektion von siRNA in die Maus, wie in Referenz 30 beschrieben. Zehn, Mäuseohren wurden herausgeschnitten und am vierten Tag gefärbt.

Western-Blotting.

Mäuseohren wurden chemisch modifiziertes FFAR2 und Kontroll-siRNAs injiziert, gefolgt von einer Anwendung mit 2 Prozent PA- und UVB-Exposition für 3 Tage. Am dritten Tag wurden die Ohren der Mäuse geschnitten, homogenisiert und dann mit RIPA-Puffer (Thermo Fisher Scientific) lysiert. Zelllysate (30 μg) wurden einem 10-prozentigen SDS-PAGE-Gel unterzogen, das dann auf eine Poly(vinylidenfluorid) (PVDF)-Membran (Sigma) übertragen und vor der Inkubation über Nacht mit 5-prozentiger (w/v) fettfreier Milch blockiert wurde primäre Antikörper gegen FFAR2 Rabbit PolyAb (Proteintech, Rosemont, IL, USA) bei 4 Grad oder -Aktin (1:1, 000; Cusabio Technology, Houston, TX, USA). Darauf folgte eine 1-stündige Behandlung mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:5000) (Thermo Fisher Scientific). Proteinbanden wurden mit einem Chemilumineszenz-Nachweisreagenz (Thermo Fisher Scientific) und einem Omega Lum C Imaging System (Gel Co., San Francisco, CA, USA) nachgewiesen. Proteinbanden wurden unter Verwendung der ImageJ-Software durchgeführt.

Melanozytenzählung.

Die Knorpel der Maus wurden manuell entfernt und die Hautgewebe wurden in Ammoniumthiocyanat (Sigma)-Lösung bei 37 Grad für 20 min eingeweicht. Die epidermalen und basalen Schichten wurden vom Rest des Hautgewebes abgeblättert und die Melanozyten wurden durch Eintauchen in 0,1 M PBS (pH 7,2), enthaltend 0,14 Prozent L-DOPA, bei RT für 3 h und die Melanozytenzählung gefärbt in Hautgeweben wurde mikroskopisch gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll bestimmt29.

Statistische Analysen.

Die Datenanalyse wurde durch einen ungepaarten t-Test unter Verwendung der Prism-Software durchgeführt. Te-Niveaus statistischer Signifikanz wurden wie folgt angegeben: *P<0.05,><0.01,><0.001, and="" ns="non-significant." the="" mean±standard="" deviation="" (sd)="" for="" at="" least="" three="" independent="" experiments="" except="" for="" two="" independent="" western="" blotting="" analyses="" for="" fig.="" 4c="" was="" displayed.="" animal="" experiments="" were="" performed="" with="" at="" least="" three="" animals="" per="" treatment="">

cistanche tubolosa

Ergebnisse

C. acnes induziert die Fermentation von PF68.

Frühere Studien haben die Fermentation von Hautprobiotika zur Induktion der SCFA-Produktion in Gegenwart von Verbindungen als Kohlenstoffquelle gezeigt26. Um zu untersuchen, ob C. acnes PF68 fermentieren kann, wurde C. acnes mit PF68 in TSB-Medium für 1 Tag mit Phenolrot als Indikator zur Überwachung der bakteriellen Fermentation inkubiert. In TSB-Medien, die nur mit Bakterien inkubiert wurden, änderte sich das Phenolrot aufgrund der Bakterienreplikation von Rot zu Orange, während sich in den TSB-Medien, die Bakterien und PF68 enthielten, die Farbe von Phenolrot zu blassgelb änderte, wobei der pH-Wert abfiel, was auf die Verwendung von PF68 als hinweist eine Kohlenstoffquelle für die Fermentation (Abb. 1A). Darüber hinaus zeigte die OD560 von Phenolrot eine signifikante Abnahme des pH-Werts in den TSB-Medien, die Bakterien und PF68 (Abb. 1B) enthielten, im Vergleich zu Bakterien oder PF68 allein. Die im mit PF68 kultivierten C. acnes-Ferment enthaltenen SCFAs wurden durch GC-MS-Analyse (Abb. 1C) identifiziert und als AA-, PA-, BA- und I-BA-Säure identifiziert, wobei PA11 die höchste Konzentration aufwies (Abb. 1D ).

Abbildung 1. Die bakterielle Fermentation mit Polymer wurde von einer Abnahme des intrazellulären pH-Werts begleitet.

In-vitro-Effekt von PA auf die Melaninproduktion über PA‑FFAR2.

Fatty acids modulate the degradation of tyrosinase, a crucial enzyme involved in melanin biosynthesis in melanocytes and melanoma cells31. Therefore, to detect the in vitro effect of PA on melanin synthesis, B16F10 melanoma cells were treated with 4 mM PA for 48 h, with the decreased expression of the tyrosinase in PA treated melanoma cells compared to the control (Fig. 2A). The immunostaining of PA-treated melanoma cells after BrdU labeling showed that PA did not alter the proliferation of melanoma cells (Fig. 2B). Furthermore, the effect of PA and AA, two highly expressed SCFAs in the fermentation filtrate (Fig. 1D)32, on melanin production was assessed in melanoma cells, with PA causing a>Verdoppelung der Melaninproduktion im Vergleich zu AA (Fig. 2C). SCFAs regulieren wie PA und AA ihre Funktionen über die Interaktion mit FFAR2 und FFAR3, wobei PA zu den stärksten SCFAs für diese beiden Rezeptoren gehört33. In Anbetracht der PA-Regulierung über ihre Wechselwirkung mit FFAR2 könnte die Blockierung der Signalübertragung dieses Rezeptors mithilfe eines selektiven Inhibitors ein nützlicher Ansatz zur Bewertung der Rolle von PA bei der Regulation der Melanogenese sein. Die zelluläre Tyrosinase-Aktivität blieb durch Blockieren von FFAR2 unter Verwendung des FFAR2-selektiven Antagonisten GLPG vor der Behandlung mit PA unverändert und nahm ohne GLPG im Gegensatz zur Kontrollgruppe ab (Abb. 2D). Diese Ergebnisse zeigten die wirksame Rolle von PA-FFAR2 bei der Abschwächung des Melaningehalts durch Hemmung der Tyrosinasekinase-Aktivität in Melanomzellen mit unveränderter Zellproliferation.

Abbildung 2. Te-Effekte der Tyrosinase-Genexpression und Zellproliferation in Melanomzellen nach PA-Behandlung.

Die Mischung aus C. acnes und PF68 hemmte UVB‑induzierte funktionierende Melanozyten in Mäuseohren.

Es hat sich gezeigt, dass die topische Anwendung von Fermentationsextrakten oder Fettsäuren die UV-induzierte Hyperpigmentierung der Haut verringert, indem sie den Tyrosinaseabbau reguliert34,35. Frühere Studien zeigten, dass die Melanogenese nach UV-Exposition auf die Aktivierung funktionierender Melanozyten in der Epidermis oder Dermis zurückzuführen ist36. Nachdem festgestellt wurde, dass PA als ein wichtiger SCFA aus der C. acnes-Fermentation von PF68 die Melaninproduktion in vitro wirksam reduzieren könnte, untersuchten wir dann die Wirkung von C. acnes plus PF68 darauf in vivo. Die Ohren von ICR-Mäusen wurden 3 Tage lang jeden zweiten Tag UVB ausgesetzt, gleichzeitig mit der Injektion von C. acnes und PF68. Als Kontrollen wurden Injektionen mit PBS oder C. acnes oder PF68 allein eingeschlossen. Die epidermalen und basalen Schichten wurden vom Hautgewebe im Mausohr abgelöst und die Melanozyten wurden mit L-DOPA gefärbt. Es gab einen signifikanten Anstieg der Melanozytenzahl nach UVB-Exposition, ohne Änderung nach Injektion mit C. acnes oder PF68 allein. Allerdings wurde in den UVB-exponierten Gruppen nach Behandlung mit einer Mischung aus C. acnes und PF68 eine signifikante Reduktion der Anzahl DOPA-positiver Melanozyten festgestellt (Abb. 3A).

Abbildung 3. Induktion von Melanozyten durch UVB und Hemmung durch verschiedene Behandlungen.

Verbesserung von UVB‑induzierten funktionierenden Melanozyten im Mausohr durch PA, einen Fermentationsmetaboliten von C. acnes.

Die Wirkung der direkten Anwendung von PA auf die UV-induzierte Melanogenese wurde bewertet. Die UV-induzierte Hyperpigmentierung und Tyrosinase-Expression in der Mausohrhaut in der Kontrollgruppe war nach der topischen Anwendung von PA für 3 Tage signifikant verringert (Abb. 3B). Tus, PA, ein Metabolit aus der PF68-Fermentation von C. acnes, hemmt die funktionierende Melanozytenproduktion mit Melaninsynthese durch UVB-induzierte. Die Tyrosinase-Expression war in PA-behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle merklich verringert (Fig. 3C).

PA hemmt UVB‑induzierte funktionierende Melanozyten über FFAR2 in vivo.

Um festzustellen, ob die Reduktion der exogenen Melanogenese über die PA-Wechselwirkung mit seinem verwandten Rezeptor erfolgte, wurde FFAR2 in den Hautmelanozyten des Mausohrs niedergeschlagen, gefolgt von einer UVB-Exposition und einer PA-Behandlung. UVB-induzierter Anstieg der Proliferation von Melanozyten und Tyrosinase-Aktivität war in der mit NC-siRNA injizierten Mausohrepidermis nach Applikation von PA signifikant reduziert (Abb. 4A, B). Die Anzahl der Melanozyten und die Tyrosinase-Aktivität bleiben jedoch auch nach PA-Applikation in UVB-bestrahlter Mausohrepidermis, die mit FFAR2 niedergeschlagen wurde, unverändert. Wir bestätigten den Knockdown des FFAR2-Gens, indem wir das Proteinexpressionsniveau von FFAR2 durch Western-Blot-Analyse maßen (Abb. 4C). Tus, PA greift in die Melanogenese ein, indem es die Aktivität der Tyrosinase unterdrückt, bei der PA-FFAR2 eine potenzielle Rolle bei der Melaninproduktion spielt.

cistanche tubolosa-Extrakt

Diskussion

Melanin, ein kritischer Faktor der Hautabwehr gegen UV-Strahlung, wird in den Melanosomen von Melanozyten synthetisiert, über die dendritischen Spitzen auf benachbarte Keratinozyten übertragen und schließlich in der gesamten Hautepidermis verteilt37. Fermentationsmetabolite von Bakterien werden aufgrund ihrer positiven Wirkung auf UV-induzierte Hautentzündungen und Infektionskrankheiten zunehmend in der Hauttherapie eingesetzt3. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass PA, der Hauptmetabolit aus der PF68-Fermentation von C. acnes, die UVB-induzierten funktionierenden Melanozytenspiegel reduziert, indem es die Tyrosinaseaktivität in vitro und in vivo über FFAR2 hemmt.

Frühere Studien zeigten die Hemmung der Melanogenese durch Tyrosinasehemmung durch Fermentationsmetaboliten aus probiotischen LA- und Lactobacillus-Bakterien24,38,39. Auch das Polymer auf PEG-Basis mit hohem Molekulargewicht (~20, 000) wurde vollständig durch Fermentation durch gramnegative Bakterien abgebaut, die Acetat und Propionat produzierten40. In dieser Studie war PA (~4 mM) das am häufigsten vorkommende SCFA im Filtrat aus der PF68-Fermentation von C. acnes und reduzierte den Melaningehalt in Melanozyten wirksamer als AA. Darüber hinaus hemmte die Behandlung mit 4 mM PA signifikant die zelluläre Tyrosinase-Aktivität in Melanozyten, was beweist, dass die Hemmung der Melanogenese durch PA über die Reduktion der Tyrosinase-Genexpression erfolgte. Menschen haben die gleiche Anzahl an Melanozyten, was nicht der Grund dafür ist, dass die Hautpigmentierung beeinträchtigt wird, sondern die Aktivierung funktionierender Melanozyten durch UV-Bestrahlung36,41. Hier veränderte die Behandlung mit 4 mM PA die Melanozytenproliferation nicht, was darauf hinweist, dass es sich um eine wirksame Behandlungsoption handelt, die keine Zellschäden verursacht. Die verringerte Melanozytenzahl und Tyrosinaseaktivität wurde auch in Ohrhautgewebe von Mäusen beobachtet, denen eine Mischung aus C. acnes und PF68 injiziert wurde, was zeigt, dass die Hemmung der Melanogenese wahrscheinlich durch Fermentationsmetaboliten aus der C. acnes-Fermentation unter Verwendung von PF68 als Kohlenstoff vermittelt wird Quelle. Darüber hinaus bestätigte unsere Studie, dass PA ein hervorragendes antimikrobielles Mittel ist, ohne das Wachstum seines Elternbakteriums C. acnes zu verändern, was zeigt, dass PA ein potenter Metabolit ist, der das Gleichgewicht des Hautmikrobioms nicht stört11.

Die Melaninproduktion wird durch mehrere Signalsysteme initiiert und reguliert, wobei Tyrosinase die Umwandlung von Tyrosin in DOPA und in Dopachinon katalysiert, was zur Bildung von Melanozytenpigmenten führt42,43. In den meisten Fällen wirken hautaufhellende Reagenzien auf verschiedenen Ebenen der Melaninproduktion über FFAR2, um die Tyrosinaseaktivität zu beeinflussen, oder zielen direkt auf die Tyrosinase ab, um die Melanogenese in der Haut zu hemmen44–46. SCFAs wie PA und AA entfalten ihre Wirkung durch Bindung an ihre selektiven verwandten Rezeptoren wie FFAR2 oder FFAR3, wobei PA zu den wirksamsten SCFAs für beide Rezeptoren gehört47. GLPG, ein selektiver FFAR2-Antagonist, und siRNA-vermitteltes Gen-Silencing von FFAR2 zur Unterstützung der Blockierung von FFAR23,48. In der aktuellen Studie änderten sich die erhöhte Melanozytenzahl und die Tyrosinase-Genexpression im Hautgewebe der Ohren von Mäusen nicht als Reaktion auf UVB-Strahlung, selbst nach PA-Anwendung zum FFAR2-Knockdown bei Mäusen (Abb. 4A). Darüber hinaus war die Tyrosinase-Genexpression nach PA-Behandlung in vitro verringert, jedoch verbesserte die Blockierung des FFAR2-Gens mit GLPG, einem selektiven FFAR2-Antagonisten, die Wirkung von PA, die Tyrosinase-Genexpression abzuschwächen. Nach dem Blockieren von FFAR2 führt der Verlust von FFAR2 zu einer verstärkten Expression der Tyrosinase-Aktivität nach der PA-Behandlung. Obwohl sowohl PA als auch AA, die Fermentationsmetaboliten von C. acnes, eine ähnliche Affinität zur FFAR2-Bindung haben20, bestätigt die relativ geringere Wirksamkeit von AA bei der Abschwächung der Tyrosinaseaktivität in Melanozyten das therapeutische Potenzial von PA als Postbiotikum gegen Melanogenese.

Die durch UV-Strahlung auf der Haut verursachten lichtschädigenden Wirkungen haben große Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Sonnenschutz- und Anti-Hyperpigmentierungsprodukte sind weit verbreitet, aber ihre Sicherheit, Hautpenetration und therapeutische Wirksamkeit sind immer noch fraglich49. Obwohl Avobenzon aufgrund seiner hohen UV-Wirksamkeit ein häufiger Bestandteil von Sonnenschutzmitteln ist, ist es photoinstabil und daher nicht sicher und wurde nach chronischer Anwendung im Blut nachgewiesen50,51. Die Entwicklung einer effektiven Hautaufhellung durch Blockierung der Tyrosinase-Expression durch Fermentationsmetaboliten aus probiotischen Bakterien oder Polymeren als Kohlenstoffquelle ist ein effektiver und natürlicher Weg zur Unterdrückung der Melanogenese38,39. Da die Verwendung von lebenden Probiotika für Kosmetika streng reguliert ist, ist die Förderung ihrer vorteilhaften Wirkungen durch Fermentationsmetaboliten aus lebenden probiotischen Bakterien zu einer praktikablen Anwendung geworden. Außerdem kann PF68 als Präbiotikum die Produktion von SCFAs aus der Fermentation von C. acnes steigern und wurde verwendet, um die biologische Stabilität zu verbessern und verschiedene Therapeutika wie 6-Mercaptopurin-beladene Mikrokügelchen bei ihrer Wechselwirkung mit dem menschlichen Körper zu unterstützen52. Darüber hinaus kann PF68 in Zellmembranen eingebaut und in Zellen translokalisiert werden und wurde als stabiler Gelträger für antimikrobielle Wirkstoffe verwendet, wodurch die Oberflächenlöslichkeit des Arzneimittels bei der Hautbehandlung erhöht wird12,23. Daher gilt PF68 als sichere und wirksame Option für die Entwicklung von Arzneimitteln und Kosmetika. Zusätzlich zu der Funktion von PF68 als Fermentationsinitiator zur Steigerung der Fermentationsaktivität von C. acnes hat es auch das Potenzial, ein Adjuvans zu sein, um die effektiven Dosen von medizinischen Reagenzien zu reduzieren und die Löslichkeit von schwer wasserlöslichen Arzneimitteln zu verbessern.

Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die PA-FFAR2-Interaktion ein zentraler Mechanismus in der Wirkung von Probiotika oder Postbiotika auf die durch UVR verursachte Hyperpigmentierung sein könnte. Die PA-Behandlung beeinflusste die Melanozytenproliferation nicht. Im Vergleich zu chemischen Therapien sind die Metaboliten von Probiotika milder und natürlicher53. Obwohl der genaue Mechanismus, durch den die Metaboliten der PF68-Fermentation von C. acnes die Melanogenese hemmen, unklar ist, legen die Beweise aus der vorliegenden Studie die Beteiligung des SCFAs-FFAR2--Tyrosinase-Signalwegs nahe. Diese Ergebnisse sind von Vorteil für die zukünftige klinische Behandlung von Pigmentstörungen und für die Entwicklung von Kosmetika, die das Anwendungsspektrum von Whitening-Produkten erweitern. Schließlich bietet die Vielfalt der Probiotika personalisierte Behandlungen für Hyperpigmentierung und die Entwicklung spezieller Produkte mit höherer Leistung.

Cistanche-Extrakt Vorteile: Hautaufhellung