Schutzwirkung von Alpha-Liponsäure gegen 5-Fluorouracil-induzierte gastrointestinale Mukositis bei Ratten Teil 1

Abstrakt: Alpha-Liponsäure (ALA) wird häufig in Multivitaminformeln und Anti-Aging-Produkten verwendet. Der Zweck dieser Studie bestand darin, den potenziellen schützenden Nutzen von ALA bei 5-Fluorouracil (5-FU)-induzierter gastrointestinaler Mukositis bei Wistar-Albino-Ratten zu untersuchen. Gewebe aus Magen, Dünndarm und Dickdarm wurden herausgeschnitten und Blutseren wurden entnommen, um biochemische Indizes wie TNF-, IL-1, MDA, GPx, SOD, MMP-1, {{ 8}}, -8 und TIMP-1. Außerdem wurde eine histopathologische Untersuchung durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten durch Mukositis erhöhte TNF-, IL-1-, MDA-, MMP-1-, -2-, -8- und TIMP{17}}-Spiegel sowohl im Gewebe als auch im Serum und diese Werte sanken nach der ALA-Behandlung dramatisch. Reduzierte SOD- und GPx-Aktivitäten in Mukositis-Gruppen wurden in ALA-behandelten Gruppen umgekehrt. Die durch Mukositis im Magen und Dünndarm verursachten Schäden gingen laut histopathologischer Untersuchung in der mit ALA behandelten Gruppe zurück. Folglich kann die Implementierung einer ALA-Supplementierung in der 5-FU-Therapie als Schutzmaßnahme für Krebspatienten mit gastrointestinaler Mukositis wirken. Angesichts der Ergebnisse könnte ALA, ein aus Lebensmitteln gewonnenes Antioxidans mit pleiotropen Eigenschaften, eine wirksame Behandlung für 5-FU-induzierte gastrointestinale Mukositis sein und oxidativen Stress, Entzündungen und Gewebeschäden bei Krebspatienten verhindern, die 5- erhalten. 24}}FU-Therapie.

Glykosid von Cistanche kann auch die SOD-Aktivität im Herz- und Lebergewebe erhöhen und den Gehalt an Lipofuscin und MDA in jedem Gewebe erheblich reduzieren, wodurch verschiedene reaktive Sauerstoffradikale (OH-, H₂O₂ usw.) effektiv abgefangen und vor verursachten DNA-Schäden geschützt werden durch OH-Radikale. Cistanche-Phenylethanoidglykoside haben eine starke Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, eine höhere Reduktionsfähigkeit als Vitamin C, verbessern die Aktivität von SOD in der Spermiensuspension, reduzieren den MDA-Gehalt und haben eine gewisse schützende Wirkung auf die Funktion der Spermienmembran. Cistanche-Polysaccharide können die durch D-Galaktose verursachte Aktivität von SOD und GSH-Px in Erythrozyten und Lungengewebe experimentell seneszierender Mäuse steigern, außerdem den Gehalt an MDA und Kollagen in Lunge und Plasma verringern und den Gehalt an Elastin erhöhen eine gute Abfangwirkung auf DPPH, verlängert die Zeit der Hypoxie bei seneszenten Mäusen, verbessert die Aktivität von SOD im Serum und verzögert die physiologische Degeneration der Lunge bei experimentell seneszenten Mäusen. Bei der zellulären morphologischen Degeneration haben Experimente gezeigt, dass Cistanche über eine gute antioxidative Fähigkeit verfügt und hat das Potenzial, ein Medikament zur Vorbeugung und Behandlung von Hautalterungskrankheiten zu sein. Gleichzeitig hat Echinacosid in Cistanche eine erhebliche Fähigkeit, freie DPPH-Radikale abzufangen und kann reaktive Sauerstoffspezies abfangen, den durch freie Radikale verursachten Kollagenabbau verhindern und hat auch eine gute Reparaturwirkung auf Schäden durch Thymin-Radikalanionen.

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1. Einleitung

Alpha-Liponsäure (ALA) ist in einer Vielzahl von Lebensmitteln enthalten, darunter Gemüse (Spinat, Brokkoli, Tomaten) und Fleisch (insbesondere Eingeweide) sowie in mehreren Nahrungsergänzungsmitteln [1,2]. ALA hat zahlreiche antioxidative Wirkungen, einschließlich der Aktivierung endogener antioxidativer Mechanismen und der Chelatisierung von Metallionen wie Eisen, Zink und Kupfer [3,4]. Als Organoschwefelmolekül kann ALA reaktive Sauerstoffspezies (ROS) abfangen und die Aktivität antioxidativer Gewebeenzyme wie Glutathionperoxidase (GPx) und Superoxiddismutase (SOD) steigern [5–7]. Aufgrund seiner antioxidativen Eigenschaften reduziert ALA nachweislich den ALA-abhängigen Zelltod bei Lungenkrebs [8], Brustkrebs [9] und Dickdarmkrebs [10]. Darüber hinaus haben frühere Untersuchungen gezeigt, dass ALA entzündungshemmende Eigenschaften besitzt [11–16]. ALA wirkt entzündungshemmend, indem es die Expression von entzündlichen Zytokinen wie Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-) und Interleukin-1 (IL-1) moduliert [17,18]. Die pharmakologischen Vorteile von ALA wurden in einer Vielzahl medizinischer Bereiche nachgewiesen, darunter kardiovaskuläre, neuroprotektive, kognitive und Anti-Aging-Modelle [19].

Krebs ist in jedem Land die häufigste Todesursache und ein großes Hindernis für die Langlebigkeit [20]. Die Nebenwirkungen chemotherapeutischer Medikamente sind einer der wichtigsten schwächenden Faktoren im Kampf gegen Krebs, und Mukositis ist eine der häufigsten Erkrankungen bei Krebspatienten [21]. Mukositis ist eine pathologische Entzündungserkrankung, die durch Geschwürbildung und Entzündung der Schleimhaut des Magen-Darm-Systems gekennzeichnet ist [22]. Mukositis erhöht den Einsatz von Opioid-Analgetika aufgrund von Schmerzen und beschleunigt den Übergang zur vollständigen parenteralen Ernährung aufgrund von Ernährungsproblemen [23]. Mukositis und mit Mukositis verbundene Schwierigkeiten verringern die Lebensqualität des Patienten, während die Entwicklung lebensbedrohlicher Zustände und negativer Reaktionen auf die Therapie aufgrund einer schlechten Läsionsbehandlung Anlass zur Sorge geben [24].

Das am häufigsten verwendete Chemotherapeutikum bei bösartigen Magen-Darm-Erkrankungen ist das Pyrimidinanalogon 5-Fluorouracil (5-FU). 5-FU übt seine krebsbekämpfende Wirkung aus, indem es die Thymidylatsynthase (TS) hemmt und seine Metaboliten in RNA und DNA integriert [25]. Allerdings löst dieser Wirkstoff eine Magen-Darm-Mukositis aus, eine schwerwiegende, schwächende Nebenwirkung [26]. Insbesondere die Verschlechterung des Oxidationsmittel-Antioxidantien-Gleichgewichts, ein Anstieg der proinflammatorischen Zytokinspiegel und die Aktivität proteolytischer Enzyme spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung dieser Nebenwirkungen. Obwohl antioxidative und entzündungshemmende Medikamente eingesetzt wurden, um dieses Problem anzugehen, muss noch eine besonders wirksame Therapiemethode gefunden werden [27,28].

Bisher wurde in mehreren Studien über die gemeinsame Anwendung von 5-FU und ALA bei verschiedenen Krebsarten berichtet; Dazu gehören zervikale und kolorektale Tumoren [29,30]. Darüber hinaus wären Hilfsmedikamente von Vorteil, die in Behandlungsverfahren einbezogen werden könnten, um Krebspatienten vor den durch 5-FU verursachten gastrointestinalen Mukositis-Nebenwirkungen zu schützen. Der Zweck dieser Studie bestand daher darin, die biologischen Auswirkungen der Verwendung von ALA bei Ratten mit einem von 5-FU erstellten Mukositis-Modell zu bestimmen und außerdem seine mögliche Verwendung als mögliches Mittel in Behandlungsprotokollen zu untersuchen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Tiere

Die Tiere stammten aus den Tierversuchseinheiten der Near East University. Die Ratten (Wistar-Albino, beide Geschlechter) wurden von Anfang an in einem 12:12-stündigen Dunkel-/Hell-Zyklus bei einer Raumtemperatur von 22 ± 2 °C in einer feuchtigkeitskontrollierten Einrichtung (50 ± 5 Prozent) gehalten. Die Fütterung erfolgte nach Belieben, ohne Einschränkung auf das Standard-Rattenfutter und Trinkwasser. Die Ratten wurden in einem Plexiglaskäfig gehalten (4 Ratten pro Käfig mit den Abmessungen 60 × 40 × 40 cm). Das Studienprotokoll wurde von der örtlichen Ethikkommission für Tierversuche der Near East University genehmigt (Genehmigungsnummer 2019/01 am 17. Januar 2019 und 2020/11 am 27. November 2020) und entspricht den ethischen Richtlinien, die in der Helsinki-Erklärung von 1964 und ihren späteren Änderungen erwähnt sind wurden verfolgt.

Zweiunddreißig Wistar-Albino-Ratten beiderlei Geschlechts mit einem Gewicht von 200–250 g wurden in vier Gruppen zu je acht Ratten eingeteilt (n=8): Kontroll-, ALA-, Mukositis- und Mukositis plus ALA-Gruppen. Die Kontrollgruppe erhielt eine Woche lang nur einmal täglich intraperitoneale (ip) Kochsalzlösung (SF). Die ALA-Gruppe erhielt vom ersten Tag an eine Woche lang nur ALA in einer Dosis von 100 mg/kg ip einmal täglich [31,32]. Die Mukositis-Gruppe wurde am ersten Tag mit SF (ip) und vom zweiten Tag bis zum Ende des Experiments mit 400 mg/kg 5-FU ip behandelt [33]. Die Mukositis plus ALA-Gruppe erhielt 100 mg/kg ip ALA am Tag 1 und 400 mg/kg ip 5-FU am Tag 2. Anschließend wurde die ip-Verabreichung von 100 mg/kg/Tag ALA bis zum Ende des Experiments fortgesetzt . Die Tiere wurden eine Woche lang überwacht, ohne dass es in dieser Zeit zu Todesfällen kam. Die Tiere aller Gruppen wurden am Ende des Forschungszeitraums durch die Verabreichung einer Kombination aus einer Überdosis Ketamin/Xylazin eingeschläfert. Labortests wurden im Diagnoselabor und Histopathologielabor des Tierkrankenhauses der Near East University durchgeführt.

2.2. Entnahme von Blut- und Gewebeproben

Es wurden Blutproben entnommen und in Serumtrennröhrchen an das Labor geschickt. Die Serumproben wurden 10 Minuten lang bei 2000 × g getrennt und bis zur weiteren Analyse bei –80 °C aufbewahrt. Um überschüssiges Blut zu entfernen, wurden Magen-, Dünndarm- und Dickdarmgewebe gesammelt und mit Phosphatpufferlösung (pH=7,4) gespült. Anschließend wurden sie nach der Lieferung an das Labor einem Homogenisierungsverfahren unterzogen. Die Gewebehomogenisierung wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers unter Verwendung von RIPA-Puffer (Artikel-Nr. 10010263, Chargen-Nr. 0490889-1, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA) und einem Dounce-Gewebeschleifer-Set (D8938, Charge 3110, Sigma) durchgeführt -Aldrich, St. Louis, MO, USA) auf Eis. Nach der Homogenisierung wurden die Proben 10 Minuten lang bei plus 4 °C bei 1600 × g zentrifugiert. Zur Quantifizierung des Proteingehalts in Gewebeproben wurde die Bradford-Proteinbestimmungstechnik eingesetzt, und die Überstände wurden dann zur anschließenden Untersuchung bei –80 °C eingefroren.

2.3. Messungen biochemischer Indizes

Aktivitäten von Alanin-Transaminase (ALT), Aspartat-Transaminase (AST), alkalischer Phosphatase (ALP), Laktatdehydrogenase (LDH), Lipase (LIP), Amylase (AMY), Kreatinin, Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN), Gesamtprotein (TP) und Albuminspiegel wurden als biochemische Indizes in Serumproben mit einem automatisierten BS-240 VET Clinical Chemistry Analyzer (Mindray, Shenzhen, China) gemessen.

2.4. Messung von Zytokinen in Seren und Geweben

TNF- und IL-1-Konzentrationen in Seren und Gewebeproben wurden mit im Handel erhältlichen rattenspezifischen ELISA-Testkits (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (ELR-TNF- und ELR-IL1 -, RayBiotech Life) gemessen Inc., Norcross, GA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers.

2.5. Messung von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und Gewebeinhibitoren der Metalloproteinase-1 (TIMP-1) in Seren und Geweben

MMPs und TIMP-1, die an einer Vielzahl biologischer Prozesse wie Krebs und Entzündungen beteiligt sind, wurden sowohl in Gewebehomogenaten als auch in Seren unter Verwendung der Anweisungen und Empfehlungen des Herstellers kommerziell erhältlicher rattenspezifischer ELISA-Tests (MMP{ {2}} E-EL-R0617; Elabscience, Wuhan, China; MMP-2 ELR-MMP2; MMP-8 ELR-MMP8; TIMP-1 ELR-TIMP-1 RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, USA). Die Serumkonzentrationen der MMPs und TIMP-1 wurden als pg/ml ausgedrückt, während die Gewebespiegel als pg/mg Protein ausgedrückt wurden.

2.6. Messung von Malondialdehyd (MDA), GPx und SOD in Geweben

Die MDA-Spiegel in Geweben wurden mithilfe kommerziell erhältlicher Testkits zur Bestimmung des Lipidperoxidationszustands bewertet (TBARS Assay Kit, Artikel-Nr. 10009055, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA). Das Messprinzip basiert auf der Reaktion mit Thiobarbitursäure (TBA) in kochendem Wasser für 60 Minuten in einem sauren Medium und der Messung der Absorption der Reaktionsmischung bei 532 nm (Ohkawa et al., 1979). Zur Messung der Absorption wurde ein VersaMax Tunable Microplate Reader (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) verwendet. Die MDA-Konzentrationen im Gewebe wurden als nmol MDA/mg Protein ausgedrückt.

In Geweben wurden die GPx- und SOD-Aktivität mithilfe gebrauchsfertiger Testkits bewertet. (RANSEL RS505, RANSOD SD125, Randox Laboratories Ltd., Crumlin, UK) unter Verwendung eines automatisierten BS-240 VET Clinical Chemistry Analyzer (Mindray, Shenzhen, China). Die Mengen an GPx und SOD in den Gewebeproben (Magen, Dünndarm und Dickdarm) wurden als U/mg Protein ausgedrückt.

2.7. Histopathologische Untersuchung

Die Gewebe des Magens, des Dünndarms und des Dickdarms, die unmittelbar nach dem Versuchszeitraum gewonnen wurden, wurden 24 Stunden lang bei Raumtemperatur in 1 0 Prozent (v/v) neutralem Formalin fixiert. Nach der Fixierung wurden die Gewebe auf ein Gewebeverfolgungsgerät, Leica TP1020 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland), gelegt. Anschließend wurden die aus dem Gewebeverfolgungsgerät entnommenen Gewebe in Paraffin eingebettet. Mit Hilfe eines Mikrotoms Leica RM2255 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) wurden Schnitte mit einer Dicke von 5-µm aus den Geweben geschnitten und eine routinemäßige Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung durchgeführt. Die Schnitte wurden histomorphologisch mit einem Leica DM500-Lichtmikroskop in Verbindung mit dem integrierten digitalen Bildanalysesystem Leica Microsystem Framework (Leica Application Suite Version 3.0 Serie 38132019, Leica ICC50 HD, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nußloch, Deutschland) untersucht.

2.8. Statistische Analysen

Für die statistische Analyse wurde die GraphPad Prism-Software verwendet (Version 7.04, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Die Daten wurden alle als Mittelwert ± Standardabweichung (X ± SD) ausgedrückt. Zum Vergleich der Datengruppen wurde ein Varianzanalysetest (ANOVA) verwendet, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest. Darüber hinaus wurde der Kruskal-Wallis-Test verwendet, um histomorphologische Ergebnisse zwischen Gruppen zu vergleichen. Ein Unterschied von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

3. Ergebnisse

3.1. ALA wirkt sich positiv auf biochemische Indizes aus

Tabelle 1 zeigt die Serumenzymaktivität und die Metabolitenkonzentrationen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe wies die Mukositis-Gruppe wesentlich höhere Werte an Albumin, ALT, AST, ALP, LDH, Amylase, Lipase, BUN, Kreatinin und TP auf (p < 0.05 –0.0001). Es gab jedoch einen signifikanten Unterschied in den Albumin-, AST-, ALT-, ALP-, LDH-, BUN-, Kreatinin-, Amylase-, BUN- und Kreatininspiegeln zwischen der ALA plus Mukositis-Gruppe und der Mukositis-Gruppe (p < 0,05–0,001). Die ALP-, ALT-, AST-, LDH- und Amylase-Werte unterschieden sich ebenfalls erheblich zwischen der Mukositis- und der ALA-Gruppe (p < 0,05–0,0001). Dementsprechend wurde beobachtet, dass die Werte von Leberenzymen, Pankreasenzymen und Metaboliten in der Mukositis-Gruppe drastisch reduziert wurden, wenn ALA zur Behandlung hinzugefügt wurde.

3.2. ALA verringert die Produktion entzündungsfördernder Zytokine

Die Konzentrationen der proinflammatorischen Zytokine TNF- und IL-1 in Serum-, Magen-, Dünndarm- und Dickdarmproben sind in Abbildung 1 dargestellt. Die TNF- und IL-1-Konzentrationen in Seren und allen anderen Die Gewebewerte der Tiere in der Mukositis-Gruppe waren im Vergleich zu den Kontroll-, ALA- und Mukositis-plus-ALA-Gruppen signifikant höher (p < 0.05–0.0{ {17}}{{20}}1). Allerdings verringerten sich die TNF- und IL-1-Spiegel in den Seren und allen Geweben in der Mukositis plus ALA-Gruppe im Vergleich zur Mukositis-Gruppe signifikant (p < 0,05–0,0001). Zwischen der Kontrollgruppe und der Mukositis plus ALA-Gruppe gab es einen erheblichen Unterschied in den TNF-Spiegeln im Dünn- und Dickdarm. (p < 0,01). Es gab auch signifikante Unterschiede in den TNF-Spiegeln im Dick- und Dünndarm zwischen der ALA- und der Mucositis plus ALA-Gruppe. (p < 0,01 bzw. p < 0,001). Darüber hinaus gab es statistisch signifikante Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und der Mukositis plus ALA-Gruppe hinsichtlich der IL-1-Spiegel im Magen (p < 0,05). Daher schien ALA die Konzentration proinflammatorischer Zytokine bei Mukositis signifikant zu unterdrücken.

3.3. Die ALA-Behandlung reduziert die Lipidperoxidation und erhöht die Aktivitäten antioxidativer Enzyme im Gewebe

MDA-Spiegel, GPx- und SOD-Aktivitäten wurden quantifiziert, um den Peroxidations- und Antioxidationsstatus auf Gewebeebene zu beurteilen (Abbildung 2). Die MDA-Spiegel im Magen, Dünndarm und Dickdarm der Mukositis-Gruppe waren signifikant höher als in der Kontroll-, ALA- und Mukositis-plus-ALA-Gruppe (p < 0.05–0 .0001). Darüber hinaus unterschieden sich die MDA-Spiegel im Dickdarm der Mukositis plus ALA-Gruppe erheblich von denen der Kontroll- und ALA-Gruppe (p < 0,0001).

Ratten in der Kontroll- und ALA-Gruppe wiesen in allen Geweben signifikant höhere SOD-Werte auf als Ratten in der Mukositis-Gruppe (p < {{0}}.05–0.{{8 }}{{10}}01). Die SOD-Werte in den Dickdarmproben unterschieden sich signifikant in den Gruppen ALA und Mucositis plus ALA (p < 0,01). In den Magenproben waren die SOD-Werte in den Gruppen ALA und Mukositis plus ALA signifikant niedriger (p < 0,05). Darüber hinaus waren die SOD-Werte im Dünndarm von Ratten aus der Mukositis-Gruppe wesentlich niedriger als die SOD-Werte in der ALA-Gruppe (p < 0,05). Allerdings unterschieden sich die SOD-Werte im Magen und Dickdarm der Tiere in den Gruppen „Mukositis“ und „Mukositis plus ALA“ erheblich (p < 0,05–0,0001).

3.4. Die ALA-Behandlung erhöht die Spiegel von Gewebe-MMPs und TIMP-1

Die MMP{{0}}-, MMP-2-, MMP-8- und TIMP{3}}-Aktivitäten (Tabelle 2) in Serum, Magen, Dünndarm und Dickdarm waren signifikant höher in der Mukositis-Gruppe im Vergleich zur Kontroll- und ALA-Gruppe (p < 0.05–0.0001). Der Anstieg der MMP-1-, MMP-2-, MMP-8- und TIMP{12}}-Spiegel in den Seren und im Magen, Dünndarm und Dickdarm von Mucositis-Ratten wurde signifikant unterdrückt Mukositis plus ALA-Ratten (p < 0,05–0,0001), obwohl es keinen signifikanten Unterschied in den Serum-MMP-8-Spiegeln zwischen den Gruppen Mukositis plus ALA und Mukositis gab.